ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/アスペルギルス Pathosystem

この研究の全体的な目標は、信頼性が高く、正確で、安価で、迅速な方法を提供することです RNAiを介したサイレンシングの有効性をテストするための RNAiを介したアスペルギルス合成遺伝子 アスペルギルス菌の遺伝子 最小限の種子を使用して、最小限の種子を使用して、通常、サンプル中のアフラトキシンを効果的に定量するには数百グラムの種子が必要です。この技術の主な利点は、それがアフラトキシン陽性のアスペルギルスフラバスフラバスNR RL 3 3 5 7の培養をセットアップし、種子を準備する10日前に特定の治療をテストするために5つの種子未満を使用することですZAP Pexオーガー培地で。この文化を摂氏25度で育てます。

種子接種に使用します。テキストプロトコールに詳述されているRNAIを発現するトランスジェニック植物を調製した後、それらの種子の収穫に進みます。まず、低に設定された高圧洗浄機からの摩耗を使用してペリックコイを取り除くか、手でペリックコイをこすり落とします。

ペリコイを取り除いたら、成熟ボード上のポッドを適切なグループに配置して、メソコイの色を特定します。次に、穴を取り外し、黄色と茶色の種子を別々に処理します。実験に必要なシードの数を少なくとも 3 個、つまり、サンプリングするピーナッツ ラインごとに 3 つのコ リードインの半分が必要であることを計算します。

滅菌ビーカーの底を種子の層で覆い、次に種子を75%エタノールの測定量で覆います。次に、そのボリュームを2倍にします。種子を溶液中で30秒間インキュベートし、滅菌した蒸留水で洗い流します。

次に、Fエタノールの場合と同様に、種子を2%次亜塩素酸塩の容量で処理します。このインキュベーションを5分間進めます。次に、5倍の容量の滅菌蒸留水で3回のすすぎを使用します。

次亜塩素酸塩を除去するには、このステップですべての次亜塩素酸塩溶液を洗い流すことが重要です。種子は現在、表面滅菌されています。次に、滅菌した種子を滅菌した種子を滅菌したペトリ皿に置くために準備した滅菌蒸留水に2時間浸すことにより、種子を水和させます。

この時点で、すべての材料を滅菌する必要があります。鉗子を使用して種皮を取り除き、コハインを分離します。最後に、メスで胚を取り出します。

胚は廃棄することも、新しい植物を再生するために使用することもできます。次に、メスでオレインを半分に切り、半分と滅菌した蒸留水を接種の準備ができるまで沈めます。次に、半分のコレジンから余分な水分を滅菌ペーパータオルで吸い取り、シードピースをシードサイズのディボットが付いた別々の1.5%オーガープレートに置き、カット面を上にしてシードをそれらに押し込み、コレジンの半分に接種します。

切断面にマイクロリットル懸濁液あたり10, 000個のアスペルギルス胞子の2マイクロリットルを追加します。サスペンションがシードハーフの側面を流れ落ちないようにしてください。最後に、皿を摂氏30度の暗いインキュベーターに1〜4日間置き、テストします。

1日後、2日後、3日後または4日後に、必要に応じてランダムに選択された接種された半分を種子を穏やかに取り除きます。ティッシュを使用して余分な胞子とオーガーを拭き取り、サンプルをガラス製スクリューキャップバイアルに入れます。接種していないサンプルを2ミリリットルのチューブに移し、R-T-P-C-R分析を行います。

液体窒素中の無料サンプルは、凍結サンプルが処理されるまで冷凍庫に保管します。アフラトキシン分析のために、必要に応じて、接種したハーフコットのレジンを4ミリリットルのガラス製スクリューキャップバイアルに入れます。サンプルは、摂氏マイナス80度で何ヶ月も安定しています。

種子が室温になったら、4容量のメタノールを加えてサンプルを抽出し、チューブを攪拌せずに室温で暗所で一晩インキュベートします。翌日、まずUPLCを実施し、1.5 mLのプロピレンミニカラムとそれに対応するフリットを調製します。次に、200ミリグラムの酸化アルミニウムを追加します。

次に、別のフリットを挿入します。次の位置、A-U-P-L-Cオートサンプラーバイアルをミニカラムの下と接触させて、蒸発を最小限に抑えます。次に、サンプルから0.5ミリリットルのメタノール抽出物を使い捨てガラス2つプラスチックではなく追加します。

次に、0.5ミリリットルのアセトニトリルをチューブに加え、溶液をピペットで混合します。次に、準備したミニカラムに0.5ミリリットルの混合物を適用し、重力のみを使用してEITを収集します。EITが回収されたら、UPLCで使用するために、回収バイアルに浄化槽キャップを迅速に取り付けます。

バイアルを、移動相の水メタノールおよびアセドナイト試験で調製済みのA-U-P-L-Cに入れます。次に、EITSのアフラトキシン含有量を定量化します。詳細については、テキストプロトコールとUPLC分析をご覧ください。

抽出に使用するシードピースを個々のガラスバイアルにセットします。次に、バイアルを一晩凍結乾燥し、朝に組織サンプルの乾燥重量を測定して、アフラトキシン濃度をサンプル1グラムあたりのナノグラムで表すことができます。次に、サンプルを冷凍庫から取り出し、トリオールを加え、ビーズミルホモジナイザーで凍結組織を3,100RPMで40秒間粉砕し、RNA抽出に進みますフラビスからの5つのアフラトキシン合成遺伝子の小さな断片を運ぶRNAIベクターを使用して、ピーナッツ植物を形質転換しました。

同定番号は、記載されているように、7つのPCR陽性系統をクローニングし、試験した99の再生されたTRANSFORMANTSからの広範な研究所のゲノムアノテーション番号に対応しています。7つすべてが、対照線と比較して60〜100%少ないアフラトキシン蓄積を示しました。7つのラインのうち2つのラインの結果が表示されます。

これら2つのRN AIラインは、NPTの2つの選択可能なマーカーの存在を示しました。S-T-N-P-C-Rの結果によると、使用されたネガティブコントロールは、アフラトキシン陽性の新たに収穫されたケディアのアフラトキシンに抵抗するRNAiラインの能力をテストするための形質転換プロセスを経たPCRネガティブラインでした。フラビスラインNRRL 3 3 5 7を、胚および精巣を欠くハーフコットのリードインに最大96時間インキュベーションした後に適用しました。

接種した組織は、UPLCを使用して処理し、記載されているようにアフラトキシンレベルを測定しました。これらの結果は、液体クロマトグラフィー質量分析によってさらに確認されました。全体として、RNAi 2 88 72は、対照群と比較して、アフラトキシンB 2が94〜100%減少し、アフラトキシンBが90〜100%減少したことを示しました。

一方、RNAi 2 88 74は、両方のアフラトキシンで60〜100%の減少を示しました。この手順に続いて、同じ種子抽出物を使用して植物Xinを分析し、真菌の侵入に対する種子の応答をよりよく理解することができます。この方法は、マイコトキシンを制御するためのRNAI技術の開発を支援する独自のツールも提供します。