Name: 可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ創傷スクラッチアッセイによるマウス肺間葉系幹細胞の移動能測定法。可溶性タバコ煙抽出物による損傷後の細胞挙動変化を定量的に評価し、肺再生生物学の重要課題解明に貢献します。

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私たちは、CSE損傷アッセイの開発における彼らの技術支援と、このアッセイの開発中の彼らの支援と助言に対して、ラボの他のメンバーに感謝しています。さらに、ニコラス・コーミエを支援してくださったホーリークロス・フェンウィック奨学生委員会と、アレクサンダー・ヨーを支援してくださったホーリークロス・カレッジ・オナーズ・プログラムに感謝します。

注：この研究では、遠位の肺組織からの肺の間葉系幹細胞（LR-MSCを）を単離のいずれかの細胞表面マーカーの発現（CD45の陰性 、CD31のNEG、SCA-1高 、のEpCAM NEG）14,15に基づいて、使用していましたアウト・成長16植片、または酵素消化17を使用 。接着LR-MSCは、高グルコース無グルタミン、15％FBS、1×抗生物質/抗真菌剤、および2mMグルタミン（以下、完全培地）を含むDMEM中で培養し、37℃、5％CO 2でインキュベートしました。 LR-MSCは移動アッセイのために、比較的均一な増殖特性を有する細胞の集団を確保するために3~4回継代しました。 コンフルエント単層の準備1 <ol><li>標準の100mm培養皿からMSCを取り外すには、37℃で予め温めておいた10mlのPBSで細胞を洗浄、PBSを吸引し、トリプシンの4ミリリットル（0.25％）を追加します。 37℃のインキュベーター中で3-5分間インキュベート。 Cを吸引5分がダウン細胞ペレットにするための円錐管にellsは、300gで完全なメディアや遠心分離機の同等のボリュームを追加します。 注：トリプシンでのより長いインキュベーションは、細胞表面受容体を変化させ、潜在的に移行に影響を与えることができます。 </li><li>培地を吸引し、新鮮な完全培地中に再懸濁細胞。トリパンブルー排除を用いて死細胞を除くと60ミリメートルの細胞培養皿上の完全培地4mlの500,000間葉系幹細胞をプレート、細胞をカウントします。 注：細胞の供給源に依存して、テストが必要な細胞の最適な数を決定する必要があるかもしれません。 </li><li>プレートは、最適な細胞の付着および増殖のための90％コンフルエント、MSCのために通常48〜72時間になるまで細胞をインキュベートします。 注：多くの足場依存性細胞は、その遊走能を変更することができる接触阻害を経験するので、100％のコンフルエンスは、推奨されません。画像解析ソフトウェアは、ギャップを解釈するので、80％未満のコンフルエンスでプレートを使用できない写真になりますスクラッチの周囲の一部として、細胞間のS（ 図1Dを参照してください ）。 </li><li>細胞が90％コンフルエンスに達した後は、アプリケーションに応じて細胞を損傷。可溶性タバコの煙抽出物（CSE）への曝露後の細胞損傷を評価するために、2分18以上の吸引ビン内の完全培地25ミリリットル1〜ケンタッキー大学の研究タバコ（3R4F）から煙を描画することにより、100％のCSEを生成します。 </li><li>完全培地中で希釈した4ミリリットル1〜4％のCSEで24時間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、4ミリリットル新鮮な完全培地と交換する前に、暖かい滅菌PBS 4mlで細胞を2回洗浄します。 注：タバコ煙抽出物の高濃度の損なう細胞（&gt; 5％）は、実質的に合流を低減することができます。 </li></ol> 2.スクラッチの作成<ol><li>無菌環境では、損傷したMSCの60ミリメートルプレートからふたを削除し、ストレートエッジを築く（例えば滅菌済みプラスチック定規）交流ロスプレートの上部リム。メディアを削除せずに、約5mm離れてプレート全体で1個から4個の並列傷や長い50ミリメートルを作るために、無菌のストレートエッジによって導かれた無菌の200μlのピペットチップを使用しています。 注意：ストレートエッジは、顕微鏡のステージ上にあるときプレートに必要な回転の調整の量を最小限に抑えることができます。それは傷が画面上に完全に垂直（または水平）表示されることが不可欠です。 60 mmのプレートに複数の傷を生成する細胞移動を（データは示していない）に影響を与えるように微小環境を変化させないが、他の細胞タイプを考慮してもよいです。ウェルの縁の近くに増殖する細胞の変動がより顕著になり、傷の均一な世代に影響を与える可能性があるため、より小さい井戸の使用が推奨されていません。 </li><li>培地を吸引し、穏やかに傷の中心に付着する細胞を防ぐために、予め温めた完全培地2mlでプレートを洗浄し、細胞を除去するためにスクラッチによって緩めてきたの。新鮮な完全培地4mlで交換してください。 </li><li>無菌の永久的なマーカーを使用して、傷を画像化すると干渉しない位置でプレートの下に1-4からの各スクラッチラベルを付けます。 注：スクラッチ幅にばらつきがある場合もありますので、それは、同じスクラッチからの画像が前と移行後に比較することが重要です。 </li></ol> 3.スクラッチの初期画像を撮影注：スクラッチアッセイは複数のプレート上で実行されている場合、それは傷が次のプレートの上に作られています前に、単一のプレート上のすべての傷の初期画像が取られることをお勧めします。 <ol><li>分析に必要な画像を生成するカメラで倒立位相差顕微鏡を使用します。 </li><li>顕微鏡上で培養プレートを置き、スクラッチ＃1を見つけるために、低消費電力の目標（10倍）を使用します。培養プレートの蓋に結露が明確IMAGを妨害した場合細胞のeは、37℃に加熱されたステージセットを使用します。 </li><li>完全に水平方向と視野の中心にスクラッチを維持、傷の長さの90％を包含することを必要な限り多くの画像を得ます。画像間の重複がないとスクラッチの異なる部分の画像を取得します。 注：培養皿の縁で光の屈折が分析するためにそれらを不可能に、画像をover​​exposes。そのため、傷の長さの最初と最後の5％から画像を取ることはありません。 </li><li>別のフォルダに各一から画像を保存します。 </li><li>繰り返し傷2、3のための3.2から3.4、および手順4。 </li><li>すぐに最初の画像の後にインキュベーターにプレートを返します。細胞は4-7時間に移行しましょう​​。 注意：CSEで損傷したMSCを評価する際に7時間が最適です。細胞増殖は、細胞移動のための交絡変数として作用することができるので、より大きく7時間細胞をインキュベートする（オプション注以下の8.2を参照）が推奨されていません。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。初期傷の画像の解析<ol><li> ImageJのをダウンロードして、創傷治癒ツールプラグインをインストール（材料/機器の表を参照）。 </li><li> ImageJの中の画像ファイルを開き、「プロセス」をクリックして、スクラッチ領域（ 図2B）を計算するためにツールを創傷治癒のためのスクラッチを周囲の細胞を強調するために「エッジを探します」。次に、「画像」、「調整」「カラーしきい値」と「しきい​​値の色」と表示されたドロップダウンメニューで値を変更する]をクリックし、「白黒」を</li><li>傷やセル前面との間の最適なコントラストが達成されるまで、「カラーしきい値」メニュー内では、両方の明るさしきい値スライダを調整します。画像のコントラストを作成しようとしたとき、最大の範囲を可能に右（完全に黒画像）に完全に底のスライダを移動し、最大コントラストを生成するためにトップのスライダーを調整します。 </li><li>ゆっくりとトップBRIを調整画像がきれいにスクラッチ（ 図2C）の輪郭が表示されるまで、左から右にghtnessスライダー。スクラッチのエッジが識別されると、スクラッチ領域を強調するために（つまり、ImageJのツールバーに表示されます）、ImageJのツールバーの「その他のツール」をクリックし、ドロップダウンメニューから「MRI_Wound_Healing_Tool」を選択し、「M」ボタンを押してくださいそして、出力結果ポップアウトウィンドウ （図2D）で計算されたエリア。 </li><li>コピーし、Excelスプレッドシートに結果画面（ 図2E）からすべての数字を貼り付けます。個々の傷からデータを分離することを確認します。 </li></ol> 5.スクラッチの最終画像を撮影<ol><li>細胞は（4-7時間）に移行した後、繰り返しは3.2から3.4を繰り返します。画像各プレート上の細胞が移動に等しい時間があったように、彼らは傷されたのと同じ順序でプレート。 注：細胞は、センシに応じて、複数の時点で撮像することができます両方の温度およびpH変化にtivity。また、ライブセルイメージングは​​、彼らが移行するとリアルタイムで細胞を追跡するために使用することができます。 </li></ol> 6.最終的なスクラッチ画像の解析<ol><li>繰り返し、最終的なスクラッチ画像の4.2から4.5を繰り返します。 </li></ol> 7.移行を定量化するためのスクラッチ領域を計算します<ol><li>それぞれの傷の初期面積値を平均することにより平均移行前の面積を計算します。 </li><li>平均移行前のエリア（ステップ7.1）から、ステップ6で算出された各画像のための最終的な移行領域を減算することによって、移行の合計金額を計算します。移行の変化を表す各スクラッチの値のリストを生成します。 </li><li>プール同じ試験群（ すなわち、全てのプレートと0％CSEに曝露された細胞上のすべての傷）内に複数の傷からのデータ。実験群間の差を分析するために分散テストの分析を使用してください。 </li><li>細胞は移行遅い場合及び（10-12時間よりも大きい）をスクラッチした後に、より長いインキュベーション時間を必要とし、細胞が遊走アッセイが発生している期間中に増殖を受けているかどうかを決定するのBrDUまたはEDU取り込みアッセイ19を実行します 。有意な細胞増殖を避けるために、遊走アッセイ時間を選択してください。 </li></ol> 8.オプション<ol><li>有意な細胞老化は、スクラッチの手順の結果として発生しているかどうかを評価するために、19に傷をつけた後、所定の時間に試験板の老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイを行います。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明するプロトコルは、スクラッチアッセイを実施し、分析するための定量的堅牢な、標準化された方法を提供します。単純なスクラッチアッセイは日常的に細胞の遊走を調べるために、研究のさまざまな分野で使用されています。しかし、伝統的にスクラッチアッセイは再現7,10の問題につながっている、標準化されたセットアップと定量化プロトコルを欠いていました。スクラッチアッセイを改善するための改変および最適化の多くは、個々の生細胞画像化、標準化されたストッパーに基づくアッセイ、および三次元マイクロピラーアッセイ4,8,10を含む、これらの問題が、減少しています。しかしながら、これらのアッセイは、カスタマイズまたは10を適合させることが困難であることができ、いくつかの用途のために、これらの技術はまた、法外な費用がかかることができます。 標準化されたスクラッチアッセイプロトコルを生成するために、細胞のinvolに関する特定の情報を必要とし、ここで提示したプロトコルのいくつかの重要なステップがありますVED、およびアッセイの最適化は、関連...

細胞移動は、組織開発、修理、再生、ならびにがんの転移や動脈硬化1と病理学的過程として多くの生理学的プロセスに非常に協調的かつ不可欠です。細胞遊走の理解は、損傷を受けた組織を修復し、細胞移植技術と2グラフト人工組織などの病理学的状態を治療するために使用される新規治療薬に特に関連します。厳密に、定量化適応可能で、かつコスト効率が重要であるアッセイを用いてこれらの細胞の遊走能を定量化する、組織修復3の媒介における間葉系間質細胞（MSC）の役割現在の関心を考えます。重要なことは、このようなアッセイは、損傷後の細胞遊走能が比較的微妙な変化を検出するのに十分な感度でなければなりません。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ（ボイデンCH含む細胞遊走を定量するための現在の方法は、琥珀）、マイクロピラーアレイ、および細胞排他ゾーンアッセイは再現性、カスタマイズ、定量化、および費用対効果1,4,5の制限の範囲を有します。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは堅牢な成果、定量化、および画像ベースの解析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。 スクラッチアッセイは、種々の実験条件5下で細胞の遊走および増殖を評価するために、複数の容量で使用されてきました。アッセイは、またはそれに近い合流を完了するためにそれらを成長、指定された細胞を播種し、滅菌針またはピペットチップ6と、得られた単層を傷つけ伴います。分析は、最も一般的に、ランダムに選択された位置7-9における複数の時点にわたるスクラッチの幅を比較することによって行われます。その顕著な使用にもかかわらず、スクラッチアッセイは、再現性と定量化の問題によって混乱されます。変動でスクラッチの発生だけでなく、細胞の微小環境を変化させるだけでなく、プレート表面とその下の細胞外マトリックス5を損傷することによって細胞遊走を阻害することができます。アッセイは、しばしば12時間に7にわたって実施されている、しかし、より遅い移行と長い分析時間を表示する細胞株について、増殖が交絡変数7,10になります。最後に、スクラッチ・プロセスによって生成された老化細胞は、単層1のギャップを埋めるために必要な細胞外シグナル伝達を妨害因子を放出することができます。スクラッチアッセイの最適化は、アッセイ時間の長さを最小にし、操作中の望ましくない細胞死を防止、表面特性を妨害しない一貫したギャップの生成を必要とします。ストッパーベースのアッセイは、細胞の除外ゾーンアッセイの最適化です。このアッセイは、細胞増殖を除外ウェルの中央に配置されたストッパを利用するが、細胞が中央排除区域の周囲にメッキされることを可能にします。移行を評価するために、ストッパーを除去し、得られた排他ゾーンは、移行が発生するための表面を提供します。しかし、このアッセイは、10のカスタマイズ又は適合させることが困難であり、いくつかの用途のために、この技術はまた、法外な費用がかかることができます。 スクラッチアッセイおよびその誘導体、トランスウェル遊走アッセイ（またはボイデンチャンバーアッセイ）とは対照的に走化性剤8,11を含むチャンバ内に、微孔性ろ過膜を介して、一方のチャンバから移動する細胞の数を定量化することによって、マイグレーションを評価します、 12。多孔質膜を介した移行後、細胞は走化性薬剤に暴露された膜面に付着し、正確に定量化することは難しいことができますので、この技術は、MSCのような接着細胞のための有用性を制限しています。アッセイは、いくつかの三次元の移動パターンを検査することができるが、制限された細胞型はれる正確細胞移動の制限その有用性を定量化することができ、10。スクラッチアッセイの別の方法としては、変形し、代理として配列中に移行する細胞の能力を用いて3次元空間を介して細胞運動性を測定したマイクロピラーアレイを使用しています。 Polydimethlysiloxane（PDMS）エラストマーは、精密金型の上に硬化させ、オゾンで処理し、フィブロネクチンは、均質で非分解性微小環境を生成します。 アレイ 4 を入力する細胞の能力を測定するために、必要に応じてマイクロピラーの間隔も変化させることができます。金型は、高アスペクト比のアレイ 13の負のバージョンを作成するために、シリコンウエハの深い反応性イオンエッチングを使用して作成されます。アッセイは、そのカスタマイズによって強化されている間、移動細胞の直接可視化を介して三次元の移行、および分析をモデル化する能力は、マイクロピラーのアレイを作成する際の難しさは、経済的にその普及を妨げます。 このプロトコルで説明最適化されたスクラッチアッセイは、効率的な、COSを提供自由に利用可能なソフトウェアを用いて分析することができる一貫した傷を製造するためのT-有効な方法。代わりに、細胞移動の前後にスクラッチを介して行われる単純な幅の測定、ソフトウェアは、移行前と後の合計スクラッチ領域を決定することを可能にします。この進歩は、傷が幅測定が行われるべき場所を決定しようとしているの発行を制限し、傷の幅はそれの長さに沿って均一であるかどうか。また、細胞数、細胞の種類と合流し、細胞にダメージの程度の注意深い最適化がさらに分析を最適化するために議論されています。

<table><tbody><tr><td>DMEM(高グルコース、グルタミン無添加)</td><td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>TypeLE cell dissociation reagent</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン標準60mm組織培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド滅菌200 &mu;l ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>カメラアタッチメント付き倒立光学顕微鏡</td><td>Variable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MRI_Wound_Healingプラグイン</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>統計解析ソフト</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

細胞の移動は、組織の発達、修復、再生、癌の転移、炎症反応など、多くの生理学的および病理学的プロセスにとって不可欠です。組織修復の媒介における間葉系間質細胞の役割に対する現在の関心を考えると、これらの細胞の遊走能力を定量化し、損傷後に遊走能力がどのように変化するかを理解することに関心があります。カスタマイズが容易で、費用対効果が高い厳密な定量的遊走アッセイの最適化は、さまざまな刺激に応答した細胞遊走の変化に関する質問に答えるための鍵です。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ(ボイデンチャンバー)、マイクロピラーアレイ、細胞排除ゾーンアッセイなど、細胞遊走を定量するための現在の方法には、再現性、カスタマイズ性、定量性、および費用対効果にさまざまな制限があります。スクラッチアッセイは、その顕著な使用にもかかわらず、細胞微小環境の損傷、細胞遊走の障害、隣接する老化細胞の影響、細胞増殖に関連する再現性の問題、および厳密な定量の欠如によって混乱しています。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは、堅牢な結果、定量化可能な画像ベースの分析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。

ここで提示スクラッチアッセイは、マウスの肺常駐間葉系間質細胞（LR-MSCS）を使用して実施し、プロトコル・ノートで参照として単離しました。 LR-MSCは、60 mmの組織培養皿中の500,000個の細胞の密度で播種し、48時間で90％コンフルエンスまで増殖させました。損傷を生成するために、4％のCSEは、（上述の）初期播種期間後24時間が、スクラッチアッセイの前に細胞とともにインキュベートしました。各アッセイのために、傷を200μlのピペットチップを使用して生成されました。傷が生成された後の初期の画像が撮影された、と緩んで細胞や破片は、完全培地で洗い流されていました。 図1AおよびBに示すように、適切な合流は、イメージングソフトウェアが正常に傷の境界を識別できるようにすることが重要です。 図1Cに示されるように、細胞は、（いずれかのために不十分な播種密度の、不十分なINC十分にコンフルエントでありません簡単にイメージングソフトウェア（ 図1D）で区別されていない異種の境界を有する傷をもたらすことができるubation回、または過度の...

移動能力は、間葉系間質細胞(MSC)を含む多くの異なる細胞タイプの重要な機能です。しかし、被害後の回遊能力の変化を定量化することは困難です。このプロトコルは、損傷後のMSC遊走能力の変化を定量化するために厳密な統計を使用する、容易に適応可能な遊走アッセイを説明しています。

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

本アッセイの全体的な目的は、水溶性タバコ煙抽出液による損傷後の肺間葉系ストローマ細胞における遊走能の変化を検出することです。この手法は、肺の修復を促進するために肺前駆細胞の遊走能をどのように向上させることができるかなど、肺再生生物学分野における重要な課題を解決するために利用できます。本手法の主な利点は、経済的に実施可能であり、カスタマイズが容易である一方で、細胞遊走のより優れた定量的測定を提供できるよう最適化されていることです。本デモンストレーションでは、スクラッチアッセイを用いて、マウス肺間葉系幹細胞（MSC）の遊走能を定量します。水溶性タバコ煙抽出液に曝露させた後、MSCを60 mmプレート上の完全培地で培養し、プロトコルの本文に記載されている手順で損傷を与えます。スクラッチアッセイにおいては、画像解析ソフトがスクラッチの境界を正確に識別できるようにするため、適切なコンフルエンスの状態にすることが重要です。この例では、滅菌環境下でのスクラッチ処理に適した、コンフルエンスが95%に達したMSCを示しています。損傷を与えたMSCのプレートから蓋を取り外し、滅菌済みプラスチック定規などの直線的な定規をプレートの上端に沿って置きます。直線的な定規を使用することで、後にイメージングのために顕微鏡ステージにプレートを設置する際の回転調整の手間を最小限に抑えることができます。培地を除去せずに、滅菌済みの直線状ガイドを用いて滅菌済みの200 µLピペットチップで、プレート上に約5 mm間隔で長さ50 mmの平行なスクラッチを4本作成します。60 mmプレートに複数のスクラッチを作成しても、MSCの細胞遊走に影響を与えるような微小環境の変化は生じませんが、他の細胞種では考慮が必要な場合があります。培地を吸引し、あらかじめ温めておいた2 mLの完全培地でプレートを優しく洗浄します。これにより、細胞がスクラッチの中央に付着することを防ぎ、スクラッチによって剥がれた細胞を除去します。4 mLの新鮮な完全培地に交換し、滅菌済みの油性マーカーを使用して、イメージングの妨げにならないプレート底面の位置に、各スクラッチに1から4までの番号を付けます。スクラッチの幅にはばらつきがある可能性があるため、同一のスクラッチにおける遊走前後の画像を比較することが重要であり、各スクラッチの初期画像を取得する必要があります。スクラッチアッセイを複数のプレートで実施する場合、次のプレートにスクラッチを設ける前に、単一プレート上のすべてのスクラッチの初期画像を撮影することを推奨します。解析に必要な画像の取得には、カメラ付き倒立位相差顕微鏡を使用してください。培養プレートを顕微鏡に設置し、低倍率対物レンズを用いてスクラッチの位置を確認します。1つ目。スクラッチが画面上で完全に水平に見えるようにすることが不可欠です。スクラッチを完全に水平に保ち、視野の中心に配置した状態で、スクラッチの長さの90%をカバーするのに必要な枚数の画像を撮影してください。画像同士に重複がないように、スクラッチの異なる領域から画像を撮影します。培養皿の端での光の屈折によって画像が白飛びし、解析不能になるため、スクラッチ全長の最初と最後の5%分は画像撮影しないでください。1番目のスクラッチから得た画像をフォルダに保存します。2番目、3番目、および4番目のスクラッチについても同様に画像を撮影し、それぞれのスクラッチの画像を別々のフォルダに保存してください。最初のイメージング後、直ちにプレートをインキュベーターに戻します。このアッセイを開始する前に、4〜7時間細胞を遊走させます。Image Jソフトウェアをダウンロードし、wound healing toolプラグインをインストールします。ImageJで画像ファイルを開き、[Process]から[Find Edges]をクリックして、wound healingツール用にスクラッチ周囲の細胞を強調します。スクラッチ面積を算出するには、[Image]から[Adjust]、続いて[Color Threshold]をクリックし、[Threshold Color]のドロップダウンメニューで値をBNWに変更します。下のスライダーを完全に右に動かして画像を完全に黒にし、次に上のスライダーを調整して、スクラッチと細胞前縁のコントラストを最大にします。上の明るさスライダーを左から右へゆっくりと調整し、傷の輪郭が鮮明に表示されるようにします。傷の端が特定されたら、「more tools」をクリックします。image Jツールバーのドロップダウンメニューから「MRI wound healing tool」を選択し、「M」ボタンを押して傷の領域をハイライトし、算出された面積を出力します。結果のポップアウトウィンドウで、結果ウィンドウ内のすべての数値をコピーし、Excelスプレッドシートに貼り付けます。個々のスクラッチからのデータが分かれていることを確認してください。細胞が4〜7時間移動した後、スクラッチ画像の画像取得手順を繰り返します。各プレート上の細胞が均等な時間だけ移動するように、スクラッチを行った時と同じ順序でプレートを撮影してください。温度およびpHの変化に対する細胞の感受性に応じて、複数のタイムポイントでイメージングを行うことができます。最終的なスクラッチ画像は、初期のスクラッチ画像で示した方法と同様に、Image Jを用いて解析します。また、遊走を定量化するためにスクラッチ面積を算出することも可能です。スクラッチアッセイを成功させるには、コンフルエンスが極めて重要です。ここでは、95%コンフルエンスにおけるマウス肺MSCの適切なスクラッチ例を示しています。対照的に、70%コンフルエンスでは低すぎるため、適切にスクラッチできず、偽の境界線が生じる可能性があります。これらは、イメージングソフトウェアによって定義されたスクラッチ領域の境界を示す、移行前および移行後の代表的なオリジナル画像である。これらのグラフは、95%コンフルエントなマウス肺MSCのプレートに作成した4箇所のスクラッチについて、0%または4%のタバコ煙抽出物に曝露させた後の移行前後の平均算出スクラッチ面積（ピクセル）を示している。算出された平均スクラッチ面積の変化を比較した結果、4%タバコ煙抽出物に曝露させた後のマウス肺MSCでは、移行が抑制されていることが明らかになった。本手順を実施する際は、使用する細胞株に合わせて細胞のコンフルエンスを最適化し、注意深くモニタリングすること、また、スクラッチが可能な限り均一になるよう作製練習を重ねることが重要です。本手順に続き、免疫組織化学などの他の手法を行うことで、細胞遊走に影響を及ぼす可能性のある変化やタンパク質発現に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

特定の疾患の病態生理学を理解し、治療介入のための新しい戦略を特定するために、早期の内皮細胞(EEC)の移動の調査が重要です。次のプロトコルは、EECの調査に適応した細胞遊走を評価する技術について説明しています。...

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顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

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ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。...

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

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また、機器を多用する方法を用いずに細胞移動を決定する新しい手法を提供する、スクラッチ移行アッセイにコスト効率の高い方法を提示します。線維芽細胞はこのプロトコルで使用されたが、それは適応され、細胞の移動に影響を追加の細胞タイプおよび影響を研究するために利用することができる。...

コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

インタラクション体験設計とユーザー要件分析を組み込むことで、再現性、信頼性、実用性、細胞完全性、ユーザーエクスペリエンスの観点から細胞創傷治癒アッセイを強化する革新的な細胞スクレーパーを導入します。...

細胞創傷治癒アッセイの信頼性を向上させるための、安定した再現性のある無細胞ギャップを自動的に作成するツール

この研究では、2次元(2D)スクラッチ創傷移動アッセイと3次元(3D)スフェロイドスプラウティングアッセイ、およびRNA抽出や免疫細胞化学などのそれぞれのダウンストリーム分析方法が、 in...

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

ここでは、マウス気道上皮細胞を単離および分化するための in vitro...

タバコ煙抽出物で刺激したマウス気道上皮細胞上のマルチオミクスの分化と変化を研究するためのin vitroモデル

学ぶ創傷スクラッチアッセイによるマウス肺間葉系幹細胞の移動能測定法。可溶性タバコ煙抽出物による損傷後の細胞挙動変化を定量的に評価し、肺再生生物学の重要課題解明に貢献します。

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

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