RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

このレーザーキャプチャマイクロダイセクションプロトコルの全体的な目標は、下流の遺伝子発現分析のために、不均一な凍結前立腺組織から前立腺上皮細胞型の純粋な集団から全RNAを単離することです。この方法は、患者の検体を分析し、良性の上皮性人工組織サンプルと疾患の上皮人工組織サンプル、または臨床試験検体でのRNA発現の違いなど、前立腺がん研究分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、レーザーキャプチャマイクロダイセクションにより、凍結前立腺組織から上皮細胞またはstr細胞の均質な集団のRNA分離が可能になることです。

一般に、この方法に不慣れな人は、RNAを維持するためにどのステップが重要であるかがわからないため、高品質のRNAを取得するのに苦労します。自由条件 まず、手術に必要なすべての試薬とツールを集めることから始めます。凍結した前立腺組織をクライオスタット内で30分間平衡化させた後、カセットの底に封入培地を噴射し、冷やした鉗子を使用して組織を迅速に封入します。

カセットをクライオスタットのチラーに5分間入れて、封入剤をセットします。セットしたら、凍結して潮吹きし、チャックに培地を封入し、取り付けたティッシュを慎重に押し込みます。底面を上にして。

準備を5分間固めます。チャックをホルダーに入れる前に、ハンドルを所定の位置にロックし、新しいブレードをクライオスタットに挿入します。ハンドルのロックを解除した後、目的の組織曝露に達するまでサンプルを慎重に進めます。

準備ができたら、クライオスタットを5ミクロンに調整し、1つまたは2つのセクションを切断します。これらの切片を帯電したスライドガラスに載せて、ヘマチンとエオインを染色します。すぐにスライドを冷たい100%エタノールに2分間置きます。

この後、スライドを取り外し、室温で乾かします。hおよびd染色スライドは、核のテクスチャーをよりよく視覚化するため、病理医は関心のある領域をマークするために使用する必要があります。次に、常温のペンフレームを置きます。

フレームサポーターにスライドさせ、クライオスタットを10ミクロンに調整してセクションを作成します。組織のサイズに応じて、各スライドに1〜4つのセクションを配置できます。すぐにスライドを冷たい100%エタノールに突っ込みます。

2分後にスライドを取り出し、後で分析するために冷凍庫に保管します。レーザーキャプチャマイクロダイセクションの同じ日に、RNAフリーエリアで作業する冷凍庫からペンフレームスライドを取り出します。スライドを90%エタノールに2分間、次に75%エタノールに2分間静かに浸して、スライドを水和させます。

水分を補給したら、スライドを0.5%トインブルーに5〜30秒間静かに浸して、前立腺組織を染色します。スライドを深さの水で15秒間2回洗浄し、続いて75%エタノールを30秒から3分間洗浄して、組織を拘束します。最後に、ペンフレームスライドを氷上のRNAフリー乾燥容器に移します。

手順を開始する前に、スライドをスライドウォーマーに置き、15分間乾燥させます。処理するスライドのみを乾燥させ、残りは必要になるまで氷の上に保存します。LCM コンポーネントを次の順序でオンにします。

顕微鏡の出力、レーザーキー、レーザースイッチ、そしてコンピューター。次に、ソフトウェアを使用してレーザーマイクロダイセクションソフトウェアを起動します。顕微鏡にスライドと収集チューブをロードするように促します。

アンロードサンプルホルダーをクリックし、ティッシュを下に向けてスライドをスライドホルダーにロードします。スライドホルダーを顕微鏡の適切なスロットに挿入し、[続行]をクリックします。次に、収集チューブのアンロードをクリックします。

チューブにラベルを付けてチューブホルダーにロードし、適切なスロットに挿入します。キャップを固定し、35マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。気泡が出ないように注意してください。

コレクションの上限がロードされたら、[OK]をクリックします。ソフトウェアを使用してホルダー内のスライドの位置を選択し、次に標本を収集するための収集キャップを選択します。スライドを視覚化し、コンピューターを通じて10倍の倍率で焦点を合わせます。

ソフトウェアを使用して、レーザーを選択し、レーザーをキャリブレーションします。次に、キャリブレーションを行い、レーザーを選択してレーザーの出力絞りと速度を調整し、制御します。レーザーが組織を完全に切断するまで調整を続けます。

LCMの対象となる組織の望ましい領域を正確に解剖するためには、ボード認定の病理医が通常行う関心のある領域を概説することが重要です 視覚的なガイドとして8×11hおよびe病理学者のマークアップを使用します。ソフトウェアの描画形状ツールを使用して、ビュー内の上皮の目的の領域を囲み、間質の収集を回避します。[カット]をクリックしてレーザーを開始します。

領域が完全に切り取られていない場合は、移動および切り取りツールを使用して手動でその領域を乗り越えます。対物レンズを新しいビューに移動し続け、スライドが完全に解剖されるか、目的の量の組織が収集されるまで、レーザー切断を繰り返します。完了したら、チューブをコレクションホルダーから慎重に取り外し、キャップ内の溶解、緩衝液、組織に注意しながらキャップを閉じます。

簡単に言えば、30秒間遠心分離して、チューブの底に液体と組織を集めます。サンプルを摂氏42度で30分間インキュベートし、RNA単離の準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。これらの例は、良性上皮細胞型特異的コントロールをレーザーキャプチャする前後のペンフレームスライド上の代表的なトルイジンブルー染色前立腺切片を示しています。

組織のレーザー捕捉領域の特異性を確認します。良性上皮および間質。前立腺がん特異的遺伝子A-M-A-C-Rを発現させないでください。

間質は、この手順を試みている間、上皮特異的遺伝子とKX 3.1を発現しませんでした。RNAの分解を防ぐために、RNAフリーの環境で作業することを忘れないでください。このビデオを見た後、凍結組織から上皮細胞またはストーム細胞の均質な集団からRNAを分離し、多数のダウンストリーム分析技術を実現する方法について十分に理解できるはずです。

クライオスタットでの作業は、この手順を実行する際に常にブレードに細心の注意を払う必要がある、適切なトレーニングやブレードへの細心の注意などの予防措置において非常に危険であることを忘れないでください。