パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

この方法論の全体的な目標は、死後のパーキンソン病の脳から可溶性および不溶性のα-シヌクレインを抽出することです。この方法は、パーキンソン病の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、一般的な実験室の試薬と機器を使用する比較的簡単な手法であることです。

必要な溶液と緩衝液を調製した後、凍結大脳基底核組織の0.5グラムのサンプルを小さなペトリ皿に置くことから始めます。滅菌メスの刃を使用して、1ミリメートル四方の断片にすばやく細かく刻みます。ひき肉にした組織を15ミリリットルのチューブに集め、チューブに10容量の氷冷、1X TBSを加えます。

機械式ホモジナイザーを使用して、20, 000 rpm で 10 秒間サンプルを均質化します。その後、氷の上で2分間冷まします。均質化を3回繰り返し、毎回氷の上で冷却します。

ホモジネートを10, 000gで摂氏4度で5分間遠心分離します。粗ホモジネート上清をポリカーボネート製遠心チューブに移し、摂氏4度で1時間、100, 000gで遠心分離します。上清を氷上の冷却チューブに移し、これをTBS可溶性画分として保持します。

5容量の1X TBSバッファーで洗浄し、摂氏4度で100, 000 gで15分間遠心分離します。上清を吸引して捨てます。その後、洗濯を繰り返します。

超遠心分離ステップの間にペレットを徹底的に洗浄することは、この手順を成功させるために重要です。SDSの沈殿を避けるためにサンプルを摂氏10度の温度に到達させた後、5容量の1X TBS-SDSを追加し、室温で20キロヘルツで10秒間超音波処理することにより、最終的なペレットを再懸濁します。100, 000 gs で 25°C で 30 分間超遠心分離します。

超遠心分離後、上清を氷上の冷却チューブに移し、SDS可溶性画分として保持します。ペレットに5容量の室温1X TBS-SDSバッファーを加え、摂氏25度で100, 000gで15分間遠心分離します。洗浄バッファーを廃棄し、洗浄を繰り返します。

上清を捨てた後、50マイクロリットルの1X TBS-SDS-尿素を加え、20キロヘルツに設定されたソニケーターを使用して10秒間可溶化します。このサンプルを尿素可溶性画分としてラベル付けします。手順ですべての不溶性タンパク質が抽出されることを徹底的に確認することが不可欠です。

TBS-SDS-尿素サンプルを1X TBSバッファーで1対1に希釈してタンパク質アッセイ試薬との適合性を確保し、市販のタンパク質アッセイキットを使用して各画分の総タンパク質含有量をメーカーのプロトコルに従ってアッセイします。サンプルを10%グリセロールを含む20マイクロリットルのアリコートに分注して、将来の凍結融解サイクルを減らし、摂氏マイナス80度で保存します。TBS、TBS-SDS、およびTBS-SDS-尿素抽出物10マイクロリットルを分子量マーカーに10ウェル、4〜12%のBis-Trisポリアクリルアミドゲル、MOPSをランニングバッファーとして標準的な技術を使用してロードします。

ゲルを200ボルトで1時間、またはローディングバッファーからの青色色素がゲルの底に達するまで泳がせます。ナイロンメンブレンを100%メタノールで濡らし、次いで20%メタノールを含む転写緩衝液に浸します。ブロットに識別マークを付けて、タンパク質側と分子量サイズマーカーの配向を決定します。

湿った濾紙と一緒にゲルをメンブレンで挟みます。40ボルトで2時間の転送を実行します。1X PBS-T中の5%BSA溶液を70 rpmで振とうしながら30分間ブロックし、一次抗体のメンブレンへの非特異的結合を防ぎます。

PBS-Tで1〜750に希釈したα-シヌクレイン一次抗体Syn-1を6ミリリットル、摂氏4度で一晩インキュベートして、タンパク質ブロットをプローブします。翌日、メンブレンを1X PBS-Tで3回、毎回5分間洗浄します。次に、PBS-Tで1〜2,000に希釈した適切なHRP標識二次抗体とブロットを30分間インキュベー

前と同じようにメンブレンを1X PBS-Tで洗浄します。ブロットを、製造元の指示に従って強化された化学発光溶液に浸し、暗い部屋で保管します。しみをラップフィルムで覆い、オートラジオグラフィーを使用して信号をキャプチャします。

イメージング後、ウェスタンブロットを6ミリリットルのウェスタンブロットストリッピングバッファーと10分間インキュベートし、絶えず振とうしながら、α-シヌクレイン抗体シグナルのブロットをストリッピングします。ウェスタンブロット手順を繰り返して、ベータアクチン一次抗体でメンブレンを1〜8, 000希釈でプローブします。最終画像をスキャンしてTiff画像に変換し、定量目的でNIH ImageJを使用して密度を測定します。

以下の画像は、PDおよび制御ヒト大脳基底核組織由来のα-シヌクレインレベルの代表的なイムノブロットです。TBS、SDS、および尿素可溶性画分を、ウェスタンイムノブロットを使用してα-シヌクレインの存在について分析しました。10ミリグラムのタンパク質が各レーンにロードされました。

TBS画分では、α-シヌクレインモノマーがすべての場合に存在します。アスタリスクは、α-シヌクレインのC末端切り捨て型を表している可能性があります。SDS画分では、α-シヌクレインの一部のオリゴマーがモノマーとともに見られ、PD組織では固体の矢印で示されています。

尿素画分では、モノマー、オリゴマー、および凝集α-シヌクレインは、それぞれのレビー小体負荷を反映して、PDケースでばらばらに発現します。神経学的に正常な対照サンプルは、少量の単量体α-シヌクレインのみの存在を示しています。このタンパク質抽出技術を習得すれば、1営業日以内に行うことができ、適切に実施されれば翌日にはウェスタンイムノブロットを行うことができます。

その開発後、この技術は、レビー小体生物学の分野の研究者が、病理学的ヒト組織および生体内動物モデルにおける不溶性および凝集したα-シヌクレイン種を探索する道を開きました。固定されていないヒト組織を扱う作業には予防措置が必要であり、すべての取り扱い手順で手袋と白衣を着用する必要があることを忘れないでください。