細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

この手順の全体的な目標は、ポリスチレンビーズと結合した純粋な組換え接着からなる生体模倣材料を作製し、それを使用して個々の細菌接着と宿主細胞受容体との間の生化学的および機能的相互作用を解剖することです。この方法は、宿主細胞のシグナル伝達への影響や病原体を介した細胞毒性の阻害の測定など、宿主病原体の相互作用の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、精製された接着物であるAEAが、バクテリアとサイズが似ているポリマー粒子に方向および共有結合して、バクテリアの表面表示を模倣することです。

私と一緒に手順を実演するのは、私たちの研究室のTU A-C-E-D-A博士課程の学生です。ここでは、タールアミンの方向性結合を実演します。このプロトコルは、シスチン含有タンパク質をアミン官能化ポリマービーズに結合するのに適しています。SULサクシニルを使用してpメリフェニル酪酸、またはSMPB架橋剤として、プロトコルテキストに記載されているように、使用直前に必要なすべての試薬を準備して、ビーズ活性化の手順を開始します。

ビーズ懸濁液を穏やかに反転させて混合し、必要な量のビーズ懸濁液を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移しました。1ミリリットルの滅菌PBS pH 7.0を入らせて、マイクロ遠心分離機でビーズとペレットを静かに上下に動かして洗浄します。巨大なピペットと傷跡でスナットを慎重に取り外します。

リースは、ビーズペレットを1ミリリットルの新鮮な滅菌PBSに懸濁し、洗浄ステップを繰り返します。ビーズペレットを再懸濁します。0.8ミリリットルのPBSに、新たに調製した10ミリモルSFO SMPBを200マイクロリットル加えます。

最終濃度を2ミリモルにするには、ビーズ懸濁液を回転ホイール上で摂氏25度で1時間インキュベートし、ビーズをインキュベートします。次のカップリングステップのためにタンパク質を調製し、活性化ビーズにすぐに追加できるようにします。タンパク質の濃度を確認し、カップリング反応に必要な最終濃度に調整します。6。

タンパク質とPBSのマイクロモルと1ミリリットルの容量は通常、タンパク質の還元に使用されます。TEPストック溶液を添加して、最終濃度を5ミリモルにします。溶液を30分間インキュベートします 室温で、初期タンパク質濃度を決定し、結合効率を計算するために、数マイクロリットルのタンパク質溶液を保持します。

タンパク質結合の手順は、活性化ビーズをペレット化し、ペレットを洗浄することから開始します。新鮮で滅菌したPBSの1ミリリットルに入ったら、調製したタンパク質溶液にペレットを再懸濁して、目的のタンパク質濃度にします。タンパク質ビーズ懸濁液を回転ホイール上で摂氏25度で2時間インキュベートします 2時間後、システィーナストック溶液を最終濃度50ミリモルまで加え、回転ホイール上で摂氏25度で30分間懸濁液にインキュベートすることにより、ビーズ上の残りの活性化基を不活性化します。

遠心分離によりビーズを保持した。タンパク質濃度の決定と結合効率の計算のためにスナットを保管してください。PBSおよびResusの曲がる1ミリリットルおよび新しいPBSの1ミリリットルと最終製品に最終製品を与えるために2回1ミリリットルのPBSおよびResusの曲がりと最終製品に与えるために150の、1ミリリットルの細胞の集中で1ミリリットルのヘラ細胞が付いている24ウェルの版の各井戸を150, 000細胞の集中で1ミリリットル1ミリリットル

これにより、実験を開始する前に、細胞が約80%coの流暢さに達することができます。5ミリリットルの海洋LB培養物にVパラ溶血性の新鮮なコロニーを接種し、振とうしながら摂氏30度で一晩成長させます。前に示したように、十分なビーズ結合多価接着分子を調製します。

コンペティションアッセイの日に、ウェルあたり10 x ビーズストック100マイクロリットル、または最終濃度500ナノモルタンパク質を考慮してください。細菌培養物のOD600を測定します。細菌培養物を無添加の無色のDMMに希釈して感染培地を調製します。

摂氏37度に予温し、10%のボリュームからボリュームビート懸濁液が含まれています。MOIを10にするには、ウェルごとに1ミリリットル、サンプルごとに10〜20%の余剰容量を準備します。古い培地をウェルから取り出し、培養物を洗います。

各ウェルに1ミリリットルの滅菌PBSを摂氏37度に予熱して加えて、細胞を修復します。PBSを取り外し、ウェルごとに1ミリリットルの感染培地を追加します。コントロールビーズとバクテリアを含む溶液をポジティブコントロールとして、接着ビーズとバクテリアを含まない溶液をネガティブとして追加します。コントロール。

0.1%TRITTON X 100を含むDMMを溶解コントロールとして追加します。コントロールを3倍にすることを含む各実験条件を設定します。プレートを組織培養インキュベーターで摂氏37度で所望の時間インキュベー

細胞毒性が評価されます。感染後4時間。24ウェルプレートで使用した各ウェルから200マイクロリットルを取り出し、新しい96ウェルプレートに移します。

96ウェルプレートを1, 500Gで5分間回転させ、各ウェルから100マイクロリットルを新しい96ウェルプレートに移します。感染実験で使用した培地100マイクロリットルを、ブランクとして使用する96ウェルプレートの3つのフレッシュウェルに加えます。LDH細胞毒性検出キットを使用し、製造元の指示に従って乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを実施します。

まず、必要な試薬の量を25個ずつ計算します。たとえば、100 個のサンプルの場合です。11.25ミリリットルの試薬Aと250マイクロリットルの試薬Bを混合し、泡立ちを避けるために渦巻かないようにします。

次に、混合物をリザーバーに入れます。次に、100マイクロリットルの試薬混合物を各サンプルに加え、プレートを室温で10分、20分、30分でインキュベートします。プレートリーダーで490ナノメートルの吸光度を読み取ります。

続いて、原稿に記載されているように細胞毒性の割合を計算し、細菌の付着の測定は感染の1時間後に行われます。細胞層から培地を取り出し、滅菌済みの温熱PBSで細胞層を十分に洗浄して、付着していない細胞を取り除きます。PBS中の無菌容量1%容量のTriton X 100溶液を各ウェルに1ミリリットル加えることにより、宿主細胞に溶解するたびに1ミリリットルのPBSで少なくとも3〜4回洗浄し、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。

各サンプルを数回ピペットで上下させてから、各ウェルの内容物をそれぞれ分離に移します。1.5ミリリットルのチューブ。サンプルの10倍連続希釈を滅菌PBSプレートに調製し、各サンプルの100マイクロリットルを海洋LB寒天上に広げ、セルスプレッダーを使用して、細菌株とこの実験セットアップの時点に応じてプレートに希釈する希釈を最適化します。

10倍から5倍、または10倍から6倍に希釈すると、適切な数のCFUが得られます。プレートを摂氏37度で翌日の夜に一晩インキュベートし、コロニーカウントにより細菌を列挙します。競合アッセイでは、ヒーラ細胞をVパラ溶血株に感染させました。

不良なものは、陽性と示されたか、異なる競合するエンティティの存在下で感染しなかった。不良ビーズによるin vitro感染は、MAM 7結合ビーズによって阻害された非常に高レベルの細胞溶解をもたらしましたが、MA'AM One結合ビーズまたはGST結合ビーズでは阻害されませんでした。未治療のHELOC細胞またはMAMとインキュベートされた細胞のいずれかに付着したv麻痺薬の列挙。

7つのMAM 1またはGSTコントロールビーズは、MAMを明らかにしました。7つのビーズがありますが、MAM1つまたはGSTコントロールビーズではありません。宿主細胞表面受容体への付着のためにvパラ溶血性を凌駕します。

フルオロに結合した接着。4つのラベルビーズは、宿主細胞への細菌の接着を模倣することができ、細胞イメージングのための強力なツールです。右側のチューブには、蛍光ブルーの生体模倣ビーズの懸濁液が含まれています。MAM。

7つの結合蛍光青色ビーズを使用して、上皮細胞へのMAM 7媒介付着のプロセスを特徴付けました。MAM 7を宿主細胞に付着させると、アクチンの再配列とストレスファイバーの形成が起こり、これらをRumine Phinを使用してfアクチンを染色するために共可視化されました。この手順に続いて、プロテオミクスやウェスタンブロットと組み合わせたアフィニティー精製などの他の方法を実行して、細菌付着の下流のシグナル伝達プロセスに関与している宿主細胞因子などの追加の質問に答えることができます。