リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

この細胞外フラックス解析の全体的な目的は、ナイーブ、M1、およびM2に分極させた骨髄由来マクロファージの代謝特性を評価することです。この手法は、特定のサイトカイン、化合物、または遺伝子型がマクロファージの代謝表現型にどのように影響するかを調査するための枠組みとして利用できます。この技術の主な利点は、少量のマクロファージで十分であることです。

さらに、この手法では、1回の測定で糖新生およびミトコンドリアに関するすべての関連パラメータを測定できます。この方法は、骨髄由来マクロファージの代謝表現型に関する知見を提供しますが、あらゆる種類のマクロファージや免疫細胞にも適用可能です。他の研究者から細胞代謝フラックス測定の支援依頼を頻繁に受けていたため、本手法をJoVEで公開することにしました。培養8日目に、目視で成熟マクロファージの存在を確認し、成熟した骨髄由来マクロファージを10 mLのクエン酸緩衝生理食塩水で5分間インキュベートします。

細胞が剥離した時点で 37 °C に設定します。培養物を 10 mL の PBS で洗浄し、生存細胞数をカウントします。その後、1ウェルあたり 5 × 10⁴ 個の細胞を播種します。

XFE 96細胞培養マイクロプレートに、1ウェルあたり100 µLの培地を分注します。その際、ピペットを各ウェルの側壁の中ほどまで斜めに保持してください。細胞を分注する際は、バックグラウンド補正用のウェル（A1、A12、H1、H12）には培地のみを添加します。その後、細胞培養フード内で1時間、室温で細胞を静置させます。

接着培養を確認した後、細胞を37°C、5% CO₂インキュベーターで培養します。播種から3時間後、各条件につき4〜6ウェルの細胞を、適宜24時間刺激します。細胞外フラックスアッセイの前日に骨髄由来マクロファージを極性化させるため、センサーカートリッジをユーティリティプレートの横に逆さまに配置し、各プレートウェルに200 µLのcrin溶液を満たします。

次に、センサーカートリッジをユーティリティプレート上に下げてセンサーをCain溶液に浸し、センサーが浸漬したままの状態を維持できる十分な液量があることを確認します。その後、カートリッジを二酸化炭素を含まない37 °Cのインキュベーターに入れ、一晩静置します。翌日、分極化マクロファージから上清を穏やかに除去し、細胞を100 µLの調製直後のアッセイ液で洗浄します。

ウェルあたりの培地。各ウェルに180 µLのアッセイ培地を加え、顕微鏡を用いて細胞が洗浄で脱落していないことを確認します。細胞が付着していることを確認後、アッセイ開始前の1時間、細胞を37 °Cの非CO2インキュベーターでインキュベートします。

表の指定に従って10種類の注入化合物混合液を調製し、混合液を37 °Cに加温します。次に、提供されたローディングガイドを使用して、適切な量の化合物をセンサーカートリッジのポートA、B、CおよびDにロードし、細胞外フラックスアッセイにより分極マクロファージのバイオエナジーを特性評価します。アッセイウィザードを使用して、ミキシング時間を2分、測定時間を3分に設定し、4回の注入 each の前および最後の注入後に、少なくとも3回のミキシングおよびレート測定ループを含むアッセイテンプレートを作成します。

次にアッセイを開始し、装置の指示に従ってください。装置とセルプレートによる校正を可能にするため、水和させたプローブをカートリッジプレートにロードします。アッセイ終了時に指示が出たら、アッセイ培地をすべて慎重に廃棄し、解析後の細胞培養マイクロプレートを、ノーマライゼーションまで-20°Cで保存してください。

細胞増殖アッセイキットを用いて細胞を正規化するため、プレートを解凍し、各ウェルにつき200 µLの調製したばかりの細胞溶解バッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。最後に、励起波長約480 nm、蛍光波長約520 nmで蛍光強度を測定します。得られた蛍光測定値を用いて、すべてのナイーブマクロファージウェルの平均細胞数を1とした比率を算出し、これらの比率をSeahorse Wave解析ソフトウェアにエクスポートします。

データを正規化するため、細胞外フラックスアッセイにより、通常は細胞外酸性化速度（ECAR）または酸素消費速度（OCR）のプロットが得られます。この代表的な図に示すように、グルコース注入後に観察されるECARの増加は、糖分解速度を表しています。oligomycinによるATP合成阻害後にECARで観察されるさらなる増加は、糖分解予備能および容量に関するさらなる情報を提供します。OCR値を分析する場合、CINの注入によりミトコンドリアATP合成に使用される酸素消費量の算出が容易になり、FCCPはミトコンドリア呼吸を脱共役させます。

対応するOCR測定により、最大呼吸能および予備呼吸能に関するデータが得られます。一方、アンチマイシンAの注入はミトコンドリア複合体IおよびIIIを阻害し、残存するOCRは非ミトコンドリア酸素消費量を表します。LPSによるマクロファージの活性化は、糖分解代謝の亢進を誘導します。酸素消費速度を観察すると、LPS処理したマクロファージとIL-4処理したマクロファージとの差がより顕著になります。

実際、LPS処理されたマクロファージでは最大酸化代謝が高度に抑制される一方で、IL-4はM2マクロファージにおいて強力な呼吸を誘導します。習熟すれば、適切に実施することで細胞外フルクースアッセイを2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、脱共役後の最大呼吸を促進するために、FCCPと共にvetを注入することを忘れないでください。

この手法の後、マクロファージの分極が効率的に行われたかを確認するために、ELISAなどの追加アッセイを実施することができます。この技術は、免疫学分野の研究者が幅広い免疫細胞の代謝特性を探索する道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、マクロファージの代謝表現型を評価するための細胞外フラックス解析の実施方法について、十分に理解できるはずです。