Name: 宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学ぶ嫌気性菌と宿主細胞の相互作用評価法。Porphyromonas gingivalisを用いて細菌の侵襲・生存を測定し、感染メカニズムの解明に貢献します。

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宮崎博博士、スコット・ヘンダーソン博士、トッド・キトゥン博士、ジャスティン・ハッチャーソン博士、キャサリン・ジョレギ博士、コリン・R・ベリー博士に感謝いたします。この研究は、NIH NIDCRの助成金R01DE016124、R01DE018039、およびJ.P.LewisへのR01DE023304によって支援されました。
>jove_content<顕微鏡検査は、VCU解剖学・神経生物学部の顕微鏡施設で行われ、一部はNIH-NINDSセンターのコアグラント(5P30NS047463)からの資金提供を受けました。

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著者は開示するものは何もありません。

上記のすべての方法は、真核細胞で嫌気性細菌の相互作用を評価するために、特定のアッセイを設計することができます。しかし、成功した実験を行うには、いくつかの考慮事項があります。最初の研究で使用される菌株です。 それは彼らが同じような成長段階にあり、上記の違いと同様の細胞濃度を達成侵入効率13に影響を与えることができること生存アッセイの両方を持つ2つの株の比較ならびに顕微鏡分析により、非常に重要です。成長曲線は、2つの細菌株の間で異なる場合、調整は最終的に一貫性のある濃度21を共有する類似の成長パターンを達成するためになされるべきです。また、細菌は、細胞凝集を避けるために、均一に分散されるべきです。また、効果的に細胞外細菌を除去する抗生物質を選択することが重要です。選択された抗生物質は、宿主細胞に有害な影響を持っている場合、その後代替の抗生物質または溶菌酵素は24,25を使用することができます。最後に、ひずみ不均一性が考慮されなければなりません。種は、宿主細胞に侵入するために識別することができるが、そこに別の26...

嫌気性細菌は、人間の体のほぼすべての面にコロニーを形成します。酸素濃度が低い腸管および尿生殖路の細菌叢において優勢が、それらはまた、皮膚、口、鼻、喉1上に高レベルで存在します。嫌気性細菌は、内因性感染症の一般的な原因であり、病気のサイトから頻繁に分離されています。しかし、その気難しい性質上、嫌気性菌が分離し、培養することは困難です。嫌気性細菌が関与する研究が制限された条件の下で行われなければなりません。現代嫌気培養技術は、研究者は、多くの嫌気性実験室株、あるいは臨床分離2,3を研究するために必要な嫌気性の設定を模倣することができます。 病原性嫌気性細菌は、それらが存在する宿主細胞とのダイナミックな関係と共進化を開発しました。ほとんどの嫌気性菌はinfectiに到達する前に宿主免疫応答による殺傷に影響されやすいです組織単位（OU）レベル。しかし、いくつかの病原性細菌から逃れるか、宿主の免疫応答を破壊するメカニズムを開発しました。彼らは、 ポルフィロモナス・ジンジバリス 、両方の経口に関与し、グラム陰性嫌気性菌。4に信号を送るような免疫認識の回避、免疫メディエーターの中和、細胞性免疫の変化、宿主細胞の浸潤、および免疫の変更などのメカニズムを通じてこの目標を達成し、口外疾患、 ホスト5-7の病原性の変化を引き起こすことができる非常に適合細菌性病原体の一例です。 歯と歯肉粘膜組織との間に形成された深い裂け目に計上バイオフィルムプラークのポケットには、大気中の酸素8から保護されている嫌気性細菌を抱くことができます。これらの歯周ポケットは、P.など、様々な嫌気性病原体のためのニッチとして機能ジンジバリス 9。P.ジンジバリス改造が可能であるキーストン病原体であります歯周病10の発症と進行を促進する方法で、口腔微生物のコミュニティをる。これは、宿主タンパク質の広いスペクトルに対して活性である毒性因子を大量に生成し、宿主防御の回避11ためのメカニズムを提供します。また、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、 および in vitro および in vivo 12-14 15 で歯根膜細胞に侵入することが可能です。効果的に宿主細胞に侵入することにより、P。ジンジバリスは、宿主の免疫を逃れることができます。宿主細胞の効果的な侵入だけでなく、細菌が宿主防御をエスケープすることを可能にするだけでなく、将来の再感染するためのリザーバとして働くだけでなく、宿主細胞を変化させます。宿主細胞が細菌の接着および内在化に関与する分子機構の研究が必要とされています。いくつかの研究室での研究は 、Pの内部に関連する分子事象を理解することに焦点を当てています宿主細胞によってジンジバリス同様に抑制し、免疫応答をハイジャックし、敵対的な宿主防御機構を生き残るために使用されるメカニズムとして。 宿主細胞に侵入することができる病原体を同定し、特徴付けることが可能な多くのアッセイがあります。これは、酸素の不存在下でかさばる器具に依存して研究を行うことが困難であるためしかし、嫌気性病原体によるインビトロ研究は、主に研究者のために多くの実験的な問題を引き起こします。これは、真核細胞が増殖するために酸素を必要とし、従って、組織培養インキュベーター中で別途用意しなければならないという事実によって悪化します。このような障害物を回避する一つの方法は、大気中の酸素の下で研究を行うことであろうが、それは、嫌気性細菌の増殖を不可能にするであろう。別の方法は、感染して宿主細胞の相互作用を研究するために加熱殺菌細菌を使用することであろう。しかし、違いは、ホスト病原体interactiの関連性を低下させる熱殺菌し、生菌の間に存在します16に。これは、宿主細胞との相互作用変更のない表現で生菌を研究するために中央です。 Pを培養するため、方法嫌気性環境におけるジンジバリスが与えられます 。また、2つの簡単なコスト効率の高いプロトコルがPの能力を評価するための実証されヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）によって内在するジンジバリス 。最初のプロトコルは、人気のある抗生物質保護アッセイに基づいています。アッセイは簡単であるが、嫌気性微生物を用いた検討事項が挙げられます。第二プロトコルは、相互作用可視化する蛍光顕微鏡の使用を必要とし、Pを内在化ジンジバリス 。各アッセイは、制限および嫌気性細菌の侵襲性を研究するための研究者に概要を提供するために説明される利点を有します。現在の原稿は 、P を研究しているがジンジバリス及びHUVECを、これらのプロトコルは、他の多くの嫌気性細菌のために使用することができます宿主細胞の他のタイプのように。

<table><tbody><tr><td>ビニール嫌気性チャンバー-タイプB</td><td>コイラボラトリー製品</td><td></td><td>モデル2000インキュベーター&nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II トリプチカーゼ大豆寒天、5% 羊の血液</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞 10 ドナー プール</td><td>LifeLine テクノロジー</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF ミディアム コンプリート キット</td><td>LifeLine テクノロジー</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circular Coverslips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield 埋込剤 with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

嫌気性細菌は、これまで、このような腸、口、膣などの多くのヒトのニッチで好気性菌数を上回ります。また、嫌気性感染は一般的であり、しばしば先住民起源のものです。ヒトの細胞に侵入するためにいくつかの嫌気性病原体の能力は、彼らに先天性免疫を逃れるためだけでなく、宿主細胞の挙動を調節するために、適応策を提供します。しかし、嫌気性細菌は、イベントの実験的調査中に生きていることを確保することが課題を提起することができる。 ポルフィロモナス・ジンジバリス 、グラム陰性嫌気性菌は、真核生物の非食細胞の多様な侵入が可能です。この記事では、成功した文化とは、Pの能力を評価する方法について説明ジンジバリスは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を浸潤します。宿主細胞と相互作用する細菌を可視化するために成功裏に侵入し、宿主内で生存することができる細菌を測定するためのものを、その他：2つのプロトコルが開発されました。これらの技術はanaeの使用を必要とP.を供給する robic室最適な成長のための嫌気性環境でジンジバリス 。 第一のプロトコルは、主に細菌に​​よる宿主細胞の浸潤を研究するために使用される抗生物質保護アッセイに基づいています。しかし、抗生物質保護アッセイは限られています。抗生物質処置および宿主細胞の溶解後に培養可能である唯一の細胞内細菌が測定されます。生と死の両方の宿主細胞と相互作用するすべての細菌を評価するために、我々は、宿主 - 病原体相互作用を調べるために、蛍光顕微鏡を使用するプロトコルを開発しました。細菌は蛍光2 &#39;、7&#39;-ビス - （2-カルボキシエチル）-5-（および-6） - カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（BCECF-AM）で標識し、嫌気性条件下で真核細胞を感染させるために使用されます。 0.2％トリトンX-100で透過処理し、パラホルムアルデヒドで固定した後、宿主細胞は、それぞれ、細胞骨格と細胞核を標識するためのTRITCファロイジンおよびDAPIで標識されます。複数のIMA異なる焦点（Zスタック）で撮影されたGESは、細菌の時空間視覚化のために得られます。本研究で使用した方法は、任意の培養可能嫌気性菌及び任意の真核細胞型に適用することができます。

上記で概説したプロトコルはPとの間の宿主-病原体相互作用を研究に使用しましたジンジバリスおよび内皮細胞。P.ジンジバリス W83 と P. PG0228の欠失を保有するジンジバリス V3150を研究に使用しました。 PG0228は、最終的にPの相互作用に影響を与える可能性があるRNAおよびタンパク質のレベルを変化させることができるタンパク質をコードすることが予測され宿主細胞とジンジバリス 。 P上 PG0228の影響を調査するために、 ジンジバリスの宿主細胞と相互作用する能力、HUVECをと相互に作用する親および変異株の能力を比較しました。生存プロトコル（ 図2）は、この研究に適用しました。両方の株は、このように同じような成長曲線と感染する前に遭遇した細胞数の正常化と有意な問題を抱えて、ステップ2で説明したようにこのように、両方の株は対数増殖期まで増殖させました。インキュベーションの7日後、CFUのは、血液Aで観察されましたGARプレート（ <...

この記事では、宿主内に侵入して生存できる嫌気性細菌を測定するためのプロトコルと、宿主細胞と相互作用する嫌気性細菌を視覚化するためのプロトコルの2つを紹介します。この研究は、培養可能な嫌気性菌および真核細胞の種類に応用できます。

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

このビデオの全体的な目的は、嫌気性細菌とホスト細胞の相互作用を評価するためのプロトコルを実演することです。細胞の培養に使用される条件は嫌気性細菌にとって毒性があり、その逆も同様です。このため、両者の相互作用を研究することは困難であり、研究期間中に代謝活性を維持させるためには、双方にとって最適な条件を達成する必要があります。このような条件は、in vivoで見られる宿主と病原体の相互作用のシナリオをより正確に反映します。本手法は、感染時における嫌気性細菌細胞の結合および内部移行だけでなく、微生物の生存に関与するメカニズムに関する疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて行う方は、嫌気性細菌の取り扱いには嫌気チャンバーの知識と適切な無菌操作技術が必要であるため、習得に苦労する可能性があります。嫌気チャンバーの使用を伴う手順は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。また、Porphyromonas gingivalisの培養および実験において嫌気チャンバーを使用する際は、注意が必要です。ビニール製嫌気チャンバー内は、窒素 80%、水素 10%、二酸化炭素 10%を含む人工大気で維持されています。30枚の血液寒天培地、500 millilitersのPBS、および30 millilitersの血管内皮増殖因子（VEGF）培地を嫌気チャンバー内に配置します。試薬を平衡化させるため、24時間前に、6ウェルプレートの各ウェルに10⁵個のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をVEGF培地中で播種し、細胞接着のため細胞培養インキュベーターに一晩置いておく。付属テキストに記載されている通り、BHI（Brain Heart Infusion）培地でPorro gingivalisの培養液を調製し、660 nmにおける培養液の吸光度が0.5から0.7の範囲になるまで対数増殖期まで培養する。細菌を15 mLチューブに移し、空気の混入を防ぐためキャップにパラフィルムを巻き付ける。次に、嫌気チャンバー内で細菌を5,000 ×gで10分間遠心分離します。ペレット化した細菌を嫌気PBSで洗浄し、再び5,000 ×gで10分間遠心分離します。Reeseは、por ominous transferを用いてHU Xに感染させるため、細菌をVEGF培地に入れています。インキュベーターから嫌気チャンバーへ6ウェルプレートを移し、テストウェルから培地を吸引除去し、嫌気PBSで3回洗浄します。トリパンブルー排除法により、代表的な1つのウェルから細胞数を測定します。その後、各ウェルに嫌気VEGF培地を2 mLずつ加え、プレートを嫌気インキュベーター内で37 °C、20分間静置します。平衡化させるため、細菌の吸光度を測定し、再懸濁します。細菌対細胞の感染多重度（MOI）が100となるように、適切な量のVEGF培地で懸濁します。この細菌懸濁液を細胞に添加し、嫌気チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートして感染させ、細胞内で溶菌させます。宿主細胞と細菌の相互作用を調べるため、BHI培地を用いて1% w/v サポニン溶液を調製し、0.2 µmフィルターでろ過します。6ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、感染培地を吸引して除去します。嫌気性PBSで3回洗浄します。次に、各ウェルにサポニン溶液を2 mL加え、細胞を溶解させるため15分間インキュベートします。次に、ウェル底面から細胞をスクレイピングし、細胞溶解液をBHI培地で1:1に希釈します。その後、1:100から始まる段階希釈を行い、適切な希釈液200 µLを血液寒天培地に塗布します。プレートをperfilで包み、37 °Cの嫌気性インキュベーターで7日間培養し、コロニーを形成させます。次に、ライトボックスを用いて、HU E細胞の感染後における各プレートのコロニー形成単位（CFU）を計測します。細胞を嫌気性PBSで3回洗浄します。続いて、最適化済みの濃度の抗生物質を添加したVEGF培地2 mLをHU E細胞に加えます。細胞を1時間インキュベートし、培地を吸引した後、各ウェルにBHIで調製した1%サポニン溶液を2 mL加え、15分間インキュベートします。次に、溶菌した細胞をスクレイパーで回収し、遠心チューブに溶解物を集めます。溶解物をBHI培地で1:1に希釈し、その後、1:100から始まる段階希釈液を調製します。適切な濃度の血液寒天培地に200 microlitersを分注します。嫌気チャンバー内で細菌を7日間培養し、その後コロニー数を計測します。記述された平板塗布法では、細胞と相互作用した生存細菌のみがカウントされます。この欠点を克服するため、細胞に結合している生存細菌と死滅細菌の両方を可視化できる顕微鏡観察を用います。内部に取り込まれた細菌を可視化するため、まずオートクレーブ済みの容器に無菌的に移します。12ウェルプレートの各ウェルにガラスカバースリップを配置し、カバースリップあたり5×10⁴個の細菌を播種して24時間インキュベートし、細菌をラベル化します。遠心分離を行い、上清を除去して細菌を回収し、嫌気性PBSでペレットを再懸濁させます。再度遠心分離を行い、洗浄工程を繰り返します。5～7×10⁸個の細菌を含む2 mLの嫌気性PBSに、0.2 mMのB-C-E-C-F-A-Mを20 µL添加します。1 mLあたりの細菌を37 °Cで30分間、暗所でインキュベートします。使用する蛍光染料はほとんどの嫌気性細菌を染色できるため、特異的抗体などの他の試薬は必要ありません。細菌懸濁液を5,000 ×gで10分間遠心分離して、未結合の標識試薬を除去し、細菌をVEGF培地で再懸濁します。次に、細菌と細胞の比率を100:1としてUIC細胞に感染させ、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、感染培地を除去し、PBSで細胞を3回洗浄します。その後、4%パラアルデヒドを加え、室温で10分間インキュベートします。嫌気チャンバー内で細胞を固定した後、固定した細胞をチャンバーから取り出し、カバーガラスをPBSで3回洗浄します。細胞を透過させるため、カバーガラスを1 mLの0.2% Triton X-100中で10分間インキュベートします。その後、再びカバーガラスをPBSで3回洗浄します。各カバーガラスに50 µg/mLのTRITC-phalloidinを50 µLずつ加え、室温で45分間インキュベートして細胞内のオリゴマー状アクチンを染色します。インキュベーション後、カバーガラスをPBSで3回洗浄します。1 µg/mLのdappyを含むソフトセット封入剤を滴下したガラススライド上に、カバーガラスを反転させて載せ、核染色を行います。その後、カバーガラスの周囲をマニキュアで密封し、共焦点顕微鏡下で嫌気性細菌の相互作用を観察します。これらの結果には、uveを伴う多孔性歯肉が示されています。細胞、および細胞付着または細胞内細菌を含むライセートを100倍まで連続希釈したところ、血液寒天培地プレート上で計数可能なCFUが得られました。野生型porus vallis W 83感染と欠損変異体V 315感染における、培養7日後の寒天プレート上のCFU収量の比較がここに示されています。この変異は、細菌の感染能力に影響を及ぼします。ここに示されているVEは、感染細胞から得られた細菌コロニーをグラフ化したものです。相互作用を評価したところ、野生株と比較して、感染細胞から回収された変異細菌の数は少なくなりました。抗生物質処理によって細胞外細菌を死滅させた後の結果を右側の列に示します。ここでも、変異株は生存しているuve細胞への浸入効率が低いことがわかります。BCE CFAMで標識することで細菌が観察されます。アクチンフィラメントと細胞核の追加染色は、それぞれ赤色および青色の蛍光で確認できます。これらの手法に習熟すれば、適切に実施することでそれぞれ6時間以内に完了させることが可能です。本手順を行う際は、細菌を嫌気条件下で維持すること、および実験の最大24時間前までに、すべての培地および消耗品を嫌気チャンバー内で平衡化させておくことが重要です。嫌気性病原体を扱う際は極めて危険である可能性があるため、本手順の実施中は、手袋の着用、手洗いの徹底、および無菌操作などの予防措置を常に講じる必要があることに留意してください。したがって、本手法は歯周病原体の知見を得るために有用です。また、誤嚥、肺炎、腹腔内感染症、婦人科感染症など、人体内のさまざまな部位に見られる多くの嫌気性感染症などの他のシステムにも応用可能です。この手法の意義は、プロトコルに抑制措置を容易に追加でき、治療後の内部移行を直接測定できるため、さまざまな嫌気性病原体に対する薬物療法へと拡大します。このビデオを視聴することで、嫌気性細菌の培養方法と、それらが宿主細胞と相互作用する能力を評価する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

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宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

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