Name: レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学ぶレシオメトリック蛍光顕微鏡法で生細胞内ファゴソームのpHをリアルタイム測定する手法。個々のファゴソームの異質性を解析し、病原体との相互作用や免疫応答の理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、スイス国立科学財団から運営助成金番号31003A-149566(N.D.へ)を通じて財政的に支援されており、サー・ジュールズ・ソーン慈善海外信託からYoung Investigator Subsidy(P.N.へ)を通じて支援を受けています。

倫理の声明：すべての動物の操作は、ジュネーブ大学の動物実験委員会のガイドラインに厳密に従って行きました。 貪食ターゲットの作製<ol><li> 10 mlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で乾燥したザイモサン20mgを加えます。 10分間沸騰水浴中で渦と熱。クールで5分間2,000×gで遠心します。 </li><li>水浴ソニケーターで、上清を除去し1mlのPBS中に再懸濁し、10分間超音波処理。 2 1.5ミリリットルチューブに500μlのを転送します。 5分間11,000×gで遠心分離します。 </li><li> 500μlのPBSで洗浄を繰り返します。煮沸ザイモサンは、等分凍結し、-20℃で保存することができます。 </li><li>たて、0.1M の Na 2 CO 3、（ステップ1.2）上記のようにpHが9.3を用意し500μlの二回ザイモサンを洗ってください。 </li><li>最終洗浄後490μlの再懸濁。ジメチルsulfoxidに溶解し10 mg / mlのFITCの10μLを追加E（DMSO）、ボルテックス、ホイルで覆い、そして室温で4時間撹拌しながらインキュベートします。 </li><li>最初の0.5ミリリットルのDMSO +300μlのPBS、その後、0.5ミリリットルのDMSO +450μlのPBS、その後、PBSのみで、その後+150μlのPBS 0.5ミリリットルのDMSOで、上記のように（ステップ1.2）洗浄し、結合していない色素を除去するために。 </li><li>血球計数器を使用してザイモサンを数えます。それは中央のグリッド上に配置されたカバースリップを満たしている血球計数器室の端に10μlを添加、ボルテックス、500μlのPBSにザイモサンの1μlを添加します。 20Xの対物レンズを搭載した明視野顕微鏡で血球計数器を取り付けます。 </li><li> 16正方形を含む左上隅に焦点を当て、手の数取器を使用して、このエリア内のすべてのザイモサン粒子をカウントします。右下の隅に繰り返します。 =ザイモサン濃度/ 2×500×10 4ザイモサン/ mlのカウント：以下の式を使用してザイモサン濃度を計算します。標識ザイモサンは、等分凍結し、-20℃で保存することができます。 </li><li>ラベルされたザイモサンのwiをオプソニン化1：100希釈でウサギ抗ザイモサン抗体番目。ボルテックスおよび37℃の水浴中で1時間インキュベートします。 （ステップ1.2）上記のように500μlのPBSで洗浄します。 注意：ザイモサン後で解析をより困難にすることができ塊を形成する傾向があるとして、超音波処理は非常に、特にオプソニン化した後に、推奨されます。 65％（v / v）のラットまたはヒト血清でオプソニン化は、代替として使用することができます。 </li><li>ステップ1.7から1.8に記載されているように血球計数器を使用してザイモサンをカウントし、100×10 6粒子/ mlに希釈します。補体、または全くオプソニンのような他の食細胞刺激剤とのオプソニン化は、代わりに実行することができます。 </li></ol> 2.ライブビデオ顕微鏡<ol><li>他の場所38で詳細に説明するように、一次マウスの好中球を分離します。 <ol><li>また、任意の食細胞タイプを使用します。 （RPMI）ロズウェルパーク記念研究所で氷の上での好中球を保ち、5％ウシ胎児血清を補充した1640（V / V）、200 Uペニシリン/ streptomycinは、10×10 6細胞/ mlの濃度で使用直前まで。他の細胞型は、1〜4日前に播種することができます。 </li></ol></li><li> 50μlの培地を追加することで、ドロップを広げ、細胞を接着させるために37℃で5分間インキュベートし、35mmのガラスボトムディッシュの中心に好中球の2×10 5（20μl）を追加します。 </li><li>ハンクス平衡塩溶液（HBSS）1mlを特定のMPO阻害剤、4-アミノ安息香酸ヒドラジド（4- ABH、10μM）を含む37℃に温め加えます。このようなアジ化ナトリウムのような非特異的なMPO阻害剤、（5 mM）を、使用してもよいが、近年pHを39に追加の非特異的効果を発揮することが示唆されています。 </li><li> 37℃の加熱システムと40X油目的を搭載した広視野蛍光顕微鏡の料理をマウントします。細胞や機器を平衡化することを可能にするために10分間イメージングせずに細胞をインキュベートします。 </li><li>明視野透過画像を取得する顕微鏡の設定を調整する[PHASEまたは440 nm以下490nmの励起および535nm放射ごとに30秒で使用可能な場合は微分干渉コントラスト（DIC）]。 </li><li>あまりにも多くの光退色や光毒性を回避するために、顕微鏡システムに応じてと頼まれて、実験の質問に応じて露光時間と取得頻度を調整します。画像取得を開始します。 </li><li> 2分後、10×10 6（50μl）を追加皿の中央にFITC-ザイモサンをオプソニン化。使用食細胞とターゲットの種類に応じて細胞比：ターゲットを調整します。 </li><li> 30分間撮影を続けます。 30分後、タイムラプス取得を停止し、タイマーを開始します。ステージを移動し、すべての5分以内に、画像その他のファゴソームに異なる視野で10以上のスナップショットをキャプチャします。 </li></ol> 3.キャリブレーションとコントロール実験<ol><li>実験の日に（レシピは表1に記載されている）は、従来のpH校正ソリューションを準備し、10mlのアリコートで凍結します。37℃の水浴中に較正溶液と暖かいを解凍します。 pHメーターでpHをチェックして、ソリューションの実際のpHを記録します。 </li><li>前の画像取得にガラスボトムディッシュの蠕動ポンプをマウントして、上記のようにライブビデオ顕微鏡を行う（セクション2）。 </li><li> 30分の取得期間の終わりに、ディッシュ内の溶液を除去第1の較正溶液1mlを加え、ポンプを停止する上でポンプの電源を入れます。 </li><li>信号は、通常は5分を安定するまで待ちます。各校正液で繰り返します。 <ol><li>実験日ごとに少なくとも1つのキャリブレーションを実行して、最高のpHで始まり、最低に順次作業だけでなく、最低のpHから出発して、最高に向けて順次作業を調整します。 </li></ol></li><li>対照として、ガラスボトムディッシュで900μlのHBSS中の細胞にHBSS中で希釈し、100μMNADPHオキシダーゼ阻害剤ジフェニルpropioniumヨウ化（DPI）の100μlを添加し、10分間インキュベートします。 </li><li>取得を開始して（ステップ2.7）上記のようにザイモサンを追加します。食作用の15分後、HBSS中で希釈した（コンカ）コンカナマイシン、10μMのV-ATPaseの阻害剤の10μlを添加し、さらに15分間撮影を続けます。 </li></ol> 4.分析<ol><li>タイムラプス映画やファゴソームスナップショットの分析。 注意：以下の手順は、ImageJのに特異的です。ステップバイステップの手順は、使用するソフトウェアの依存して広く変化し得るが、この節で説明する関数は、ほとんどのプロの画像解析ソフトで利用できます。 <ol><li>プロの画像解析ソフトウェアで画像を開きます。何の細胞が存在しない領域に四角ポリゴン選択ツールを使用して、小さな正方形のROIを描画し、ROIからプラグイン&gt; BGの減算をクリックすることで、490チャンネルのバックグラウンドを減算します。次に&gt;選択&gt;選択と繰り返しを復元し、[編集]をクリックすることで、440チャンネルで同じROIをアップロードします。 </li><li>その後、[操作]ドロップダウンメニューで「分割」を選択、...プロセス&gt;画像電卓をクリック画像1と画像2のドロップダウンメニューで、適切な画像を選択することにより、440チャンネルで割った490チャンネルの32ビットの比画像を作ります、および32ビット（フロート）結果チェック・ボックスをチェック。 </li><li> &gt;レインボーRGBの画像&gt;ルックアップテーブルをクリックすることで、比と互換性の色分けにカラーコーディングルックアップテーブルを変更します。画像をクリックして、0と無限大のピクセルを排除するための閾値比画像は、&gt;&gt;しきい値を...調整します。 NaNのチェックボックスに設定した背景ピクセルが選択されていることを確認すること、そのザイモサンは赤で表示されるようにスクロールバーを調整し、[適用]をクリックします。 </li><li>画像をクリックすることで、マルチチャンネルコンポジットに明視野チャンネルとこの比スタックを組み合わせ&gt;カラー&gt;チャンネルをマージし、灰色のチャネルのドロップダウンメニューで、明視野像と緑のチャネルのドロップダウンメニューで、比画像を選択し、選択しますチェックボックスをソース画像を保管してください。タイムラプスムービーやファゴソームが分析されるかを決定するためにスナップショットをスキャンします。明視野チャンネルは、この場合に便利です。 </li><li>追加&gt;ファゴソームの周りに楕円形、多角形選択ツールを使用して、関心領域（ROI）を描画し、分析]&gt; [ツール]&gt; [ROIマネージャ]をクリックして、ROIマネージャーに追加します。詳細&gt;マルチ測定デスライス選択]チェックボックスごとに1つの行をクリックすることで、彼らのザイモサン強度比を測定します。 </li><li>タイムラプスムービーでは、トラックは、各時点を測定するには、Ctrl + Mを入力し、ROIを描画し、時間をかけて強度値を追跡するために必要な場合に、ROIを移動させることにより、一度に一つのファゴソーム。表計算ソフトに結果ウィンドウからの測定値をコピーします。 注：15（実験X 3当たり5時間のコース）の独立した実験の分析は理想的ですが、多かれ少なかれ観察変動に応じて必要となる場合があります。 ROIを保存すると、常に推奨されます。一部のソフトウェアパッケージでは、画像レジを許可ストレーションおよびROIの動的更新、分析のこの部分を容易にします。 </li></ol></li><li>蛍光のpH値への変換<ol><li> 4.1節で説明したように、キャリブレーションタイムラプスムービーでファゴソームのための440分の490の比率を測定します。 </li><li>スプレッドシートでは、時間をかけて比の​​値をプロットし、各pH校正に対応する期間の中央内5の時点から（5-20​​の間、通常は）視野内の全てのファゴソームから平均の比の値を計算します溶液。 （ 図5Aにも赤いボックスを参照してください。） </li><li>実際に測定されたpH値に対してこれらの平均440分の490比の値をプロットします。一つのグラフに、少なくとも3つの独立したキャリブレーションを結合します。通常シグモイド方程式に、非線形回帰（ベストフィット曲線）を実行するために、統計や数値ソフトウェアパッケージを使用してください。 注：例えば、 図5（b）で使用される式は、ボルツマンシグモイド[Y =ボトム+（（上下）でした/（1 + EXP（（V50-X）/スロープ））Yの値が440分の490比である]、Xは、pHの値であり、上、下、V50及び傾斜パラメータは、ソフトウェアによって計算されます。 </li><li> pHに比の値を変換するために取得した式を使用します。 注：例えば、 図5（b）にアジ化ナトリウムの存在下での検量線について得られた方程式は440分の490率で= 1.103 + [（2.89から1.103）/（1 + EXP（（6.993-PH）/0.9291）] 。pHを解くことは、以下の式が得られます。pH値= 6.993から0.9291 * [LN（（1.178 /（比-1.103）） - 1））]。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yeung, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+signaling+and+the+modulation+of+surface+charge+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis.</a> Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Fairn, G. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+nascent+phagosomes+mature+to+become+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes.</a> Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+and+associated+ion+fluxes+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis.</a> Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).</li>
<li>Binder, B., Holzhutter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothetical+model+of+cargo-selective+rab+recruitment+during+organelle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation.</a> Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).</li>
<li>Hurtado-Lorenzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-ATPase+interacts+with+ARNO+and+Arf6+in+early+endosomes+and+regulates+the+protein+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway.</a> Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).</li>
<li>Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+and+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Acidification and protein traffic.</a> Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>De Vito, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fhydrogen+exchanger%3A+a+possible+mediator+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity.</a> Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).</li>
<li>Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channels%2C+including+ClC-3%2C+are+required+for+normal+neutrophil+oxidative+function%2C+phagocytosis%2C+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+reactions+and+microbial+killing+in+the+neutrophil+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).</li>
<li>Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-Gated+Proton+Channels+as+Novel+Drug+Targets%3A+From+NADPH+Oxidase+Regulation+to+Sperm+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.</a> Antioxid Redox Signal. , (2014).</li>
<li>Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+in+the+phagosome%3A+impact+on+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+macrophage-targeted+NADPH+oxidase+mediates+antifungal+host+defense+and+regulation+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice.</a> J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).</li>
<li>Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+voltage-gated+proton-selective+channel+lacking+the+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain.</a> Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).</li>
<li>El Chemaly, A., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+Hv1+proton+channels+regulate+the+ionic+and+redox+homeostasis+of+phagosomes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?</a> Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leukoc Biol. , (2014).</li>
<li>Decoursey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels.</a> Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).</li>
<li>Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+are+required+for+high-level+NADPH+oxidase-dependent+superoxide+production+during+the+phagocyte+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acidification+in+Mycobacterium+phagosomes+produced+by+exclusion+of+the+vesicular+proton-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.</a> Science. 263 (5147), 678-681 (1994).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+and+avirulent+strains+of+Francisella+tularensis+prevent+acidification+and+maturation+of+their+phagosomes+and+escape+into+the+cytoplasm+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages.</a> Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).</li>
<li>Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+activates+virulence+gene+transcription+within+acidified+macrophage+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).</li>
<li>Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+macrophages.+In+situ+assessment+of+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+activity%2C+counterion+conductance%2C+and+H%2B+%27leak%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).</li>
<li>Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+candidacidal+activity+in+macrophages+activated+by+recombinant+gamma+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon.</a> Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).</li>
<li>Ip, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+phagosome+acidification+are+required+for+pathogen+processing+and+MyD88-dependent+responses+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).</li>
<li>Clarke, M., Maddera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte+meets+prey%3A+uptake%2C+internalization%2C+and+killing+of+bacteria+by+Dictyostelium+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae.</a> Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126 (1), 205-218 (2006).</li>
<li>Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li>
<li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li>
<li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li>
<li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+%28AIM%29+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670(2013).</li>
<li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Res+Opin%22%5BJournal%5D)">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSOP%2FHv1+proton+channels+sustain+calcium+entry%2C+neutrophil+migration%2C+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock%3A+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li>
<li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ターゲットに接続されたpH感受性色素を用いた同様の戦略を採用するが、ファゴソームの集​​団の平均pH値を測定し、このような分光法およびFACSなどの代替の方法、より多くの時間がかかりますが、顕微鏡検査は、いくつかの利点を提供しています。最初に、内部および外部で結合したことであるが、内在化しない、粒子は容易にそれぞれ、外部粒子を急冷または標識するために、トリパンブルーまたは抗体など、他の化学物質を追加することなく、区別することができます。それは人口ベースの方法で見落とされてしまう可能性があるのに対し、第二に、リアルタイムで細胞を以下は、研究者が食作用のプ​​ロセスの複数の側面移行での同時ので、効果を観察することを可能にすることである粒子を検出し、結合が簡単に、ここで識別されることがあります。さらに、食作用の開始の同期は、多くの場合、コールドショック40,41に他の人身売買のイベントを乱す可能性がある4℃、で細胞を配置することによって行われ、何もありません時間ゼロ、必要に応じてTを直接識別することができます。ライブ顕微鏡を実行するとき確かに、この4℃の同期技術は、客観イマージョンオイルと混合することができる温度シフト中...

食作用は、自然免疫細胞が大きな粒子を飲み込むプロセスで、単細胞生物の摂食メカニズムから進化したもので、標的に結合し、膜で包み込み、膜をつまんでファゴソームと呼ばれる細胞質内に液胞を形成することを含みます。ファゴソーム膜は原形質膜に由来しますが、活性タンパク質と脂質の選別、およびファゴソーム形成中の膜内膜との融合により、ファゴソームは細胞内で明確なオルガネラに変換され、分解特性により、摂取された物質の殺傷、中和、および分解が可能になります1-3.このプロセスは、ファゴソーム成熟と呼ばれ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)オキシダーゼを含む多くのタンパク質分解酵素および微殺酵素の送達に依存しており、電子をファゴソームに伝達して強力な酸化剤O2-およびその誘導体活性酸素種(ROS)を生成します2,4。
ファゴソームの管腔pHは、ファゴソームの機能に必要ないくつかの事象に深い影響を与えます。まず、膜貫通型輸送調節因子のpH依存性コンフォメーション変化は、Arfs、Rabs、小胞性コートタンパク質などの輸送決定因子の動員を変化させ、その結果、どの小胞がファゴソームと融合するかを定義するため、pHは一般に内膜の輸送に影響を与えます5-8。第二に、ファゴソーム内腔のイオン組成もファゴソームが成熟するにつれて変化し、食細胞機能を促進するNa+/H+交換体やClCファミリーCl-/H+アンチポーターなどの一部のイオントランスポーターは、H+転座に依存している9,10。同様に、ROS産生はファゴソームのpHと密接に関連しています。ROSとその有毒な酸化副産物は、好中球4,11,12のファゴソーム死滅に重要であると長い間認識されており、マクロファージ、樹状細胞(DC)、アメーバ13-16などの他のファゴサイトでも重要な役割を果たすことが示されています。NADPHオキシダーゼは、NADPHが消費されるとサイトゾルでH +を放出する電気起源酵素であり、輸送された電子と一緒にファゴソーム内腔に輸送された電子と一緒にコンパニオンHVCN1チャネルを介してH +を同時に移動させる必要があります酵素17-21の自己阻害につながる大規模な脱分極を緩和するために.最後に、いくつかのタンパク質分解酵素は異なるpHで最適な活性を持つため、時間依存的なファゴソームpHの変化は、どの酵素がいつ活性になるかに影響を与える可能性があります。ファゴソームpHの重要性は、結核菌、フランシスセラ・トゥラレンシス、サルモネラ・チフェリウムなどの生物によって強調されています。これらの生物は、ファゴソームのpHを22-24に変化させることにより、少なくとも部分的には食作用の殺傷を抑制します。
哺乳動物では、主な食細胞は好中球、マクロファージ、樹状細胞であり、細胞の種類によって、時間依存的なファゴソームのpH変化は大きく異なり、異なる役割を果たしているように見えます。マクロファージでは、ATP依存性プロトンポンプ液胞ATPアーゼ(V-ATPase)によって媒介される強力で急速な酸性化が、殺傷を媒介する主要な要因の1つであり25-27、食作用を摂食メカニズムとして使用するアメーバに存在するメカニズムに似ている28。これらの細胞では、酸性プロテアーゼの活性化が重要な役割を果たすと考えられています。対照的に、好中球の死滅は、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)11によって生成されるHOClだけでなくROSにも依存しており、pHは最初の30分間は中性またはアルカリ性のままで、後で酸性化します29,30。中性pHは、特定のカテプシンなどの酸化的プロテアーゼの活性を促進することが示唆されています。DCでは、ファゴソームのpHは物議を醸しており、酸性化を報告するものもあれば、中性またはアルカリ性のpHを報告するものもあります31,32が、ROSとpHは、これらの細胞がT細胞に抗原を提示する能力に深く影響を与える可能性があります。これらは、それらの主な機能の1つです33。
重要なことに、ホルモン、ケモカイン、サイトカインは、成熟と食細胞の行動の変化を誘発し、ひいてはファゴソームのpH34,35に影響を与えるシグナル伝達イベントを生成する可能性があります。同様に、抗マラリア薬のクロロキン(例えば、抗がん剤療法36)も、ファゴソームのpH、ひいては免疫転帰に影響を及ぼし得る。したがって、さまざまな細胞生物学者、免疫学者、微生物学者、および医薬品開発者は、特定の遺伝的混乱、生理活性化合物、または微生物が自然免疫応答および適応免疫応答に及ぼす影響の根底にあるメカニズムを理解しようとするときに、ファゴソームpHの測定に関心を持つ可能性があります。
ここでは、好中球のファゴソームpHを測定する方法について説明し、これにより、好中球のファゴソームpH19を調節するHVCN1チャネルの重要性を示すことができました。この方法は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)のレシオメトリック特性に基づいており、その535 nmでの蛍光発光は、490 nmで励起されたときにpHに敏感ですが、440 nmでは励起されませんでした37。この色素が標的(この場合はザイモサン)に化学的に結合している場合、広視野蛍光顕微鏡を使用して追跡でき、細胞が食作用を発する様子を画像化し、ファゴソームが成熟するにつれてファゴソームのpH変化をリアルタイムで測定します。次に、食作用した細胞をイオノフォアニゲリシンとモネンシンを含む異なるpHの溶液にさらすキャリブレーション実験を行うことにより、実際のpHを収集します。これにより、ファゴソーム内のpHと外部溶液との迅速な平衡化が可能になります。次に、比値を溶液の既知のpHと比較し、非線形回帰によって検量線を作成し、得られた式を使用して比値からpHを計算します。

<table><tbody><tr><td>ザイモサンA粉末</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z4250</td><td>各種提供者存在</td></tr><tr><td>フルオレセイン・イソチオシアネート</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F7250</td><td>各種提供者存在</td></tr><tr><td>抗ザイモサン抗体(ザイモサンA生体粒子オプソニン化試薬)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズZ2850</td><td>シグマ・アルドリッチO6637は同等の製品です。あるいは、25%血清をオプソナイジ試薬として使用することもできます。</td></tr><tr><td>4-アミノ安息香酸ヒドラジド(4-ABH)</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-204107</td><td>有毒、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr>ジ<tr><td>フェニレンヨードニウムクロリドニウム(DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>有毒、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>コンカナマイシンA(ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td>有毒<td>、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr>ニ<tr><td>ゲリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>有毒、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>有毒、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14200-075</td><td>有毒、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>ハンクのバランス塩溶液</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>14025092</td><td>リンガーのバランス塩溶液または他の透明な生理学的緩衝液代用されます。</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>さまざまなプロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>さまざまなプロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>さまざまなプロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>N-メチル-D-グルカミン(NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>さまざまなプロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸(EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>さまざまなプロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>さまざまなプロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>無水エタノール (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>さまざまなプロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>ガラス底35mmシャーレ(フルオロディッシュ)</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &micro;-適切なイメージングチャンバーを備えたクリアディッシュまたはカバースリップを構成することができます</td></tr><tr><td>超音波処理ウォーターバス</td><td>O.クライナーAG</td><td></td><td>代わりに超音波処理器を使用することができ、さまざまな機器プロバイダーが存在する</td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>さまざまな機器プロバイダーが存在します</td></tr><tr><td>広視野ライブイメージング顕微鏡</td><td>カール・ツァイスAG</td><td></td><td>様々な機器プロバイダーが存在しますが、顕微鏡は440/535と490/535の励起/発光をそれぞれイメージングできなければなりません。明視野機能を備えたスピニングディスク共焦点セットアップで代用できる場合もありますが、ザイモサンは焦点が合わなくなることがよくあります。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ (Dynamax RP-1)</td><td>レイニン</td><td></td><td>各種機器プロバイダーあり</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>各種機器プロバイダーあり</td></tr><tr><td>マニュアル</td><td>カウンター Milian SA</td><td></td><td>各種機器プロバイダーあり</td></tr></tbody></table>

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのphを測定します

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

食作用は、先天性免疫細胞が死滅させるかまたは中和摂取材料を、または抗原として​​それを提示し、適応免疫応答を開始するために、細菌、アポ​​トーシス細胞または他の異物を飲み込み、それを通して基本的な過程です。ファゴソームのpHは、内膜およびタンパク質分解酵素の活性化、食作用性空胞が分解オルガネラに成熟することを可能にするイベントと核分裂や核融合を制御する重要なパラメータです。加えて、H +との転座は、他の宿主組織への効率的な殺傷及びシグナリングのために必須である活性酸素種（ROS）の高レベルの産生のために必要とされます。多くの細胞内病原体は、フ​​ァゴソームの生物学におけるpHの重要性を強調し、ファゴソーム酸性化を制限することにより、食細胞死滅を覆します。ここでは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を使用して、好中球にファゴソームのpHを測定するためのレシオメトリック法は貪食TARGとしてザイモサンを標識説明しますETS、ライブセルイメージング。アッセイは、単一色素の蛍光よりもむしろ絶対的なpH依存性比の定量を、可能にする、440 nmで励起した場合、490nmで励起した場合、酸性pHによりクエンチされないが、FITCの蛍光特性に基づいています。 インサイチュ染料較正及び実際のpH値との比の変換を行うための詳細なプロトコルも提供されます。彼らは、このような漂白などの摂動に対する感度が低いなどの単一染料レシオメトリック法は、一般的に測定された信号を歪ま変化、レーザーの変動、および不均一なラベルを、集中、単一の波長またはデュアル色素擬似レシオメトリックのプロトコルよりも優れて考えられています。この方法は、容易に他の食細胞タイプのpHを測定するために変更することができ、及びザイモサンは、不活性ビーズからの生きた微生物を、任意の他のアミン含有粒子で置き換えることができます。最後に、この方法は、異なるpH範囲に感受性の他の蛍光プローブまたは他のphagosomを利用するように適合させることができますアル活動は、それファゴソームの機能イメージングのための一般的なプロトコルとなっています。

/ - -以下は、初代マウス好中球のファゴソームpHは野生型またはHvcn1の骨髄から分離された実験の代表的な結果であります マウスを比較しました。成功した実験では、それは後の画像解析の際にセグメントに、より困難になりますあまりにも多くのファゴソームを回避しながら、タイムラプスムービーの全期間中に視野内に十分なファゴソームを得ることが重要である。1に示す図良い面と悪い集密度の例。時間依存とスナップショットは、分析のために、外部のザイモサン粒子はファゴソームと区別し、分析から除外されなければならない。2は、明視野像は、ファゴソームから外部ザイモサン粒子を区別しやすくするためにどのように活用できるかを示しています。 図3は、典型的なファゴソームの例を示していますHvcn1と比較して、野生型のpHタイムコース- / - </em&gt;の好中球、平均pH値、およびファゴソーム...

ファゴソームのpHは、ファゴソームの成熟、酸化剤の生成、ファゴソームの死滅、抗原の提示に影響を与えます。ここでは、蛍光顕微鏡法を使用して、生きた食細胞の個々のファゴソームの時間経過とエンドポイントのpH変化を測定するためのレシオメトリック法について説明します。

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

一連の実験の全体的な目的は、レシオメトリック蛍光顕微鏡を用いて、生細胞内のファゴソームpHを測定することです。この手法は、病原体相互作用における主要分子の特定や、遺伝子欠損や薬物がファゴサイトーシスに及ぼす影響など、食細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、 FACSや分光法などの集団ベースの手法とは異なり、粒子の結合移行の変化や、個々のファゴソームの不均一性などの影響を検出できることです。この技術の意義は、病原性化学生物に対する治療法にまで及びます。なぜなら、これらの微生物の多くは、ファゴソーム内での分解を避けるためにファゴソームのpHを変化させることができるためです。この手順を開始するには、20 mgの乾燥Xanを10 mLの滅菌PBSに加え、ボルテックス後、沸騰水浴で10分間加熱します。その後、冷却し、2000 Gsで5分間遠心分離します。その後、上清を除去し、Xanを1 mLのPBSで再懸濁します。ウォーターバスを用いて10分間ソニケーションを行います。ソニケーション後、再懸濁したXan 500 µLを2本の1.5 mLチューブに分注し、11,000 Gで5分間遠心分離します。500 µLのPBSで洗浄を繰り返します。次に、pH 9.3に調整した調製直後の0.1 M炭酸ナトリウム溶液500 µLでXanを2回洗浄し、最後の洗浄後、490 µLの炭酸ナトリウム溶液に再懸濁します。その後、10 mg/mLのDMSOに溶解したFZ 10 µLをXanに加え、ボルテックスで混合します。アルミホイルで覆い、室温で4時間攪拌しながらインキュベートします。未結合の眼を除去するため、まず0.5 mLのDMSOと150 µLのPBSの混合液で洗浄し、洗浄ステップの間にソニケーションを行います。次に、0.5 mLのDMSOと300 µLのPBSの混合液で洗浄し、続いて0.5 mLのDMSOと450 µLのPBSの混合液で洗浄した後、PBSのみで洗浄します。その後、500 µLのPBSに1 µLのXanを加え、ボルテックスします。次に、希釈したxma sandを10 µL、カバーガラスと接するヘモサイトメーターチャンバーの端に加えます。20x対物レンズを備えた明視野顕微鏡にヘモサイトメーターを設置します。16個の正方形が含まれる左上隅に焦点を合わせ、この領域内にあるすべてのxma sand粒子を数えます。手動タリーカウンターを使用して、右下隅でも同様の手順を繰り返します。次に、この式を用いてXan濃度を算出します。続いて、標識したXanを1:100に希釈した抗Xan抗体でオプソニン化し、ボルテックスした後、37 °Cのウォーターバスで1時間インキュベートします。その後、ヘモサイトメーターを用いてXan粒子をカウントし、100 × 10⁶ particles/mLに希釈します。マウスの一次好中球を単離した後、35 mmのガラスボトムディッシュの中心に2 × 10⁵ 個の好中球を滴下します。次に、50 µLの培地を加えて液滴を広げ、細胞を接着させるため37 °Cで5分間インキュベートします。その後、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤を含む、37 °Cに加温した1 mLのHBSSを添加します。37°Cの加熱システムと40倍オイル浸 objectives を備えた広視野蛍光顕微鏡にディッシュをセットします。細胞と装置を平衡状態にするため、イメージングを行わずに10分間インキュベートします。次に、顕微鏡の設定を調整し、440 nmまたは490 nmの励起波長および535 nmの蛍光波長を用いて、30秒ごとに明視野透過像を取得します。2分後、10倍の濃度の溶液をディッシュの中心に10 µL加え、さらに30分間イメージングを継続します。30分後、タイムラプス撮影を停止し、タイマーを開始します。ステージを移動させ、5分以内に他のvaga領域を撮影するため、異なる視野で10枚以上のスナップショットを撮影します。本手順では、校正溶液を解凍し、ウォーターバスを用いて37 °Cまで加温します。pHメーターでpHを確認し、記録してください。次に、画像取得の前にペリスタルティックポンプをガラスボトムディッシュに取り付けます。その後、30分間のデータ収集期間の最後にライブビデオ顕微鏡観察を行います。ポンプを起動して、ディッシュ内の溶液を除去します。続いて、1 mLの第1校正液を添加し、ポンプを停止します。信号が安定するまで5分間待ちます。各校正溶液を用いてこの手順を繰り返します。タイムラプス動画およびファゴソームのスナップショットを解析するには、Image Jで画像を開きます。細胞のない領域に小さな正方形のROIを描画し、490チャンネルの背景を減算します。正方形ポリゴン選択ツールを使用し、「plugins」をクリックします。その後、背景減算（BG subtraction）を行います。次に、「edit」をクリックして、440チャンネルに同じROIをアップロードします。次に選択を行い、続いて選択範囲を復元し、背景減算の手順を繰り返します。まず「Process」をクリックし、次に「Image Calculator」を選択して、490チャンネルを440チャンネルで除算した32ビットの比率画像を作成します。その後、「image one」および「image two」のドロップダウンメニューから適切な画像を選択します。「operation」ドロップダウンメニューで「divide」を選択し、「32 bit result」チェックボックスをオンにします。次に、「image」から「lookup tables」の順にクリックし、カラーコーディング・ルックアップテーブルを比率対応のカラーコーディングに変更します。次に、虹色（RGB）を選択します。画像をクリックし、比率画像のしきい値を設定して、値が0および無限大のピクセルを除去します。その後、「adjust」および「threshold」で調整します。スクロールバーを調整してXanが赤色で表示されるようにし、「apply」をクリックします。このとき、「set background pixels to nan」チェックボックスが選択されていることを確認してください。背景とXanの信号値が非常に近い比率となり、比率画像にノイズが生じる場合は、「process」をクリックして440チャンネルに少量の背景を戻します。その後、「math」を実行します。その後、追加して比率画像を再作成し、よりクリアな結果を得ます。あるいは、440チャンネルの背景減算を省略します。次に、「image color」をクリックして、この比率スタックと明視野チャンネルをマルチチャンネル合成画像に統合します。次に、チャンネルを合成します。グレーチャンネルのドロップダウンメニューで明視野画像を選択し、グリーンチャンネルのドロップダウンメニューで比率画像を選択します。その後、「keep source images」チェックボックスを選択してください。その後、明視野チャンネルとレシオチャンネルを比較しながらタイムラプス動画またはスナップショットをスキャンし、解析対象となるファゴソームを決定します。楕円ポリゴン選択ツールを用いてファゴソームの周囲にROIを描画し、[Analyze Tools] → [ROI Manager] → [Add] の順にクリックしてROIマネージャーに追加します。次に、[More] → [Multi Measure] をクリックし、[One row per slice] のチェックボックスを外して、Xanの強度比を測定します。タイムラプス動画の場合も同様に行います。ROIタイプのコントロールMを描画してFGA領域を一つずつ追跡し、各タイムポイントを測定します。必要に応じてROIを移動させ、時間経過に伴う強度値を追跡してください。その後、結果ウィンドウから測定値をスプレッドシートにコピーし、蛍光値をpH値に変換します。校正用タイムラプス動画内のファゴソームについて、スプレッドシートで490対440の比率を測定した後、比率の時間経過をプロットします。次に、各pH校正液に相当する時間範囲の中間点における5つの時点において、視野内のすべてのファゴソームの平均比率値を算出します。少なくとも3回の独立した校正結果を1つのグラフにまとめ、これらの平均490/440比率値を実際に測定したpHに対してプロットします。その後、非線形回帰分析を行い、比率値をpHに変換するための方程式を導き出します。この図は、ファゴソームと取り込まれたXanがどのように区別されるかを示しています。左パネルは、明視野像と490 nmおよび440 nmのFitz比のマージ画像であり、右パネルは明視野像のみを示しています。ファゴソームは、細胞と共局在しない外部粒子や、明視野像に示されるファゴソームの特徴である「明るいリングに囲まれた暗い中心部」と蛍光が一致しない粒子と区別できます。以下は、野生型およびHV CN oneノックアウト好中球の典型的なタイムコースです。野生型好中球のファゴソーム内pHは、初期段階では中性または弱アルカリ性です。取り込み後、HV CN oneノックアウト好中球のファゴソームは、アルカリ性または酸性のいずれかになります。ターゲット添加から30〜35分後に撮影したスナップショットを用いることで、ここに示すFitz Xan比のヒストグラムから、多数のファゴソームに基づいた平均的な集団のpHを算出することが可能です。野生型とHVCN1ノックアウト好中球との間で、わずかなpHの差を確認することができました。この手法を習得すれば、6時間で完了させることが可能です。本手順を実施する際は、まず最適化ステップから開始し、イメージング条件を最適化することが重要です。また、最適化ステップにおいて抗体濃度を最適化しておくことは、本手順後の堅牢な食作用を確保する上でも有用です。ROS生成量の測定や細菌殺菌能の測定といった他の手法を用いることで、pHの変化に伴い、ROSの産生能やファゴソームの細菌殺菌能が変化するかどうかなど、追加の疑問を検討することが可能です。この手法により、食細胞生物学の分野の研究者が、食細胞による摂取物の殺菌や処理、およびその後の免疫応答の誘発に影響を与える要因を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、生細胞内のファゴソームの生理学的パラメータをリアルタイムで測定するための共焦点蛍光顕微鏡法の実施方法について、十分に理解できるはずです。UNIFOR阻害剤および生存細胞を用いた操作は非常に危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は常に手袋を着用するなどの予防措置を講じてください。

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ガラス底皿の表面に付着したIgGオプソン化赤血球(RBC)のマクロファージ媒介性食作用におけるファゴソームの形成と閉鎖をリアルタイムで可視化するための高解像度の全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示しています。マクロファージはRBCの周囲に偽足を伸ばし、ファゴソーム内に飲み込み、ガラス表面から分離します。...

TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

細胞内pHの測定にはいくつかの方法がありますが、細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定できる方法はほとんどありません。ここでは、生細胞のレシオメトリックイメージングにより、細胞質と小胞のpHを同時に測定するための迅速かつ正確な方法論について詳しく説明します。...

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。...

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

この原稿は、レシオメトリック指標であるセミナフトロダフルーア(SNARF)-1またはS-1を使用して、ヒトおよびマウスの好中球のファゴソームpHと面積、および細胞質pHを測定する簡単な方法について説明しています。これは、生細胞共焦点蛍光顕微鏡法と画像解析を使用して達成されます。...

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。...

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。...

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

生細胞の個々のマクロピノソームにおけるpH、酸化事象、タンパク質消化を測定するためのプロトコルについて述べています。二重蛍光系比測定顕微鏡と、人口ベースの技術よりも利点に重点が置かれています。...

二重蛍光系比測定法を用いたマクロピノソームのpH、レドックス化学、分解能の測定

学ぶレシオメトリック蛍光顕微鏡法で生細胞内ファゴソームのpHをリアルタイム測定する手法。個々のファゴソームの異質性を解析し、病原体との相互作用や免疫応答の理解に貢献します。

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

さらに動画を探す