パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出
January 5th, 2016
ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。
この方法論の全体的な目標は、死後のパーキンソン病の脳から可溶性および不溶性のα-シヌクレインを抽出することです。この方法は、パーキンソン病の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、一般的な実験室の試薬と機器を使用する比較的簡単な手法であることです。
必要な溶液と緩衝液を調製した後、凍結大脳基底核組織の0.5グラムのサンプルを小さなペトリ皿に置くことから始めます。滅菌メスの刃を使用して、1ミリメートル四方の断片にすばやく細かく刻みます。ひき肉にした組織を15ミリリットルのチューブに集め、チューブに10容量の氷冷、1X TBSを加えます。
機械式ホモジナイザーを使用して、20, 000 rpm で 10 秒間サンプルを均質化します。その後、氷の上で2分間冷まします。均質化を3回繰り返し、毎回氷の上で冷却します。
ホモジネートを10, 000gで摂氏4度で5分間遠心分離します。粗ホモジネート上清をポリカーボネート製遠心チューブに移し、摂氏4度で1時間、100, 000gで遠心分離します。上清を氷上の冷却チューブに移し、これをTBS可溶性画分として保持します。
5容量の1X TBSバッファーで洗浄し、摂氏4度で100, 000 gで15分間遠心分離します。上清を吸引して捨てます。その後、洗濯を繰り返します。
超遠心分離ステップの間にペレットを徹底的に洗浄することは、この手順を成功させるために重要です。SDSの沈殿を避けるためにサンプルを摂氏10度の温度に到達させた後、5容量の1X TBS-SDSを追加し、室温で20キロヘルツで10秒間超音波処理することにより、最終的なペレットを再懸濁します。100, 000 gs で 25°C で 30 分間超遠心分離します。
超遠心分離後、上清を氷上の冷却チューブに移し、SDS可溶性画分として保持します。ペレットに5容量の室温1X TBS-SDSバッファーを加え、摂氏25度で100, 000gで15分間遠心分離します。洗浄バッファーを廃棄し、洗浄を繰り返します。
上清を捨てた後、50マイクロリットルの1X TBS-SDS-尿素を加え、20キロヘルツに設定されたソニケーターを使用して10秒間可溶化します。このサンプルを尿素可溶性画分としてラベル付けします。手順ですべての不溶性タンパク質が抽出されることを徹底的に確認することが不可欠です。
TBS-SDS-尿素サンプルを1X TBSバッファーで1対1に希釈してタンパク質アッセイ試薬との適合性を確保し、市販のタンパク質アッセイキットを使用して各画分の総タンパク質含有量をメーカーのプロトコルに従ってアッセイします。サンプルを10%グリセロールを含む20マイクロリットルのアリコートに分注して、将来の凍結融解サイクルを減らし、摂氏マイナス80度で保存します。TBS、TBS-SDS、およびTBS-SDS-尿素抽出物10マイクロリットルを分子量マーカーに10ウェル、4〜12%のBis-Trisポリアクリルアミドゲル、MOPSをランニングバッファーとして標準的な技術を使用してロードします。
ゲルを200ボルトで1時間、またはローディングバッファーからの青色色素がゲルの底に達するまで泳がせます。ナイロンメンブレンを100%メタノールで濡らし、次いで20%メタノールを含む転写緩衝液に浸します。ブロットに識別マークを付けて、タンパク質側と分子量サイズマーカーの配向を決定します。
湿った濾紙と一緒にゲルをメンブレンで挟みます。40ボルトで2時間の転送を実行します。1X PBS-T中の5%BSA溶液を70 rpmで振とうしながら30分間ブロックし、一次抗体のメンブレンへの非特異的結合を防ぎます。
PBS-Tで1〜750に希釈したα-シヌクレイン一次抗体Syn-1を6ミリリットル、摂氏4度で一晩インキュベートして、タンパク質ブロットをプローブします。翌日、メンブレンを1X PBS-Tで3回、毎回5分間洗浄します。次に、PBS-Tで1〜2,000に希釈した適切なHRP標識二次抗体とブロットを30分間インキュベー
トします。前と同じようにメンブレンを1X PBS-Tで洗浄します。ブロットを、製造元の指示に従って強化された化学発光溶液に浸し、暗い部屋で保管します。しみをラップフィルムで覆い、オートラジオグラフィーを使用して信号をキャプチャします。
イメージング後、ウェスタンブロットを6ミリリットルのウェスタンブロットストリッピングバッファーと10分間インキュベートし、絶えず振とうしながら、α-シヌクレイン抗体シグナルのブロットをストリッピングします。ウェスタンブロット手順を繰り返して、ベータアクチン一次抗体でメンブレンを1〜8, 000希釈でプローブします。最終画像をスキャンしてTiff画像に変換し、定量目的でNIH ImageJを使用して密度を測定します。
以下の画像は、PDおよび制御ヒト大脳基底核組織由来のα-シヌクレインレベルの代表的なイムノブロットです。TBS、SDS、および尿素可溶性画分を、ウェスタンイムノブロットを使用してα-シヌクレインの存在について分析しました。10ミリグラムのタンパク質が各レーンにロードされました。
TBS画分では、α-シヌクレインモノマーがすべての場合に存在します。アスタリスクは、α-シヌクレインのC末端切り捨て型を表している可能性があります。SDS画分では、α-シヌクレインの一部のオリゴマーがモノマーとともに見られ、PD組織では固体の矢印で示されています。
尿素画分では、モノマー、オリゴマー、および凝集α-シヌクレインは、それぞれのレビー小体負荷を反映して、PDケースでばらばらに発現します。神経学的に正常な対照サンプルは、少量の単量体α-シヌクレインのみの存在を示しています。このタンパク質抽出技術を習得すれば、1営業日以内に行うことができ、適切に実施されれば翌日にはウェスタンイムノブロットを行うことができます。
その開発後、この技術は、レビー小体生物学の分野の研究者が、病理学的ヒト組織および生体内動物モデルにおける不溶性および凝集したα-シヌクレイン種を探索する道を開きました。固定されていないヒト組織を扱う作業には予防措置が必要であり、すべての取り扱い手順で手袋と白衣を着用する必要があることを忘れないでください。
概要
この記事は、パーキンソン病におけるその凝集特性に焦点を当て、死後ヒト脳組織からアルファ・シヌクレインを分離するためのプロトコルを提示します。この方法は、アルファ・シヌクレインの可溶性および不溶性形態の両方を分析するために、様々な強度の洗剤と超遠心分離技術を使用します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- パーキンソン病研究
背景
- アルファ・シヌクレインはパーキンソン病に関与する重要なタンパク質です。
- その凝集を理解することで、疾患メカニズムへの洞察が得られます。
- 研究は分析のために死後ヒト脳組織を使用します。
- 一般的な実験室試薬と機器が手順に使用されます。
研究目的
- パーキンソン病患者の脳から可溶性および不溶性アルファ・シヌクレインを抽出し分析すること。
- アルファ・シヌクレイン凝集の可変特性を調査すること。
- 分野の研究者のための簡単な方法論を開発すること。
使用された方法
- 組織ホモジネートのための溶液と緩衝液の調製。
- 可溶性および不溶性画分を分離するための超遠心分離。
- アルファ・シヌクレインレベルを検出するためのウェスタンブロッティング。
- 市販の検査キットを使用したタンパク質含有量の定量。
主要な結果
- 異なる画分でアルファ・シヌクレインモノマーとオリゴマーが同定されました。
- パーキンソン病（PD）と対照サンプル間でアルファ・シヌクレイン発現に変動が見られました。
- この技術は病理学的組織におけるタンパク質凝集の分析を可能にします。
- 慎重な洗浄ステップを通じて不溶性タンパク質の抽出に成功しました。
結論
- この方法論はパーキンソン病におけるアルファ・シヌクレインの研究を容易にします。
- 研究者がヒト組織におけるタンパク質凝集を探索することを可能にします。
- プロトコルを実行することで、1日以内に結果を得ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to quantify soluble and insoluble alpha-synuclein species from human brain tissue, providing a biochemical readout of pathological aggregation relevant to Parkinson's disease target validation. By isolating progressively insoluble fractions, the method supports mechanistic de-risking of alpha-synuclein as a therapeutic target and informs assay development for oligomer-specific therapeutics. The approach offers a standardized workflow for evaluating target engagement and aggregation-modulating compounds in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of alpha-synuclein oligomerization and fibrillization states in disease-relevant human tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible biochemical assay to distinguish monomeric, oligomeric, and aggregated alpha-synuclein pools.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating insoluble alpha-synuclein burden with pathological Lewy body load.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates fraction-specific extracts compatible with western blotting and ELISA for oligomer-selective antibody screening.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment (homogenizer, ultracentrifuge, sonicator) enabling assay scalability across discovery teams.
- Assay Readiness: Delivers quantifiable protein outputs per fraction, supporting dose-response analysis of aggregation-modulating compounds.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates cross-species comparison of alpha-synuclein pathology in transgenic models versus human tissue.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of insoluble alpha-synuclein accumulation as a pharmacodynamic biomarker.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement by linking biochemical target modulation to pathological burden reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling biochemical assessment of alpha-synuclein modulation prior to phenotypic screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about alpha-synuclein aggregation kinetics and species-specific toxicity in human-derived systems.
- Screening: Prepares standardized biological inputs for high-sensitivity detection of oligomeric alpha-synuclein in antibody or small-molecule screens.
- Analytics: Yields fraction-specific quantitative readouts (via immunoblot densitometry) to compare treatment effects on soluble versus insoluble pools.
- Translational Research: Connects in vitro target engagement to biochemical pathology in human tissue, supporting biomarker qualification.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for alpha-synuclein quantification across multiple projects and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving distinct alpha-synuclein species implicated in Parkinson's disease pathogenesis.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized wash and ultracentrifugation steps critical for isolating insoluble proteins.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative aggregation data to prioritize compounds with target-specific effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted compound prioritization based on dose-dependent reduction of insoluble alpha-synuclein.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, ultracentrifugation, and western blotting for accurate fraction separation and detection.
- Dependent on access to ultracentrifuge, sonicator, and standard molecular biology reagents (TBS, SDS, urea, BSA).
- Necessitates cross-team standardization of wash protocols to prevent cross-contamination between soluble and insoluble fractions.
- Adaptation to animal models requires optimization of tissue input weight and homogenization efficiency for consistent recovery.
- Practical limitation: Incomplete washing between steps may lead to fraction contamination, affecting quantification accuracy.
