Name: シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチンインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法によるシロイヌナズナのタンパク質-DNA相互作用解析。遺伝子発現制御メカニズムを解明し、植物発生過程におけるクロマチン動態を捉える有用な手法です。

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著者は、このジャーナルに掲載された一部のデータを使用して、図4で説明した代表的な結果を詳しく説明することを許可してくれたThe Plant Cellに感謝したいと思います。この作業は、EU の 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965) とスペインの Ministerio de Economìa y Competitividad (助成金 BIO2010-15589 および BIO2013-43098-R) の支援を受けました。

植物材料の1架橋（1時間） <ol><li>シロイヌナズナの実験に用いたライン成長（ - WT - 野生型変異体対を、および/またはタグを表すライン対目的のタンパク質のタグ付けされたバージョンを表す線は、任意のタンパク質を融合していない）大きなペトリ皿に12-18日間（150 mm）のMS寒天培地（1 L：1×ムラシゲ・スクーグ塩、10gのスクロース、0.5グラムのMES、pHを5.7（KOH）、1％寒天）。土壌やバーミキュライトの1ミックス：別の方法として、3を含む鉢に植物を育てます。 注意！ホルムアルデヒドは皮膚に接触し、飲み込む、吸入による毒性があり、かつ、適切な個人用保護具を着用し、化学フード内で処理する必要があります。 1.2手順 - 1.6はヒュームフードの下で実行する必要があります。 </li><li>実験室のバーナー加熱針を用いて50 mlチューブの蓋に小さな穴を作ります。 1％の最終濃度になるように1×PBS 40mlの緩衝液追加の1.08 mlのホルムアルデヒド（37％ストック秒olution）。これらの50mlチューブに植物材料の1.5グラムを収集します。架橋の間にチューブを氷上に保管してください。 </li><li>蓋を用いて50 mlチューブを閉じます。デシケーターにチューブを配置し、真空を適用します。真空は、ソリューションをかき回す防止するために、慎重に真空を解除した後、10分間の組織に潜入。サンプルを混ぜます。二回繰り返します。浸透後、植物材料を観察し、それがわずかに半透明になっていることを確認し、チューブ（ 図2）の底に沈む傾向にあります。 </li><li> 5分間真空を適用する0.125 Mの最終濃度を達成するために2 Mグリシン2.5mlのを追加します。グリシンは、ホルムアルデヒド架橋の競合的阻害剤として機能します。 </li><li>蓋の穴と、閉じた50mlのチューブを反転させ、PBSホルムアルデヒド - グリシンソリューションを捨てます。 </li><li> 1×PBSで2回苗木をすすぎ、一度ステップ1.5で説明したように水が洗浄溶液を廃棄しています。ペーパータオルの上にそれらを乾燥させ、液体nitrogeに凍結N。 注：凍結組織は、数週間のために-80℃で保存することができます。 </li></ol>抗体の調製（1日） 注：免疫沈降のために、タンパク質Gまたはタンパク質抗体の重鎖の定常ドメインのための高い親和性を有するリンカーを介して抗体と結合させた磁気ビーズを使用することが推奨されます。 DNA-タンパク質複合体は、ビーズ - 抗体複合体の表面に非特異的に接続することができます。そのため、非特異的バックグラウンドを定量化するために特異的な抗体なしのコントロールを行う必要があります。 <ol><li>各免疫沈降のために1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の磁気ビーズの15μlのを準備します。ビーズの量は、免疫沈降のために、また、抗体上で使用されるクロマチンの量に依存します。 </li><li> 、洗浄ビーズにクロマチン免疫沈降（チップ）の希釈緩衝液1mlを追加し、回転させることにより混合し、1.5ミリリットルの微量TUを配置するには磁気ラックになります。ビーズが磁石に付着させるために約1分待ちます。まだラック1.5 mlマイクロチューブを使用すると、ピペットで上清を除去します。二回繰り返します。 注：各植物系統の場合は2免疫沈降セットが必要とされている：ビーズと抗体（Ab）を持つ唯一の磁気ビーズを有する第二抗体なし（無AB）コントロール。 </li><li> ChIPの希釈緩衝液200μlでビーズを再懸濁します。 （正確な希釈は、各抗体のために異なり、実験的に最適化されなければならないか、市販の抗体の場合には、製造業者の指示に従ってください）​​各植物系統のために調製した2つの管のいずれかに特異的Abの必要な量を追加します。免疫沈降のために、このサンプルを使用してください。ネガティブコントロールとして使用される他のチューブへの非特異的IgGの同じ量を加えます。 </li><li>抗体はビーズに付着させるために4℃で回転ホイール上でO / Nインキュベートします。 </li></ol> 3.クロマチン抽出（4時間） </p&gt; <ol><li>粉末が均一とライトグリーンになるまで乳鉢と乳棒を用いて徹底的に液体窒素中で凍結した植物材料を粉砕します。新しい50mlチューブに粉を転送します。 </li><li>手順3.2 - 3.6、ヒュームフードの下で働きます。抽出緩衝液1（のExB 1）の30ミリリットルを追加し、組織粉末を浸してよく混ぜます。上のこの段階で、すべての回で、4℃でサンプルを保ちます。凍結組織と液体窒素残り物は、バッファがフリーズする原因となります。チューブを4-5回2分毎に反転させることにより、完全に凍結組織を解凍してください。 </li><li> 4℃で20分間、1000×gで新しい50mlのチューブと遠心分離機にに22〜25ミクロンの孔サイズを有するろ過組織を通過させることにより、スラリーをクリアします。 注：このステップでは、核とすべての細胞小器官は、ペレット化されます。 ExB 1は、高密度を提供し、細胞小器官の構造の破壊を防止するのに十分なショ糖が含まれています。 </li><li>静かにデカンテーションにより上澄み液を除去します。この駅でGEは、約2 mlと緑のペレットを観察します。 </li><li> ExB 5ml中のペレットを再懸濁ペレットの再懸濁2は、この時点では困難になります。 4℃で10分間1,000×gで遠心分離します。 注：のExB 2が開いて葉緑体を破裂助け、クロロフィルを除去するために、1％トリトンX-100が含まれています。 </li><li>抽出緩衝液3（のExB 3）300μlの中にペレットを再懸濁。 </li><li>きれいな微量遠心管では、ステップ3.6から再懸濁したペレットを取り、慎重にきれいなのExB 3の上に層3のExBの600μlを添加します。 </li><li> 4℃で16,000×gで1時間スピン。 注：この手順は、サンプルから界面活性剤を除去することができます。 </li><li>ピペットで吸引することにより、上清を取り除きます。ゆっくりと超音波処理の効率に影響を与える可能性がある、泡の形成を避けるために、上下にピペッティングにより超音波処理バッファー300μlの中で核ペレットを再懸濁します。慎重にすべてのサスペンションをピペットと新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。 注：このバッファは、核を溶解し、クロマチンを解放するために、SDSが含まれています。 </li><li>核を溶解し、ランダムに小さな断片にクロマチンをせん断するサスペンションを超音波処理。 （材料/試薬の表に記載され使用可能な超音波処理装置4℃で設定30秒ON / 30秒OFFで20〜30サイクル）を200〜800塩基対の間の断片が濃縮されたクロマチンをレンダリングする超音波処理条件を使用してください。超音波処理クロマチンの2μL（ 図3）をロード 、アガロースゲル13で得られたDNA断片の電気泳動分離によって、超音波処理の効率性を確認してください。 注意！超音波装置は、防音キャビネット内に含まれていない場合には、超音波処理工程の間に耳の保護具を着用することを確認します。 重要なステップ！クロマチンの断片化は、主に超音波処理装置に依存します。超音波処理条件は、適切なDNAサイズの濃縮を達成するように調整されるべきです。見るクロマチンの断片化を最適化する方法の例については、図3。 </li><li> 4℃で10分間12,000×gで一度ソリューションをスピン。新しい1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで上清を転送します。ペレットを廃棄します。 -20℃で入力し、凍結としてマークし、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清の1/10を取ります。 </li><li> 0.1％の最終濃度までSDSを希釈するためのChIP希釈緩衝液で10倍に希釈するクロマチン。 注：サンプルは、数週間凍結させ、-20℃で保存することができます。 </li></ol>目的のタンパク質とDNAの救助の4免疫沈降（1日、3時間） <ol><li>ステップ2.2で説明したように、過剰の抗体を除去するためのChIP希釈緩衝液1mlで3回ステップ2.4​​からAbでコーティングしたビーズを洗ってください。 ChIPの希釈緩衝液200μl中に再懸濁します。分離されたクロマチン50μlのを追加します。 4℃で回転ホイール上でO / Nインキュベートします。 注：concentratiをチェック微量紫外可視分光光度計でのクロマチンの上。分離されたクロマチン50μlのDNAの10以上のμgのを含める必要があります。 </li><li> 4℃のステップ4.2から4.5までの仕事のために。ステップ2.2で説明したように低塩洗浄緩衝液1ml中に二回ビーズを洗浄します。 </li><li>高塩洗浄緩衝液1mlに一度ビーズを洗ってください。 </li><li> LiClを洗浄緩衝液1mlに一度ビーズを洗ってください。 </li><li> TE緩衝液1ml中に二回ビーズを洗浄します。最後の洗浄後、完全にピペットで吸引してチューブ内に残されたTE緩衝液を除去してください。 </li><li>入力サンプル（ステップ3.9）を取り出します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移し、INPUTの5μLを、チップのサンプルのように続けます。 5％のキレートイオン交換樹脂の200μLを添加することにより架橋逆転、すべて2~3分間振盪し、95℃で10分間インキュベートします。 30秒間16,000×gでスピンダウンし、注意深くピペッティングにより新しいマイクロチューブに上清を移します。 注：TRAながら反転の架橋ditional方法は、したがって、プロトコル一日短くなって、効率的な脱架橋および10分でのDNAの溶出を可能にするのNaCl、95℃でのキレートイオン樹脂とのインキュベーションでのO / Nインキュベーションすることを含みます。 </li><li>プロテイナーゼK（10mg / ml）を2μlを添加し、タンパク質を消化し、DNAを放出するために、37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 10分間95℃でインキュベートすることによって反応を停止させます。 </li><li>すぐに30秒間16,000×gでスピンし、ピペッティングにより上清を新しいチューブに移します。 </li><li> DNAをきれいに標準的なDNA断片を精製キットを用いて単離しました。 注：製造元の指示に従って進んでください。 </li><li>新しい1.5 mLのマイクロ遠心チューブにキットからのDNA結合列を転送します。列の中央にDNアーゼを含まない水20μlを添加し、60秒間16,000×gで回転させて精製されたDNAを溶出します。ポイントを停止し、試料を数週間-80℃で保存することができます。 </li></オール&gt; 5.定量PCR（4時間）によって免疫沈降したDNA中の結合部位の存在量を測定します注：沈殿クロマチンから分離されたDNAは、その関心のあるタンパク質に結合し、総クロマチンからのChIP-EDされたDNA断片を決定するために分析されなければなりません。 <ol><li> 60℃の融解温度（Tm）は、30％-80％のGC含量を有する関心のあるゲノム領域の設計プライマー。クロマチンを超音波処理によって断片化されているように、増幅された配列の長さは150〜200ヌクレオチド（ 表1）よりも長くてはなりません。 注：プライマー設計のための有用なツールは、プライマー3プログラム（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）です。プライマー設計のための追加のガイドラインは以前の報告8、14,15でご利用いただけます。 </li><li>プライマーが特異的であることを確認してください（特にプロモーターは同様のTF結合配列を共有することができます）とプライマー効率のusinを​​テストするためにBLASTプログラムを使用してくださいGインプットDNA（ステップ4.9）の水で1:10希釈液。ゲノムの特定の領域は、他のものより優れて精製されます。これは、PCRプライマーを設計し、希釈された入力DNAにそれらを確認することが重要です。 </li><li>各反応のためのPCRチューブに水とピペットで希釈したDNAの5μLを精製されたDNA 1:10に希釈します。 注：DNAを1.5 mlマイクロチューブの壁に取り付けることができますように、必要な量だけを希釈します。複数の融解凍結サイクルが添付されたDNA分子の数を増やします。各プライマー対は、入力での増幅のために、抗体チップと無抗体チップを分析する必要があります。 </li><li> PCRミックスを完了するために、1×最終濃度のSYBR Green PCRマスターミックスを追加し、各プライマー0.5μM。 DNアーゼを含まない水で20μlに埋めます。 </li><li> SYBRグリーンPCRマスターミックスの製造業者の指示に従って定量PCR反応を実行します。 </li></ol> 6.データ解析注：元のうち、ChIPのデータを分析する方法をisting二つの最も一般的に使用されます。それらの最初のも、「無抗体対照に対して &#39;&#39;相対的濃縮」、「バックグラウンドを超えるシグナル」またはという名前の倍の濃縮方法です。第二の方法は、「入力の％」と命名されます。 <ol><li>倍の濃縮法によるデータ解析。 <ol><li>サンプル名および定量PCR反応後に得られた生のCt値とのスプレッドシートを作成します。 </li><li>各サンプルについて、その生のCt値から、対応する無Abの制御のために得られた生のCt値を差し引きます。注：この数学的な操作の後、無抗体サンプルのCt値が0に等しくなります。 </li><li>ベース2とステップ6.1.2（ 表2）で得られた負の剰余に等しい指数（パワー）で指数演算によって倍の濃縮を計算します。 濃縮を倍= 2 - （CT（サンプル） - CT（無AB）） 注：このメトでDのChIP-EDの試料中の特定のDNA断片の存在量は、無抗体コントロールでこのフラグメントの豊富と比較されます。この方法の前提は、バックグラウンドシグナルのレベルが異なるプライマーセット、サンプル、および複製の実験の間に再現性があることです。しかし、この&#39;noise&#39;信号レベルは、プライマーセット、サンプル、実験の間で変化しません。 </li></ol></li><li>入力方法の何％でデータ分析。 <ol><li>サンプル名および定量PCR反応後の彼らのために得られた生のCt値とのスプレッドシートを作成します。 </li><li>入力とした総抽出クロマチンの画分から対数の底2の値を減算することにより、入力サンプルの生Ct値を調整します。 注：合計クロマチンの10％は、このプロトコルで入力としたように、このプロトコルでは減算値は、3.32に等しいです。ログイン2（10）は3.32に等しいです。 </li><li> 100でBと指数演算の値を乗算することにより、入力の％を計算します2アーゼサンプル（ 表3）の生のCt値から減算調整された入力値の残りの部分に等しい指数（電力）。 入力の％= 100 * 2 （調整された入力- CT（サンプル）） 注：この手順で、総孤立クロマチン（入力サンプル）へのChIP-EDの試料中の特定のDNA豊富との関係を計算します。チップデータの分析に関するさらなる詳細は、ヘリングらに記載されています。8。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明のChIPプロトコールは、タンパク質およびアラビドプシス植物の in vivo での特定のDNA配列間の相互作用を分析するための再現可能かつ強力な技術です。目的のタンパク質の結合部位の同定に成功し、関連する相互作用が実際に行われている植物器官や発達段階を適切に選択する必要があります。また、植物材料の適切な固定および超音波処理によりクロマチンの最適な剪断を得ることが重要です。選択されたタンパク質/タグの効率的な免疫沈降のための高度に特異的な抗体も不可欠です。 植物におけるチップアプローチの使用は、潜在的プロトコルにおける異なるステップに干渉する可能性が二次代謝産物と細胞壁の存在に関連するいくつかの困難に直面しています。また、植物器官の複雑さは、多くの場合、複数の細胞型を含む場合に整数のDNA結合タンパク質erestは異なって存在またはアクティブにすることができ、この方法論の使用を妨げてきました。そのため、可能な限り、それはチップ内に使用​​することが最も有利であることは存在および/または目的のタンパク質の活性は、既に実証されている均質な組...

近年中に、分子遺伝学的ツールおよびゲノムの広い範囲は、モデル種のシロイヌナズナで開発されてきました。この技術は、植物の開発が規制されている方法を理解する上で非常に進歩を促進してきました。モデルとしてシロイヌナズナを用いて研究し、発達過程の中で、開花時期の遺伝的制御が広範囲に解析されています。これらの研究は、植物は非常に正確にそのようなホルモンや植物の年齢などの内因性手がかりに、また季節1の自然なサイクルで開花時期を同期させるような日長や温度などの環境シグナルに応答して開花時期を調節することが示されています2。開花の時間変化を有するシロイヌナズナ変異体の単離および特性は、内因性および環境要因に応じて開花時期を調節する遺伝子の複雑なネットワークを発表における決定要因となっています。これらの遺伝子回路は、開花のスイッチとして機能するいくつかのマスター遺伝子のレベルで統合され、花芽の正確なタイミングは、開花促進し、花のインテグレータ遺伝子1,3の上流に働くの活動を抑制するのバランスに依存しています。 ゲノムアプローチの最近の使用によって支援開花開始の制御におけるその役割のために同定された遺伝子の機能解析は、開花時期の調節における転写制御の中心的な役割を明らかにしました。実際には、開花エンコード転写のマスター遺伝子の多くは、4因子 。また、クロマチンリモデリングタンパク質複合体の数は、開花のマスター遺伝子の発現に影響を​​与えます。それらの変化した開花時のために単離さシロイヌナズナ変異体の数は、クロマチン修飾因子の様々なコード化する遺伝子に変異を有することが判明しました。ヒストンで翻訳後修飾を導入異なるクロマチン改築Eテール、ヒストンバリアントによって標準的なヒストンはシロイヌナズナ5,6の開花の適切なレギュレーションのために必要であるDNAまたは交換する相対ヌクレオソームの位置を変更します。これらのクロマチンリモデリング活動のいくつかは、特定のヒストン残基におけるアセチル化やメチル化などの共有結合修飾の堆積または除去を触媒します。これらのヒストンマークは特に開花遺伝子の転写活性を調節するために、他のクロマチンリモデリング複合体、転写因子または転写機構の成分を補充する特殊なエフェクターによって認識されます。 クロマチン免疫沈降（チップ）は、目的のタンパク質のためのin vivoでの DNA結合部位の同定（ 図1）ことができます。この手順は、DNAに架橋タンパク質の特定の化学物質の能力を利用します。得られたDNA-タンパク質複合体は、次いで、特異的抗体AGAを用いて免疫沈降することができ選択したタンパク質に結合instの転写因子、クロマチン結合タンパク質、または特定の改変および異種エピトープ（一般に「タグ」と呼ばれます）。これらの免疫沈降物から精製されたDNAは、目的の特定の配列の濃縮のために評価するために定量的PCR（定量PCR）反応における鋳型として使用することができます。この方法では、転写因子の結合部位または特定の遺伝子でのヒストンマークの分布が7,8を確立することができます。また、大規模並列シーケンシングを可能にする次世代シーケンシング（NGS）と合わせ、チップ​​技術は、転写因子の結合部位のゲノムワイドな識別だけでなく、ヒストン修飾の除幕式エピ風景を可能にしました。さらに、遺伝子発現の同時分析は、転写調節因子の結合または特定のヒストンマークの堆積は転写activiと相関方法をモニタリングできます遺伝子9のTY。 シロイヌナズナにおけるチッププロトコルの使用は、転写調節因子の様々な開花とどのようにこれらの構造変化は、遺伝子発現に影響を与える5,6のマスター遺伝子のクロマチン組織に与える影響を評価することができました。以前の結果は 、短い日でシロイヌナズナ遺伝子座早期抽苔 （EBS）は 、この遺伝子のショーに開花し、開花FTのマスター遺伝子のアップレギュレーションの加速度を開花し、変異体のリプレッサーとして機能することを示しました。また、FTにおける機能喪失型変異は完全にFTが EBS変異体の早期の開花およびEBS 10開花このマスター遺伝子の抑制のために必要であることが必要であることを示す、EBS変異体植物の初期開花表現型を抑制、11は、EBS は、具体的には 、ヒストンH3のジ-に結合し、目にすることができるトリメチルPHDを含むタンパク質をコードしますFT 12のクロマチン媒介抑制におけるEBSの役割を示唆している電子のリジン残基4（H3K4me2 / 3）、。 ChIPのアプローチの使用は、シロイヌナズナPHD含有タンパク質EBS 10,11は、その発現12を抑制するために花のインテグレータ遺伝子FTの調節領域に結合することを実証しました。チップ技術の使用によって得られる追加のデータは、このタンパク質は、シロイヌナズナの開発の初期段階で開花のこのマスター遺伝子のクロマチンにおけるヒストンアセチル化、活性な転写の顕著な特徴の低レベルを維持するために必要とされることを示しました。一緒に、遺伝子および遺伝子発現データを有するこれらの観察は、このシロイヌナズナPHD含有タンパク質は、花の積分FT遺伝子12の発現を調節することにより、開花時間の微調整において中心的な役割を有していることを示しています。ここで紹介する作品は、ヒストンの分析のためだけでなく、他のためだけでなく、有益な最適化された方法を提供し、タンパク質、および効率の向上と低下し、実験時間に関連するクロマチン。また、この報告書は、チップ・プロトコルの使用は、クロマチンの修飾の変化や植物遺伝子の転写状態、およびシロイヌナズナの開花の発症に遺伝子発現制御への影響をどのようにこれらのクロマチン媒介機構との関係に新たな洞察を提供している様子を示しています。

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (村重とスクーグの基礎塩混合物)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37%&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>F8775-25</td><td>ヒュームフード下での使用</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤ミックス cOmplete ULTRA錠、ミニ、EDTAフリー、EASYpack</td><td>ロシュ</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>バイオラプター 標準超音波処理装置</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 磁気ビーズとプロテインAまたはプロテインGの組み合わせ</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>メーカーを確認する抗体親和性</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr><tr><td>(マウス、ラット、ウサギ&hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックラック - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac ポリクローナル抗体 - プレミアム&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag 抗体、クローン 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

シロイヌナズナタンパク質-dna相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

複雑な遺伝子制御ネットワークは、植物の生物学的プロセスと発生移行を調整します。遺伝子の選択的転写活性化とサイレンシングは、環境シグナルと発生の手がかりに対する植物の応答を媒介します。したがって、植物の遺伝子発現を制御するメカニズムへの洞察は、植物の生物学的プロセスがどのように制御されているかを深く理解するために不可欠です。ここで説明するクロマチン免疫沈降(ChIP)技術は、モデル種であるシロイヌナズナの遺伝子またはゲノム領域におけるタンパク質のDNA結合部位を同定する手順です。転写因子、クロマチンタンパク質、翻訳後修飾ヒストンなどの目的タンパク質のDNAとの相互作用は、ChIPプロトコルで効率的に解析できます。この方法は、in vivoでのタンパク質-DNA相互作用の固定、クロマチンのランダム断片化、特定の抗体とのタンパク質-DNA複合体の免疫沈降、およびPCR技術による目的のタンパク質に関連するDNAの定量に基づいています。シロイヌナズナにおけるこの方法論の使用は、さまざまな植物の生物学的プロセスを制御する転写調節メカニズムの解明に大きく貢献しています。このアプローチにより、シロイヌナズナクロマチンタンパク質EBSの結合部位を開花FTのマスター遺伝子の調節領域に同定することができました。このタンパク質がFTのゲノム領域における特定のヒストンマークの蓄積に及ぼす影響も、ChIP解析によって明らかになりました。

エイト主な手順は、成長し、植物材料、クロマチンの架橋、クロマチン分離、クロマチンの断片化、DNAとの間の複合体の選択的単離の収穫など、in vivoでのタンパク質-DNA相互作用の同定のために、このチッププロトコルに白羽することができます免疫沈降、タンパク質の消化、DNA精製、およびqPCR分析による目的のタンパク質（ 図1）。 ChIPプロトコルにおける重要なステップは、架橋反応におけるDNA-タンパク質相互作用の固定です。典型的には、ホルムアルデヒド架橋は、植物のチップに使用されます。ホルムアルデヒドは、組織を貫通し、DNA 1〜6中のタンパク質またはタンパク質およびヌクレオチドのNH 2基の間にメチレン架橋を作成します。 インビボでの核タンパク質複合体の効率的な固定は、ホルムアルデヒドは、植物の核内のクロマチンに到達することを要求し、それは、植物組織が ​​完全トンに浸漬されることが必須です彼ホルムアルデヒドバッファは、免疫沈降中のタンパク質-DNA複合体が効果的にプルダウンされていることを確認し...

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

この手順の全体的な目的は、シロイヌナズナ細胞のクロマチンにおけるタンパク質とDNAの相互作用を明らかにすることです。この手法は、どの遺伝子が特定の転写因子によって制御されているか、あるいは遺伝子の転写状態にどのようなシステム上の改変が伴っているかなど、植物生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、クロスリンク（架橋）ステップを通じて、植物の発生過程で起こるクロマチン構造の変化を固定し、捕捉できることです。この手法はArabidopsis thalianaにおけるタンパク質相互作用の知見を提供できるだけでなく、異なる植物目に適用したり、他の植物種に適合させたりすることも可能です。本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の博士課程学生であるDorota KomarとAlfonso Mourizです。テキストプロトコルに従ってArabidopsisを育成した後、1.5 gの植物材料を50 mLチューブに回収し、架橋処理の間は氷上で保持してください。次に、ラボ用バーナーで加熱した針を用いて、チューブの蓋に小さな穴を開けます。チューブに1x pbsを40 milliliters、ホルムアルデヒドを1.08 milliliters加えます。チューブの蓋を締め、デシケーターに入れます。10分間真空浸透させた後、溶液が撹拌されないよう注意して真空を解除します。サンプルを混合した後、真空浸透と混合のステップを繰り返します。浸透後、植物材料を観察し、わずかに半透明になり、チューブの底に沈んでいることを確認してください。2 M glycineを2.5 mL加え、最終濃度を0.125 Mとし、5分間真空処理を行う。真空を解除した後、チューブを逆さまにして蓋の穴から液を滴下させ、溶液を廃棄する。pbsで幼植物を2回洗浄し、その後、水で1回洗浄する。次に、液体窒素で凍結させる前に、ペーパータオルで小植物体を乾燥させます。免疫沈降1回につき、1.5 mLマイクロ遠心チューブに15 µLの磁気ビーズを調製します。ビーズに1 mLのクロマチン免疫沈降（ChIP）希釈バッファーを加え、回転させて混合し、1.5 mLマイクロ遠心チューブをマグネットラックに設置します。ビーズを磁石に約1分間付着させた後、ピペットマンを使用して上清を除去し、洗浄を繰り返します。ビーズを200 µLのチップ希釈バッファーに再懸濁します。免疫共沈降を行う場合は、各プラントブラインド用に用意した2本のチューブのうち1本に、必要な量の特異的抗体を添加します。ChIP実験を成功させるための重要な要因は、目的タンパク質の免疫沈降に使用する抗体の選択です。植物転写因子に対して作製された抗体はChIP実験に有用ですが、血清を十分に検証する必要があります。例えば、ウェスタンブロット解析のみで確認

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

刷り込みは、植物と哺乳類の生殖の現象です。...

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。...

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。...

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

このビデオでは、タンパク質-DNA相互作用を実証する古典的な手法であるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのプロトコールについて説明しています。この技術は、ヒト慢性リンパ性白血病細胞の標的遺伝子を同定するために使用されます。...

クロマチン免疫沈降アッセイ:細胞内のタンパク質-DNA相互作用を研究する技術

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する...

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

ここでは、AT4G18020(APRR2)-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリ(Cucumis sativus...

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

学ぶクロマチン免疫沈降法によるシロイヌナズナのタンパク質-DNA相互作用解析。遺伝子発現制御メカニズムを解明し、植物発生過程におけるクロマチン動態を捉える有用な手法です。

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン

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