レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

この一連の実験の全体的な目標は、比率メトリック蛍光顕微鏡を使用して生細胞のファコソームpHを測定することです。この方法は、病原体との相互作用における主要な分子の特定や、遺伝的混乱や薬物の食作用への影響など、食細胞生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、事実や分光法などの集団ベースの方法とは異なり、粒子結合移動の変化や個々のファゴソームの不均一性などの効果を検出できることです。

この技術の意味は、これらの微生物の多くがファゴソーム内の気晴らしを避けるためにフラゴソpHを変化させることができるため、病原性化学生物に対する私たちの治療法にまで及びます。この手順を開始するには、乾燥したXan20ミリグラムを滅菌PBSボルテックス10ミリリットルに加え、沸騰水浴中で10分間加熱します。その後、冷却し、2000Gで5分間遠心分離します。

その後、上清を取り除き、Xanを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。水浴で10分間超音波処理します。次いで、再懸濁したXanの500マイクロリットルを2本の1.5ミリリットルチューブに移し、それらを11, 000Gで5分間遠心分離する。

500マイクロリットルのPBSで洗浄を繰り返します。次に、XanをpH 9.3で新たに調製した0.1モル炭酸ナトリウム溶液の500マイクロリットルで2回洗浄し、最終洗浄後に490マイクロリットルの炭酸ナトリウム溶液に再懸濁します。続いて、DMSOに10ミリグラム/ミリリットルで溶解した10マイクロリットルのFZをXan渦に加えます。

ホイルで覆い、室温で4時間攪拌しながらインキュベートします 結合していない眼を取り除くには、まず0.5ミリリットルのDMSOと150マイクロリットルのPBSで洗浄します。次に、0.5ミリリットルのDMSOと300マイクロリットルのPBSで洗浄し、次に0.5ミリリットルのDMSOと450マイクロリットルのPBSで洗浄し、続いてPBSのみで洗浄します。その後、500マイクロリットルのPBSとボルテックスに1マイクロリットルのXanを追加します。

次に、10マイクロリットルの希釈したxma砂をヘモサイトメーターチャンバーの端にカバースリップと接触させ、20倍の対物レンズを備えた明視野顕微鏡にヘモサイトメーターを取り付けます。16個の正方形を含む左上隅に注目し、この領域内のすべてのクリスマス砂の粒子を数えます。ハンドタリーカウンターを使用して、右下隅で手順を繰り返します。

次に、この式を使用してXan濃度を計算します。次に、標識されたXanを過激な抗Xan抗体で1〜100希釈ボルテックスでオプソニン化し、サンプルを摂氏37度のウォーターバスで1時間インキュベートします。続いて、ヘモサイトメーターを使用してクリスマスサンドをカウントし、次に10の10倍に希釈して、ミリリットルあたり6番目の粒子にします。

マウスの初代好中球を単離した後、35ミリメートルのガラス底皿の中央に好中球の5分の10を2倍加えます。次に、50マイクロリットルの培地を加えて液滴を広げ、摂氏37度で5分間インキュベートして細胞を接着させます。その後、骨髄ペルオキシダーゼ阻害剤を含む37°Cに温めたHBSS1ミリリットルを加えます。

皿を、摂氏37度の加熱システムと40倍の油対物レンズを備えた広視野蛍光顕微鏡に取り付けます。イメージングせずに細胞を10分間インキュベートし、細胞と装置が平衡化します。次に、顕微鏡の設定を調整して、440ナノメートルまたは490ナノメートルの励起と535ナノメートルの30秒ごとに発光する明視野透過画像を取得します。

2分後、皿の中央に6つのfitzy zy砂に10回10を加え、30分間イメージングを続けます。30分後、タイムラプス撮影を停止し、タイマーを開始します。ステージを動かし、異なる視野で10枚以上のスナップショットを撮影し、5分以内に他のVagaゾーンを画像化します。

この手順では、キャリブレーション溶液を解凍し、ウォーターバスで摂氏37度に温めます。pHメーターでpHを確認し、記録します。次に、画像取得の前にガラス底皿に蠕動ポンプを取り付けます。

その後、30分間の取得期間の終了時にライブビデオ顕微鏡検査を行います。ポンプをオンにして、皿の中の溶液を取り除きます。続いて、最初のキャリブレーション溶液を1ミリリットル追加し、ポンプを停止します。

信号が安定するまで5分間待ちます。各キャリブレーション溶液で手順を繰り返します。タイムラプス動画とファゴソームスナップショットを分析するには、画像Jで画像を開き、セルのない領域に小さな正方形のROIを描画することにより、490チャネルの背景を減算します。

正方形のポリゴン選択ツールを使用して、プラグインをクリックします。その後、BG減算。編集をクリックして、440チャネルに同じROIをアップロードします。

次に、選択に続いて選択を復元し、バックグラウンドの減算手順を繰り返します。最初にクリックプロセスを使用して、490チャネルを440チャネルで割った32ビット比の画像を作成します。次に、画像計算機。

その後、画像 1 と画像 2 のドロップダウンメニューで適切な画像を選択します。演算のドロップダウンメニューで除算を選択し、32ビットの結果チェックボックスにチェックを入れます。その後、画像をクリックしてからテーブルを上に移動して、色分けルックアップテーブルを互換性のある比率の色分けに変更します。

次に虹色RGB。画像をクリックしてゼロピクセルと無限大ピクセルを削除する比率画像のしきい値を設定します。次に、調整し、続いてしきい値を調整します。

Xan が赤で表示されるようにスクロールバーを調整し、[適用] をクリックし、[背景ピクセルを nan に設定] チェックボックスが選択されていることを確認します。バックグラウンドと Xan 信号の値で非常に類似した比率の値が生成され、ノイズの多い比率の画像になる場合は、[プロセス] をクリックして 440 チャンネルに少量のバックグラウンドを追加し直します。次に数学。

次に、比率画像を追加してから作り直し、よりクリーンな結果を得ます。または、440 チャンネルのバックグラウンド減算を省略します。次に、この比スタックを明視野チャネルと組み合わせて、画像の色をクリックしてマルチチャネル合成します。

次に、チャネルをマージします。グレーチャンネルのドロップダウンメニューで明視野画像を選択し、グリーンチャンネルドロップダウンメニューで比率画像を選択します。次に、[ソース画像を保持]チェックボックスをオンにします。

その後、明視野チャネルと比チャネルを比較したタイムラプスムービーまたはスナップショットをスキャンして、分析するファゴソームを決定し、楕円形のポリゴン選択ツールを使用してファゴソームの周囲にROIを描画し、[分析ツール]をクリックしてROIマネージャーに追加します。次に、ROIマネージャーに続いて、さらに複数の測定をクリックしてXan強度比を測定し、スライスごとに1行のチェックボックスの選択を解除します。タイムラプス動画用。

各時点を測定し、必要に応じてROIを移動して強度値を経時的に追跡するROIタイプのコントロールMを描画することにより、FGAゾーンを一度に1つずつ追跡します。次に、結果ウィンドウから測定値をスプレッドシートにコピーして、蛍光を pH 値に変換します。スプレッドシートのキャリブレーションタイムラプスムービーでファゴソームの490対440の比率を測定した後、時間の経過に伴う比率の値をプロットします。

次に、各pHキャリブレーション溶液に対応する期間の中央内の5つの時点における視野内のすべてのファゴソームの平均比率値を計算します。これらの平均 490 から 440 の比率値を実際に測定された pH に対してプロットするには、少なくとも 3 つの独立したキャリブレーションを 1 つのグラフに組み合わせます。次に、非線形回帰分析を実行して、比値をpHに変換する方程式を取得します。

この図は、ファゴソームと摂取されたXanがどのように区別されるかを示しています。左側のパネルは、マージされた明視野画像と 490 から 440 の Fitz zy と比率を示しています。一方、右側のパネルは明視野画像のみを示しています。

ファゴソームは、細胞と共局在しない外部粒子、または示されている明視野画像内のファゴソームに特徴的な明るいリングに囲まれた暗い中心と蛍光が一致しない外部粒子と区別できます。野生型およびHV CN 1ノックアウト好中球FGAオマルpHの典型的な時間経過は次のとおりです 野生型好中球におけるpH、pHのneu中性またはわずかにアルカリ性 摂取後、HV CN 1ノックアウト好中球のファゴソームは、アルカリ性または酸性のコンパイルのいずれかです。ターゲットの追加から30〜35分後に撮影されたスナップショットにより、ここに示すFitz Xan比のヒストグラム内の多数のファゴソームから平均集団smal pHを計算できます。

野生型とHVCNの1ノックアウト好中球との間のsmal pHの違いを見ることができました 一度習得すれば、この技術は6時間で行うことができます。この手順を試行する際の最適化ステップから開始するには、イメージング条件の最適化を忘れないようにすることが重要です。まず、最適化ステップのために抗体濃度を最適化することは、この手順に続いて堅牢な食作用を確保するのにも役立ちます。

ロス産生の測定や細菌の死滅の測定などの他の方法は、スマルロスまたは細菌を殺すファゴソームの能力が、その発生後にpHとともに変化するかどうかなどの追加の質問に答えるために実行できます。この技術は、食細胞生物学の分野の研究者が、食細胞が摂取した物質を殺す能力や、さらなる免疫応答を誘発する処理能力に影響を与える要因を調査する道を開きました。このビデオを見れば、生細胞内のファゴソームの生理学的パラメータをリアルタイムで測定するために、幾何学的蛍光顕微鏡法をどのように行うかを十分に理解できるはずです。

UNIFOR阻害剤や生細胞を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。