Name: 無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぶ無細胞アッセイによる有糸分裂終了時のクロマチン脱凝縮の再構成法。HeLa細胞とXenopus laevis卵抽出液を用いて、細胞周期イベントから分離して生化学的に操作可能なモデル系を構築し、脱凝縮の分子メカニズムを解明します。

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AKSは1＆2が発達セル31（3）、Magalskaから転載されている図にこの作品は、ドイツの研究財団とERC（WAにAN377 / 3-2と309528はCHROMDECON）とベーリンガーインゲルハイムフォンの博士フェローシップによってサポートされていましたら 、有糸分裂、305から318まで、2014年の終わりにクロマチン脱凝縮で、RuvBのようなATPアーゼ機能、エルゼビアからの親切な許可を得て。

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

アフリカツメガエル卵抽出物を忠実にインビトロで細胞プロセスを再現するための非常に有用なツールであり、このシステムは正常細胞周期および細胞分裂事象2、3,5,6,17の特徴付けに使用したアフリカツメガエル 。原因卵形成中の卵に隔離核成分の大型店に、卵抽出物は、細胞成分の優れた供給源です。哺乳動物組織細胞株または遺伝子操作上のRNAiのような他のアプローチと比較すると、それはいくつかの利点があります。無細胞系は、細胞の生存率が他の方法で制限されるであろうで細胞プロセスを研究することができます。さらに複雑なプロセスの一つのステップは、単純なアッセイで分析することができます。ここで紹介する脱凝縮アッセイはそれぞれ、他の有糸分裂のイベントからの干渉なしで有糸分裂後の脱凝縮の分子メカニズムを研究することができます。 アフリカツメガエル卵抽出物は、特定のタンパク質の枯渇により操作が容易ですおよび阻害剤または変異タンパク質8を追加。例えば、 図2は、脱凝縮アッセイに非加水分解性AT...

アフリカツメガエルの卵抽出物は、無細胞アッセイのシンプルで複雑 ​​な細胞事象を研究するための強力かつ広く適用するツールです。 Lohka＆増井1によるそれらの最初の記述以来、彼らは広く、このようなクロマチン凝縮2、スピンドルアセンブリ3、核膜崩壊4だけでなく、核-細胞質間輸送5またはDNA複製6などの有糸分裂のプロセスを研究するために使用されています。例えば、核エンベロープ改革と核膜孔複合体の再構築などinterphasic核の改革のために必要な有糸分裂の終わりで行われているイベントは、はるかに少ない初期の有糸分裂のイベントに比べて理解されているが、同様にアフリカツメガエルの卵抽出物7を使用して研究することができます。我々は最近、有糸分裂8の最後にクロマチン脱凝縮を研究するためにアフリカツメガエルの卵抽出物に基づくアッセイを確立した、アンダー調べプロセスは、私が待っています詳細な特徴づけをtsで。 後生動物では、クロマチンは高度に遺伝物質の忠実な分離を行うために、有糸分裂のエントリに集光されます。クロマチンは、間期中の遺伝子発現およびDNA複製のためにアクセス可能であることを保証するために、それは、有糸分裂の終了時に脱圧縮される必要があります。脊椎動物では、クロマチンは 、Sにおける有糸分裂圧縮は通常はるかに低い酵母、 例えば、2つだけ倍とは対照的に、相間9に比べて有糸分裂の間に複数の圧縮された50倍までですセレビシエ 10。脊椎動物クロマチン脱凝縮は、主に卵の受精後の精子DNAの再編との関連で検討されています。分子機構は、どのヌ、豊富な卵母細胞のタンパク質で、卵に保存されたヒストンH2AとH2Bに精子固有のプロタミンを交換します。このプロセスはまた、 アフリカツメガエル卵抽出物11、12を用いて解明されました。しかし、表現ヌの卵母細胞13と、有糸分裂クロマチンに限定されているこれらの精子固有のプロタミンが含まれていません。したがって、有糸分裂の最後に脱凝縮クロマチンは、8つの独立したヌクレオです。 インビトロ脱凝縮反応のために我々は同期のHeLa細胞から単離された活性化したアフリカツメガエル の卵とクロマチンクラスターから生成されたエキスを使用しています。カルシウムイオノフォアと卵の治療は、受精時の精子のエントリによって生成された卵母細胞へのカルシウム放出を模倣。カルシウム波は最初相間14に進行し、減数分裂の第二中期で逮捕され、細胞周期の再開と卵をトリガします。そのため、フォームアクティブに卵準備卵抽出物は、有糸分裂終了/相間状態を表し、クロマチン脱凝縮、核膜などの有糸分裂終了のための特定のイベントを誘導する能力があると複雑な改革を細孔。有糸分裂CHの単離のためにクラスタromatin我々は、染色体のクラスターが有糸分裂に同期したHeLa細胞からの溶解により放出され、勾配遠心分離によってバッファを含むポリアミンで単離されるガッサー＆レムリ15、によって公開されたプロトコルを少し変更したバージョンを使用していました。

<table><tbody><tr><td>スペルミン四塩酸塩</td><td>フルカ分析</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン三塩酸塩</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>高純度ジギトニン</td><td>ミリポア</td><td>300410-1GM</td><td>有毒</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td>有毒</td></tr><tr><td>チミジン</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>有毒</td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド溶液</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>有毒</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>シグマ</td><td>T8154</td><td>毒性</td></tr><tr><td>1,4-ジチオスレイトール(DTT)</td><td>ロス</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF塩酸塩</td><td>アプリケーションケム</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr>ペ<tr><td>プスタチン</td><td>ロス</td><td>2936.1 / 2/3</td><td></td></tr>ロイ<tr><td>ペプチン</td><td>ロス</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>ロス</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>パーコール(コロイダルシリカ粒子溶液)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; 組織培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー (40 ml ティッシュグラインダー)</td><td>ウィートン</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td><td>アシスト</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;オークリッジ遠心分離チューブ、ポリカーボネート(50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m細胞ストレーナー、ナイロン</td><td>BD、ファルコン</td><td>、352360</td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシン、B</td><td>、Applichem</td><td>、A7657,0010</td>、<td>有毒</td></tr><tr><td>なシクロヘキシミド</td><td>、ロス</td><td>8682.3</td>、<td>有毒</td></tr><tr><td>なL-システイン</td><td>、メルク</td><td>、1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG、Ovogest</td><td>MSD</td><td>として利用可能1431593</td><td></td></tr><tr><td>、PMSGはIntergonan</td><td>MSD</td>として入手可能<td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (カルシウム-マグネシウム-塩の混合)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>有毒</td></tr><tr><td>な注射器の針 (1.20 x 40 mm、18 G x 1 1/2 インチ)</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP、2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>クレアチン、リンファット、二ナトリウム塩</td>、<td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td><td>Σ</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>シグマ</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>TLA</td></tr><tr><td>100 用 毒性遠心分離チューブ (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (先端は大口、1,000 & マイクロ;l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50% グルタルアルデヒド溶液、グレード I</td><td>シグマ アルデリッヒ</td><td>G7651-10 ml</td><td>毒性</td></tr><tr><td>0.1% (w/v) ポリ-L-リジン溶液</td><td>シグマ</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>平底チューブ (6 ml、16.0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 埋込剤</td> ベクター<td>ラボ</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>TLA120用チューブ(11 x 34 mm、7/16 x 1 3/8インチ)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>「セルセーバー」(開口部の広いチップ、200&micro;l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12 mm カバースリップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

脊椎動物の細胞周期中、クロマチンは広範な構造的および機能的変化を受けます。有糸分裂が侵入すると、それは塊状に凝縮して棒状の染色体になり、それらは有糸分裂紡錘体装置によって個別に移動されます。有糸分裂クロマチン凝縮は、間期と同様に50倍密度に圧縮された染色体をもたらします。有糸分裂からの出口の間に、染色体は、核膜で囲まれ、複製と転写に適任な機能的な間期状態を再確立する必要があります。縮合の過程は形態学的にはよく説明されていますが、分子用語ではあまり理解されていません:私たちは、根底にある分子イベントについての知識が不足しており、大部分は関与する要因とその調節についての知識が不足しています。ここでは、同期HeLa細胞とX. laevis卵抽出物から精製した有糸分裂クロマチンクラスターに基づいて、in vitroでクロマチン縮合を忠実に再現する無細胞システムについて説明します。当社の無細胞システムは、クロマチン縮合のさらなる分子特性評価と、核膜や細孔複合体の再集合など、有糸分裂出口中に同時に発生するプロセスとの調整のための重要なツールを提供します。

脱凝縮反応の時間依存性 図1は、脱凝縮アッセイの典型的な時間経過を示します。反応の開始時に目に見える染色体のクラスターがdecondenses、シングル、ラウンドと滑らかな核に合流。卵抽出物は、スクロースで置き換えられたときに染色体クラスタバッファ脱凝縮活性は卵抽出物中に存在することを示唆している、縮合したままです。 クロマチン脱凝縮は、エネルギー依存性のプロセスであります インビトロ脱凝縮反応は、好都合には阻害剤を添加することにより、例えば操作することができます。 図2に示した実験では、非加水分解性ATPまたはGTP類似体、ATPγSまたはGTPγSを反応に添加しました。両方は、ATPとGTP依存、アクティブなプロセス（ 図2）であると、脱凝縮を示すを阻害します。 <p clasS = &quot;jove_content&q...

高度に圧縮された有糸分裂クロマチンの脱凝縮の分子メカニズムは明確に定義されていません。HeLa細胞から単離された有糸分裂クロマチンクラスターとXenopus laevis卵抽出物に基づく無細胞アッセイを提示します。

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

本実験の全体的な目的は、有糸分裂の終わりに起こるクロマチンの脱凝縮を、シンプルな無細胞アッセイにおいて忠実に再構成することです。この手法は、クロマチン脱凝縮の分子メカニズムの特性評価や、その調節に関与する因子の特定を可能にするため、有糸分裂研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、生化学的な操作が容易であり、クロマチンを制御できる点にあります。脱凝縮は、他の細胞周期イベントから切り離して単独で研究することが可能です。まず、付属のテキストプロトコルに従い、helo細胞から有糸分裂期のクロマチンクラスターを単離し、IIC xenopus lavis 卵抽出液調製用のバッファーを準備します。準備が完了したら、27ゲージの針を装着した5mLシリンジを用いて、排卵誘導したカエルに500国際単位のヒト絨毛性ゴナドトロピンを注入します。卵の放出を誘発するため、実験前日の夜にカエルの背側リンフ嚢皮下に注射を行います。誘発後、1.2リットルのMark's modified Ringer's bufferを入れた個別のタンク内で、カエルを18℃で13〜17時間保持します。カエルが産卵した後、すでに活性化している卵および状態の悪い卵を取り除きます。その後、タンクの内容物を600〜1000ミリリットルのガラスビーカーに適切に注いで回収します。卵の選別は、全体の胚品質がこの工程に依存するため非常に重要です。活性化して糸を引いている卵や、その他の外見的に不良な卵を取り除いてください。また、以降の工程においても、引き続き不良卵の除去を行ってください。卵が沈殿したらS上清をデカントし、その後ビーカーに新しいバッファーを満たします。最後の洗浄を含め、この工程を4回繰り返して卵を洗浄します。もう一度上清を取り除き、卵を分離させるためにビーカーに2% L-cysteine溶液を満たします。2〜4分後、L-cysteineを含む新しいバッファーに交換します。約5〜7分後、卵の体積が劇的に減少し、卵がより密に詰まった状態になったときに、脱ゼリー化が完了したと判断します。次に、卵をMark's modified Ringer's bufferで慎重に洗浄します。この際、バッファーを卵に直接かけるのではなく、ビーカーの壁面に沿わせて注ぎ、デカンテーションによる入れ替えを行ってください。次に、2 mg/mLのカルシウムイオンを8 µL含む100 mLのMarx modified ringers buffer中で卵を活性化させます。動物極の収縮が確認できたら、活性化を停止させてください。あるいは、活性化後10分が経過したら、Mark's modified Ringer's緩衝液を用いて、緩衝液を捨てては満たす作業を繰り返すことで卵を慎重に洗浄し、最後の洗浄後は緩衝液を満たしたままにします。卵を室温のMark's modified Ringer's緩衝液中で20分間インキュベートします。次に、5 mL遠心チューブに50 µLのスクロース緩衝液と50 µLの100倍プロテアーゼ阻害剤を分注して準備します。1 M DTTを5 µL、cyclo heideを12.5 µL、およびcytoを2.5 µL混ぜ合わせます。卵を冷 sucrose bufferで2回洗浄し、遠心チューブに移します。開口部の広いプラスチック製パステールピペットを使用し、130 Gで1分間遠心して卵をパッキングします。遠心後、プラスチック製パステールピペットで余分なバッファーを取り除き、空いたスペースにさらに卵を満たします。次に、卵を満たしたチューブを、6 × 5 mLのスイングローターを用いて、4 °C、21,000 ×gで20分間遠心分離します。溶液が3層に分離したら、16ゲージの針を装着した5 mLシリンジをチューブの側面から挿入し、上層の黄色い卵黄と下層の暗色の卵の破片との間の、中間層に到達させます。低速相抽出物を氷上の新しいチューブに移し、100倍濃縮のプロテアーゼ阻害剤を10 µL添加します。1 M DTTを1 µL、20 mg/mLのcyclo heideを2.5 µL、およびcyto Bを0.5 µL混合します。低速抽出液1 mLあたり10 mg/mLをそれぞれ加えます。10 x 2 mLローターを用い、低速分画抽出液を355,000 ×gで12分間遠心分離します。その後、上層の脂質層を慎重に取り除き、高速抽出液を含む上澄みを新しいチューブに移します。この工程は、高品質なサンプルを作製するために極めて重要です。除去する液体に、上層の脂質層や、不純物となる底層が含まれないように注意してください。1.5 mL反応チューブに18 µLの高速抽出液をピペッティングし、次に0.5 µLのグリコーゲンと0.5 µLのエナジーミックスを加えます。3.3 µLの6-dimethylpurineと0.7 µLのmitotic clustersを加えます。クロマチンのせん断を防ぐため、クロマチンを添加した直後に、開口部の広いチップを使用して反応液を混合してください。混合後、反応混合物を20 °Cで最大2時間インキュベートします。次に、4%パラアルデヒド、0.5%グルタルアルデヒド、および0.1 mg/mLのdpiを含む氷冷固定液を0.5 mL加え、サンプルを固定します。開口部の広いチップを用いて、サンプルを氷上で20〜30分間インキュベートします。続いて、0.1% (w/v) のポリLリシン溶液を用いて直径12 mmの円形カバーガラスをコーティングし、カバーガラスの親和性を高めるために5分間インキュベートします。その後、カバーガラスをフィルターペーパーの上で乾燥させます。乾燥後、コーティングされた面を上に向けた状態で、コーティング済みカバーガラスを6 mLの平底遠心チューブの底に入れます。次に、800 µLの30% sucroseクッションを加え、その上に固定済みサンプル全体を層状に載せます。サンプルを4 °C、2,500 ×gで15分間遠心分離します。次に、上澄み液を捨て、16ゲージの針で遠心分離チューブの底を慎重に突き、チューブからカバーガラスを取り出します。針でカバーガラスの一端を持ち上げたら、ピンセットでカバーガラスを取り出し、脱イオン水に浸して素早く洗浄した後、側面をフィルターペーパーに触れさせて静かに乾燥させます。続いて、顕微鏡スライドガラスに封入剤を1滴滴下し、カバーガラスのサンプル側を下にして載せます。封入剤を滴下します。カバーガラスをペーパーワイプでそっと拭き取り、カバーガラスの縁をネイルポリッシュで密封して、イメージングを行うまでスライドを暗所に保管してください。以下は、脱補償アッセイの一般的なタイムコースです。反応開始時に見られる染色体のクラスター（decon）は、凝集して単一の円形で滑らかな核へと融合します。卵抽出液をスクロース緩衝液に置換しても染色体クラスターは凝集したままであることから、卵抽出液中に脱凝集活性が存在することが示唆されます。本実験では、加水分解されない ATP または GTP アナログを反応系に添加しました。これら両方の添加剤は脱凝縮を抑制し、この能動的なプロセスがATPおよびGTP加水分解の両方に依存していることを証明しています。習得すれば、この手法を用いてシンガポールレベルの卵抽出液調製を約2時間で、プロモーター脱コロナイゼーションアッセイを3時間で実施できます。この手順を試みる際は、成功が抽出液の品質に決定的に依存することを忘れないことが重要です。特に免疫除去を行う場合は、本手順に従って調製した新鮮な抽出物を使用することが推奨されます。どの因子が関与しているかなどの追加の疑問を解決するために、免疫除去や組換えタンパク質の添加といった他の手法を行うことも可能です。本手法は、有糸分裂や核の構造および機能の分野の研究者が、動物細胞の有糸分裂終盤に起こるクロマチンの脱凝集を探索するための道を開くものとなるでしょう。このビデオを視聴することで、アフリカツメガエル（Xenopus）肝細胞卵抽出液の調製方法と、その手法を用いてクロマチン脱凝集を再構成させる方法について十分に理解できるはずです。パラホルムアルデヒドやDARPAなどの試薬を取り扱う際は危険が伴うため、手袋の着用など適切な予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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