Name: ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/アスペルギルス Pathosystem (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶRNAiによるピーナッツのアフラトキシン制御法。Aspergillus flavusを用いた少種子・高効率なマイコトキシン定量技術で、食品安全性向上に貢献します。

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この作業は、USDA-ARS CRISプロジェクト6604-21000-004-00D、CRISプロジェクト6604-42000-008-00D、およびUSAIDの未来フィードプログラム契約番号58-0210-3-012の財政的支援を受けました。 技術協力をしてくれたValerie Orner氏、LaTanya Johnson氏、Joseph Powell氏、Kathy Gray氏に感謝します。 この記事での商号または商品への言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、米国農務省による推奨または承認を意味するものではありません。

著者には開示するものや利益相反は何もありません。

真菌病原体における遺伝子の植物宿主のRNAi媒介サイレンシングは、27,43を実証されている、しかし、植物中のマイコトキシン蓄積のRNAi仲介制御の実現可能性を示す何の出版物はありません。葉は地下ポッドの真菌感染時には症状を示さないようピーナッツにおけるこれらの研究のための一つの制限要因は、個々の植物における無アフラトキシン蓄積表現型を評価する方法がないことでした。また、アフラトキシンのない正規分布の蓄積、および化学分析15,16のための大規模なサンプルの必要性は単一の植物の潜在的なRNAi効果の定量化を妨げています。ここで紹介する方法は三通り3 24時間間隔サンプリング（ 表1、 図7）を実行するために5種を使用して、72時間の実験で構成されています。種子の劣らず100 g以上を必要とする典型的なアフラトキシン分析と比較して、私たちの方法はindividuaに特に適しています最初に2つ以下または3ポッドを生産ピーナッツ植物のLトランスジェニックイベント。 アフラトキシン合成のRNA媒介サイレンシングは、遺伝的にアスペルギルス・フラバス と A. を形質転換することにより実証されていますparasiticus。 aflRは Aのアフラトキシン生産の主要な調節因子であるので、 フラバス と A. parasiticus 44,45、それは植物におけるRNA媒介サイレンシングのための興味深い対象となります。しかし、aflRにおける遺伝的変異は、 アスペルギルス種 46の間で示されており、植物宿主で生産するRNAi信号と一致する完全なシーケンスが存在しない場合には、これらの遺伝的変異は、サイレンシングから逃れることができました。したがって、aflRは、ベクトル p5XCAPDにサイレンシングのための目標の一つでしたが、一つだけではありませんでした。 A.に導入aflR遺伝子の逆方向反復フラバス と A.変換によるparasiticusはサイレンシングし、最小限または全くない製品が得られましたアフラトキシン47のイオン（マクドナルドら 、2005B）。また、サイレンシングAFLD遺伝子は、Aに 98％までによってアフラトキシン生産を防止しましたフラバス と A.直接変換48でparasiticus。我々のシステムの成功の確率を高めるために、ピーナッツはAにアフラトキシン産生に関与する5つの遺伝子の逆方向反復断片で形質転換しましたフラバス 。ここでは、アフラトキシン合成経路においていくつかの遺伝子をサイレンシングするためのターゲット、アフラトキシンB 1の90％-100％低いレベルおよびB 2は、ライン 288から72に達成されたことをp5XCAPDを使用して、とに蓄積された百分の60から100まで低いレベルことが示されています半子葉がAで接種した対照と比較してライン288から74、 フラバスは 、7,4を図 。最も重要なのは、この方法は、ライン288から72によってアフラトキシンの蓄積に統計的に有意な差異を検出した288から74 対パラメトリックSTATISを適用することにより、実験を通して制御チック、 図7。小さなサンプルサイズを考えると、それは、これらの実験は、高解像度、より高い性能と比べて3倍の感度を5倍を有しUPLCで分析したアフラトキシンを検出するための強力な方法を使用する必要性を強調することが重要ですHPLC 49。 RNAiの発現は、インサート288から74にのみ24時間のインキュベーションでの未熟子葉（黄色）で検出されました。 RNAiのインサートは、図6、48時間で24時間で288から74の成熟子葉に、または任意の満期のグループにRT-PCRによって検出されなかった。これと同じ現象は他のRNAiトランスジェニックピーナッツ株において観察された（アリアス、RS、2015未発表）、通常のRNAi転写物はわずか24時間で未熟子葉上で検出された場所。 RNAサンプルは、データは、アクチンの発現レベルに対して標準化し、DNAの混入の証拠は観察されなかった、cDNA合成の前にDNアーゼで処理しました。 DNAが試料中に存在していたならば、それはすべき同様に48時間のサンプルで検出されたが、一貫して、それはそうではありませんでしたされています。 35Sプロモーターの制御下の発現は必ずしも一様ではありません。それは、環境条件50、組織や発達段階51,52の種類によって影響を受けることができます。同時に、RNA干渉の経路では、mRNAの崩壊速度およびsiRNAの減衰率が大きく53を変化させることができます 。これは、RNA干渉の機構によるmRNAの急速な分解は、48時間のインキュベーションでのmRNAの検出を妨げている可能性があります。 48時間での発現の欠如が低い35Sプロモーター駆動の転写によるものであったかどうか、またはダイサーによりdsRNAの速い劣化に答えられることを残ります。このように、ハイスループットシークエンシングによって、小さなRNAの検出は、RNAi 54を介して行われているプロセスのより深い洞察を与えるだろう これらの実験です。しかし、RNAサイレンシングは、主にphotosyntから師部を通って、全身に広がるので、（この場合はピーナッツ種子中）ショ糖シンク55にソースを嫌い、アフラトキシン合成のサイレンシングは、RNAiインサートの局所発現せずに種子に発生する可能性があります。多くの研究は、種子中のアフラトキシンの蓄積を防止するために必要な小さな干渉RNA（siRNA）の閾値レベルを決定するために行われていません。これは、RNAiの両方のmRNAの発現は（ 図6）を構成するという事実を強調することが重要であり、アフラトキシンB 1及びB 2（ 図7）の蓄積は、 対未成熟（黄色）に対して異なる結果を示しました。成熟した（茶色）子葉。ピーナッツ植物はつまり、彼らは収穫満期ポッドの範囲、 図2に提示し、不確定な成長を持っている。また、異なる満期グループからの種子は、その化学組成が異なる例えば 、2.4％の未熟種子中のショ糖、および1.9％で同じフィールド条件56,57の下で成熟した種子。したがって、実際のefficiencを理解しますアフラトキシン蓄積のRNA媒介性制御のyは、別途成熟グループを分析することが重要です。 ピーナッツ種子の自然な防衛は種子や環境条件58-61の成熟度に応じて製造された化合物およびそれらの相対的な量の多様性に変化ファイトアレキシンの生産、であり、子葉62に比べて胚において特に高いです。胚はまた、子葉（アリアスRS、未発表）よりもDNAとRNAの両方を、核酸の有意に高い濃度を有します。ピーナッツ種子が成熟するにつれ、その生理学および化学組成の変化が63を発生します。静真菌活性を64とピーナッツ種皮フォーム縮合型タンニンでフェノール系酸化防止剤;タンニンとフェノール化合物のその含有量は、満期65が増加するにつれて、これは、また、35黒黄色成熟段階を反映中果皮の色が明らかです。トンのこのように、存在その抗菌性所与の実験でESTAまたは胚は、制限された真菌の成長を持っているので、のRNAiサイレンシングの効果を過大評価ができ、従って、これらを除去しました。また、種皮および胚の除去は、胚がよりファイトアレキシンとより多くのRNA含量を持つことになります運ぶ半分子葉として、分析のばらつきの原因を制限することができます。 これらの実験における成熟グループと種皮と胚芽を除去することによって分析に加えて、さらにいくつかの観測を指摘することは重要である。結果は最大96時間のインキュベーションのために示されているもののA）は、72以下で使用しないことが推奨されます種子は96時間によって分解を受けるように、一貫性のある結果を得るための時間。およびb）同じシードから半子葉は、ランダムにサンプリングされたものの、完全に独立したサンプルを構成しないのに対し、RT-PCRおよびトランスジェニック事象の中アフラトキシンの蓄積が種子の間の最小変動を示しました。また、正確な真菌の胞子数、接種量2μLのS、および側面に滴下を回避子葉の切断面上の胞子のアプリケーションは、発芽胞子を植物組織にさらされていることを確認してくださいすることが重要です。 図4（下）の最後のフレームに示すように、プレート上に水/寒天を1.5％（w / v）のにする必要があり、より柔らかい寒天は胞子の流出が発生します。制限され、特定のトランスジェニック事象から可用性をシードする必要があり、サンプリングではなく、同様の結果（ すなわち 、 図7）を得た三連の複製で行うことができます。しかし、三連のサンプルは、標準誤差を減らすのに役立ちます。この方法の唯一の制限は、それがアフラトキシン検出/定量化のための高感度システム（UPLC）が必要なことであるが、同時にこれはあまり高感度な方法によってアフラトキシン検出されてはならないRNAiの効果を過大評価の可能性を低減します。 結論として、この方法は、初めて勉強する信頼性の高いアプローチを提供していますアフラトキシンの制御におけるRNAiの効果。一週間以内に全体の作付けシーズンから実験のための時間を削減する、この方法は、途方もなく緩和および/ ​​またはアフラトキシンの排除に向けたRNAi-ピーナッツ/ アスペルギルス pathosystemの研究を加速していきます。

約4.5億人が慢性的にアフラトキシン1、自然2で知られている最も強力な発がん物質にさらされています。これらのマイコトキシンは、トウモロコシ、キャッサバ、米、ナッツ、穀物やスパイスなど世界3に食用作物の25％を汚染する。4。子供5で発育阻害原因アフラトキシン、免疫系6を損ない 、人間の生検7,8における肝細胞癌-の58％に存在し、アフラトキシン中毒症9,10の定期的な大流行時に数百人を殺します。アフラトキシンは、通常、 アスペルギルス・ フラバス と A.によって生成ポリケチド由来のマイコトキシンですparasiticus;アフラトキシンB 1及びB 2は、A によって製造されていますA.一方フラバス 、 parasiticusも 、G 1およびG 2が生成されます。これらの化合物の化学構造およびUPLCによりそれらの分離を示すクロマトグラムを図1に示します。 </strオング&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> 図1. アフラトキシンおよびRNAi トップを 挿入します。化学構造（左）とクロマトグラムの例（右）4つの最も一般的なポリケチド由来のアフラトキシンの： アスペルギルス parasiticusにより産生され、B 1、B 2、G 1、G 2を 、 。。 フラバスは、B 1およびB 2が生成 下：RNAiの中の遺伝子断片の概略はp5XCAPDはピーナッツ変換に使用される構築、矢印の下の数字は、 アスペルギルス・フラバス のゲノム中の遺伝子断片アクセッション番号です。 PIV2：ジャガイモのイントロン。 BP：塩基対; RT_5X_1とRT_5X_2：リアルタイムPCRのプライマー部位は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4 NGに基づいて算出した場合ピーナッツ中のアフラトキシンによる輸出の経済的損失だけでは$ 450万ドルを超えています。欧州連合（EU）11で人間の消費のために許可されたアフラトキシンのグラム-1限界。アフラトキシンは、60年12知られています。しかし、多くの農業は他の真菌株13,14の適用を含め、それらの影響を軽減するために開発されたものの、制御の一貫した方法が存在せず、耐性植物品種は使用できません。でも、病原体の侵入のための助けとなる条件下で、マイコトキシン蓄積が予測不可能であり、正規分布に従わないため、アフラトキシンに対する抵抗性試験植物遺伝資源は、特に困難です。このように、実験は通常、種子や100-1,700グラムの複数のサンプルの何百ものデータ15,16のばらつきを低減するために、大規模な植林面積を必要とします。 RNA干渉がありました1998年17で発見されました。そして、「サイレンシング」の利点は、現在、新しいアプリケーションの数で 、例えば、探索されている。、転移性乳癌18、肝臓癌19、骨髄性白血病20、および昆虫21と線虫22に対して植物保護におけるに対するヒトの治療に。植物では、RNA干渉信号も植物宿主25に密着している真菌病原体の内部に、23,24サイレンシング全身転写後遺伝子を担当する低分子干渉RNA（siRNA）および高分子量RNAを、細胞に細胞を移動することができます。レタス26における真菌病原体の遺伝子の植物媒介サイレンシングのRNAiの有効性植物の地上部における症状のこれらの、目視検査（葉）は、疾患の定量化を可能にするために、いくつかの植物pathosystemsに記載されている、 すなわち 、卵菌類Bremia小麦で、 プクキニア <suバナナ28のp&gt; 27とフザリウム 。はるかに難しいが、葉は、（種子）侵略器官は土壌の数インチ下にある感染症の症状を示さないようピーナッツの工場でマイコトキシン、特にアフラトキシンを制御するためのRNAi効果を評価することであり、感染症の発生は予測できない、唯一の化学物質であります分析では、アフラトキシンの存在を決定することができます。また、ピーナッツの各トランスジェニックイベントは、通常、数種子（植物当たり4-6）を生成し;そのため、大規模なフィールドプロットで無アフラトキシン蓄積特性、全体の作付季節を持続し、種子の数百を使用するための伝統的なテストは現実的ではありません。この方法は、わずか数種を使用して、一週間以内で、RNAiのピーナッツ種子導入遺伝子の存在について、および無アフラトキシン蓄積形質について分析するために、ここで説明されています。

<table><tbody><tr><td>プライマー、オリゴヌクレオチドDNA</td><td>テクノロジー、アイオワ州コーラルビル、米国</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>dneasyプラントミニキット</td><td>Qiagen、バレンシア、CA</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>Czapek Dox寒天培地</td><td>オキソイド、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td><td>州CM0095</td><td></td></tr>寒天サーモ<tr><td></td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td><td>州BP 1423</td><td></td></tr>冷凍<tr><td>庫-80&nbsp;&deg;C</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>酸化アルミニウム、Al2O3</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941</td><td></td></tr><tr><td>SPE リザーバー 1.5 ml</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>210011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml SPE リザーバー用フリット</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>211401</td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラーバイアル</td><td>Waters Corporation、マサチューセッツ州ミルフォード</td><td></td><td></td>186005221</tr><tr><td>Waters Acquity 超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)装置。UPLC-H-Class クオータナリーソルベントマネージャー。UPLCサンプルマネージャー;UPLC蛍光検出器(FLR);UPLC BEH C18 2.1&nbsp;mm×50°Cmm, 1.7&nbsp;mm カラム</td><td>Waters Corporation、マサチューセッツ</td><td></td><td></td>州ミルフォード</tr><tr><td>Finnigan LCQ Advantage MAX イオントラップ質量分析計、Xcalibur バージョン 1.4 ソフトウェア</td><td>Thermo Electron Corp.、カリフォルニア州</td><td></td><td></td>サンノゼ</tr>の<tr><td>アフラトキシン標準、B1、B2、G1 および G2</td><td>Sigma-Aldrich、 ミズーリ州セントルイス</td><td>A6636;A9887;A0138;A0263</td><td></td></tr><tr><td>Systat Software 12.2</td><td>SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen, CA</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11752-050</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 Real-Time PCR</td><td>Lifetechnologies, Grand Island, NY</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth-Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>R453642</td><td></td></tr><tr><td>pENTR1A</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A10462</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1919</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube ロボットワークステーション</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質:カナマイシン、セフォタキシム、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン</td><td>Goldbio, St. Louis, MO</td><td>cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11304-029</td><td></td></tr></tbody></table>

ピーナッツにおけるアフラトキシンのrnai仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/<em&gt;アスペルギルス</em&gt; pathosystem

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

国連食糧農業機関は、世界の食糧作物の25％がアフラトキシンに汚染されていると推定しています。それは毎年の非ヒトの消費に破壊されたり流用されている食品の億トンを表します。アフラトキシンは、通常、穀類、ナッツ、根菜類や他の農産物におけるカビアスペルギルス・ フラバス と A. parasiticusにより蓄積された強力な発癌物質です。ピーナッツ植物におけるRNA干渉（RNAi）による5アフラトキシン合成遺伝子のサイレンシングは 、Aを接種した後アフラトキシンの蓄積を制御するために使用されましたフラバス 。以前は、何の方法は、これらは通常、いくつかの種子を生産するように、個々のピーナッツトランスジェニック事象においてRNAiの有効性を分析するために存在しなかった、とアフラトキシン導く条件下で大規模なフィールド実験の伝統的な方法は、オプションではありませんでした。フィールドに、自然に汚染種を発見する確率は1/1にしばしば1/100また000は、アフラトキシン汚染が均一に分布されていません。我々の方法は、リアルタイムPCR（RT-PCR）のために処理小片または小RNAシークエンシングを用いて、トランスジェニック事象当たり数種を使用し、超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）によってアフラトキシン蓄積の分析のために。 RNAiの発現ピーナッツライン288から72と288から74には、14,000 NGまで蓄積し、対照と比較してアフラトキシンB 1が100％削減（p≤0.01）とB 2に現れた。グラム-1アフラトキシンB 1のアフラトキシン生産A.を接種フラバス 。参考までに、米国では、人間の消費の許容アフラトキシンの最大合計は、20 ngのです。G -1。このプロトコルは、トランスジェニックピーナッツの種子とその評価方法におけるアフラトキシンのRNAi仲介制御の適用を説明しています。私たちは、ピーナッツや他の作物の育種への応用は、科学のこの重要な分野で急速な進歩をもたらすと考えています、医学、ヒトの栄養は、大幅主要食用作物​​でアフラトキシン、および潜在的に他のマイコトキシンを制御するために、国際的な取り組みに貢献していきます。

プラスミドp5XCAPDはpCAPD 29の誘導体としてなされたものであり、ピーナッツ植物を形質転換するためにそれを使用しました。このベクターは、Aのアフラトキシン合成遺伝子の5小さな断片の逆方向反復、70〜80塩基対のそれぞれを、運びますイントロン（ 図1）によって分離フラバス 。 AFL2G_07224（aflR）、AFL2G_07223（AFLSまたはaflJ）、AFL2G_05027（アフラトキシン排出ポンプ、aflep）、AFL2G_07228（AFLC / pksA / pksL1）、およびAFL2G_07731（PES1）は構造物に使用された、 図1相当の数のフラグメントに。 BROAD研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、および文献42でフラバスのゲノムアノテーション。 99ピーナッツ行の合計は、変換プロセスを経て再生させた、50は、PCRは、STN-PCRによって検出NPTII陽性であった、と33行がPCR陽性と生産種子でした。のみ7 PCR陽性ラインがクローン増殖とPRESENによって試験しましたアフラトキシンの蓄積のためのT法は、すべての7の間には、コントロールよりも60％と100％未満アフラトキシンの蓄積を示しました。ここでは、それらの7行の2の結果を示します。個々のトランスジェニック事象は、通常、いくつかの種子を生産するように、この方法は、依然としてパラメトリック統計解析を行うことができながら、種子数の最小値を使用するために開発されました。試料調製および実験のフローチャートを図5 及び表1に示されている。トランスジェニック種子の最初の世代は、典型的には、ヘミ接合であるが、それが細胞の細胞及び低分子干渉RNA（siRNA）の全身の動きが発生することを期待されていますRNA干渉を介してプラント全体のアフラトキシン合成サイレンシングを与える必要があります。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> 方法の概略 図5 のフローチャートは、サイレンシングにおいてRNAiの有効性を分析します </strong&gt; ピーナッツ種子における アスペルギルス アフラトキシン合成遺伝子 。ワークフローのグラフィック表現遺伝子発現またはアフラトキシン分析のためのピーナッツサンプルを処理する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> RNAiのピーナッツライン288から72と288から74ゲル部分は、図6（上）に示されているSTN-PCRによって試験したとき、NPTII選択可能メーカーの存在を示した、オリジナルの画像は、要求に応じて作成者から入手できます。それは二つの遺伝子には、cmr（クロラムフェニコール耐性）および植物に未知の効果のCCDB（毒素）の逆方向反復をコードしているので、プラスミドpCAPDは、形質転換のコントロールとして使用されませんでした。 PCRネガティブピーナッツライン288から9と再生プロセスを経て、RNAiのラインと同じ条件で増殖させた他は、負の詐欺として使用しましたトロール。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> トランスジェニックの 図6. 検出とRNAiのリアルタイム表現挿入 トップ ：シングルチューブ、トランスジェニックピーナッツラインのRNAi-288から72およびRNAi-288から74のネストされたPCR検出、陽性植物。コントロール：W（水）、PP（正の植物）、MM（マスターミックス）、P（プラスミドp5XCAPD）。画分を1/2〜1/4〜1/8 1/16 DNAの2倍希釈を表す下 ：（未熟で、 図1のようRT_5X_1、RT_5X_2：RNAiの発現のリアルタイムPCR検出は、（プライマーセットを挿入しますイエロー）、24および48時間のインキュベーションでのトランスジェニック系統の（茶色）子葉を成熟;灰色の線：C T = 1ヒストグラムが3生物学的サンプルの平均および標準誤差バー（T）を表します3つの技術の反復で。 RNAiのインサートの相対的な定量化は、内部統制と5.2.2と5.3で説明したように計算された導入遺伝子の比較倍式としてハウスキーピング遺伝子アクチンに関して標準化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> アフラトキシン蓄積の植物宿主のRNAi媒介電位制御の有効性を試験するために、 アスペルギルス・ フラバス NRRL 3357の新たに採取した分生子は、胚および種皮を除去した半子葉の切断面に塗布した（ 図3、図4）。ゲノムが配列決定され、p5XCAPDを設計するための基礎となったされたA. フラバスの NRRL 3357は、親切にUSDA-ARS-NPRL博士ホーンにより提供されました。 30℃で24、48および72時間後の半子葉の結果として真菌の侵入はショーです<html> nは、図4に。接種半子葉のサンプルは、72、48、24で収集したインキュベーションの96時間、およびLC-MSによって主4アフラトキシンB 1、B 2、G 1及びG 2 UPLCを使用するために分析し、確認されました; 結果を図6に示す 。アフラトキシン濃度は変更36で公開された方法を用いて決定しました。 96時間のインキュベーションでは、子葉が原因真菌感染症の崩壊を開始します。 RNAiのライン288から72には、未熟子葉内のすべてのサンプリング日における成熟したものの中で最もサンプリング日における対照よりもアフラトキシンの有意に低いレベルを示しました。 RNAiのライン288から74には、ほとんどのサンプリング日のアフラトキシンの有意に低いレベルを示しました。 Tukeyの検定の有意のレベルは、図7のグラフにアスタリスクで示されています。 <html> g7.jpg &quot;/&gt; アスペルギルス・フラバス とのインキュベーション（24、48、72および96時間）の後半分ピーナッツ子葉図 7. アフラトキシンB 1 およびB 2コントロール：。288から9非トランスジェニックラインの種子; RNAi：RNAiを288から72およびRNAi-288から74、RNAiのp5XCAPDためのトランスジェニックからの種子は5アフラトキシン合成遺伝子を沈黙させます。 （A）成熟種子中のアフラトキシンB 1（ブラウン）。 （B）アフラトキシンB 2成熟種子。未熟種子中の（C）未熟種子中のアフラトキシンB 1（黄色）と（D）アフラトキシンB 2。重複した生物学的サンプルの対応する標準エラーバー（T）との平均値を表しています。統計的に有意な差Tukeyの検定*：0.05≤P、**：P≤0.01、***：P≤0.001。S：//www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 全体的に、RNAiを288から72には、コントロールと比較した実験（24〜96時間のインキュベーション）、アフラトキシンB 2の 94％-100％の減少、及びアフラトキシンB 1が90％-100％の減少を通じて示しました。 RNAiを288から74には、アフラトキシンB 1、 図7のアフラトキシンB 2、60％-100％の減少で63％-100％の減少を示しました。 RNAiの挿入物の発現のリアルタイムPCR検出のために使用したプライマーは、図1に示されている。ピーナッツ種子の子葉は、それらの自然の防御を除去し、最もにさらされる領域にRNAiの潜在的影響を検出することができるように、胚ずに分析しました真菌の侵入、子葉。挿入RT_5X_1をプライマーセットによってライン288から74の未熟子葉（黄色）で検出されたRNAiの発現は、C Tの上に4倍でした</sUB&gt; = 1ネガティブコントロールのしきい値、およびRT_5X_2をプライマーセットによっては、すべての24時間のインキュベーションで、しきい値を超えて19倍でした。ピーナッツ変換に使用される5つの連続した遺伝子断片のうち、少なくとも3、5027、7223および7228（それぞれaflep、AFLS / aflJ、及びAFLC / pksAは、）、RT-PCR（ 図1,6）によって検出しました。 RNAiのインサートの発現は24時間で、または48時間のインキュベーション、 図6（下）での成熟または未熟子葉の成熟した子葉では検出されませんでした。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> ピーナッツライン </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> サンプリングの時間 </td><td colspan="3" style="width:192px;"> RT-PCR用のサンプル </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> アフラトキシン分析用サンプル（接種） </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> N種子のアンバー</td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> （非接種） </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;">担当者1 </td><td style="width:64px;">担当者2 </td><td style="width:64px;">担当者3 </td><td style="width:64px;">担当者1 </td><td style="width:64px;">担当者2 </td><td style="width:64px;">担当者3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAiの（黄色） </td><td style="width:64px;"> 24時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdスタイル= &quot;幅：64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;">制御</td><td style="width:64px;"> 24時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> （黄） </td><td style="width:64px;"> 48時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> 表2。 小サンプルのセットアップの例は、RNAiピーナッツ種子における遺伝子発現とアフラトキシンの蓄積を分析した。完全な発現の解析と1満期グループのアフラトキシンを（ すなわち、黄色）、3サンプリング時間（24、48および72時間）で、三連で、4.5種子を必要とする、テーブル内の各ナンバーワンは半分子葉を表します。

我々は、真菌アスペルギルス・ フラバスでアフラトキシン合成遺伝子をサイレンシングするためのRNA干渉信号を含むピーナッツ種子でアフラトキシン及び導入遺伝子発現の分析のための方法を実証します。植物におけるマイコトキシンのRNAi媒介性制御は、以前に報告されていません。

ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/<em&gt;アスペルギルス</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

この研究の全体的な目標は、信頼性が高く、正確で、安価で、迅速な方法を提供することです RNAiを介したサイレンシングの有効性をテストするための RNAiを介したアスペルギルス合成遺伝子 アスペルギルス菌の遺伝子 最小限の種子を使用して、最小限の種子を使用して、通常、サンプル中のアフラトキシンを効果的に定量するには数百グラムの種子が必要です。この技術の主な利点は、それがアフラトキシン陽性のアスペルギルスフラバスフラバスNR RL 3 3 5 7の培養をセットアップし、種子を準備する10日前に特定の治療をテストするために5つの種子未満を使用することですZAP Pexオーガー培地で。この文化を摂氏25度で育てます。種子接種に使用します。テキストプロトコールに詳述されているRNAIを発現するトランスジェニック植物を調製した後、それらの種子の収穫に進みます。まず、低に設定された高圧洗浄機からの摩耗を使用してペリックコイを取り除くか、手でペリックコイをこすり落とします。ペリコイを取り除いたら、成熟ボード上のポッドを適切なグループに配置して、メソコイの色を特定します。次に、穴を取り外し、黄色と茶色の種子を別々に処理します。実験に必要なシードの数を少なくとも 3 個、つまり、サンプリングするピーナッツ ラインごとに 3 つのコ リードインの半分が必要であることを計算します。滅菌ビーカーの底を種子の層で覆い、次に種子を75%エタノールの測定量で覆います。次に、そのボリュームを2倍にします。種子を溶液中で30秒間インキュベートし、滅菌した蒸留水で洗い流します。次に、Fエタノールの場合と同様に、種子を2%次亜塩素酸塩の容量で処理します。このインキュベーションを5分間進めます。次に、5倍の容量の滅菌蒸留水で3回のすすぎを使用します。次亜塩素酸塩を除去するには、このステップですべての次亜塩素酸塩溶液を洗い流すことが重要です。種子は現在、表面滅菌されています。次に、滅菌した種子を滅菌した種子を滅菌したペトリ皿に置くために準備した滅菌蒸留水に2時間浸すことにより、種子を水和させます。この時点で、すべての材料を滅菌する必要があります。鉗子を使用して種皮を取り除き、コハインを分離します。最後に、メスで胚を取り出します。胚は廃棄することも、新しい植物を再生するために使用することもできます。次に、メスでオレインを半分に切り、半分と滅菌した蒸留水を接種の準備ができるまで沈めます。次に、半分のコレジンから余分な水分を滅菌ペーパータオルで吸い取り、シードピースをシードサイズのディボットが付いた別々の1.5%オーガープレートに置き、カット面を上にしてシードをそれらに押し込み、コレジンの半分に接種します。切断面にマイクロリットル懸濁液あたり10, 000個のアスペルギルス胞子の2マイクロリットルを追加します。サスペンションがシードハーフの側面を流れ落ちないようにしてください。最後に、皿を摂氏30度の暗いインキュベーターに1〜4日間置き、テストします。1日後、2日後、3日後または4日後に、必要に応じてランダムに選択された接種された半分を種子を穏やかに取り除きます。ティッシュを使用して余分な胞子とオーガーを拭き取り、サンプルをガラス製スクリューキャップバイアルに入れます。接種していないサンプルを2ミリリットルのチューブに移し、R-T-P-C-R分析を行います。液体窒素中の無料サンプルは、凍結サンプルが処理されるまで冷凍庫に保管します。アフラトキシン分析のために、必要に応じて、接種したハーフコットのレジンを4ミリリットルのガラス製スクリューキャップバイアルに入れます。サンプルは、摂氏マイナス80度で何ヶ月も安定しています。種子が室温になったら、4容量のメタノールを加えてサンプルを抽出し、チューブを攪拌せずに室温で暗所で一晩インキュベートします。翌日、まずUPLCを実施し、1.5 mLのプロピレンミニカラムとそれに対応するフリットを調製します。次に、200ミリグラムの酸化アルミニウムを追加します。次に、別のフリットを挿入します。次の位置、A-U-P-L-Cオートサンプラーバイアルをミニカラムの下と接触させて、蒸発を最小限に抑えます。次に、サンプルから0.5ミリリットルのメタノール抽出物を使い捨てガラス2つプラスチックではなく追加します。次に、0.5ミリリットルのアセトニトリルをチューブに加え、溶液をピペットで混合します。次に、準備したミニカラムに0.5ミリリットルの混合物を適用し、重力のみを使用してEITを収集します。EITが回収されたら、UPLCで使用するために、回収バイアルに浄化槽キャップを迅速に取り付けます。バイアルを、移動相の水メタノールおよびアセドナイト試験で調製済みのA-U-P-L-Cに入れます。次に、EITSのアフラトキシン含有量を定量化します。詳細については、テキストプロトコールとUPLC分析をご覧ください。抽出に使用するシードピースを個々のガラスバイアルにセットします。次に、バイアルを一晩凍結乾燥し、朝に組織サンプルの乾燥重量を測定して、アフラトキシン濃度をサンプル1グラムあたりのナノグラムで表すことができます。次に、サンプルを冷凍庫から取り出し、トリオールを加え、ビーズミルホモジナイザーで凍結組織を3,100RPMで40秒間粉砕し、RNA抽出に進みますフラビスからの5つのアフラトキシン合成遺伝子の小さな断片を運ぶRNAIベクターを使用して、ピーナッツ植物を形質転換しました。同定番号は、記載されているように、7つのPCR陽性系統をクローニングし、試験した99の再生されたTRANSFORMANTSからの広範な研究所のゲノムアノテーション番号に対応しています。7つすべてが、対照線と比較して60〜100%少ないアフラトキシン蓄積を示しました。7つのラインのうち2つのラインの結果が表示されます。これら2つのRN AIラインは、NPTの2つの選択可能なマーカーの存在を示しました。S-T-N-P-C-Rの結果によると、使用されたネガティブコントロールは、アフラトキシン陽性の新たに収穫されたケディアのアフラトキシンに抵抗するRNAiラインの能力をテストするための形質転換プロセスを経たPCRネガティブラインでした。フラビスラインNRRL 3 3 5 7を、胚および精巣を欠くハーフコットのリードインに最大96時間インキュベーションした後に適用しました。接種した組織は、UPLCを使用して処理し、記載されているようにアフラトキシンレベルを測定しました。これらの結果は、液体クロマトグラフィー質量分析によってさらに確認されました。全体として、RNAi 2 88 72は、対照群と比較して、アフラトキシンB 2が94〜100%減少し、アフラトキシンBが90〜100%減少したことを示しました。一方、RNAi 2 88 74は、両方のアフラトキシンで60〜100%の減少を示しました。この手順に続いて、同じ種子抽出物を使用して植物Xinを分析し、真菌の侵入に対する種子の応答をよりよく理解することができます。この方法は、マイコトキシンを制御するためのRNAI技術の開発を支援する独自のツールも提供します。

rnai-mediated-control-aflatoxins-peanut-method-to-analyze-mycotoxin

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コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

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