リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

この細胞外フラックス解析の全体的な目標は、ナイーブなM1およびMの2つの分極骨髄由来マクロファージの代謝特性を評価することです。この方法は、特定のサイトカイン、化合物、またはゲノムコードがマクロファージの代謝表現型にどのように影響するかを調査するためのフレームワークとして役立ちます。この手法の主な利点は、少量のマクロファージしか必要としないことです。

さらに、関連するすべての解糖系およびミトコンドリアパラメータを1回のアッセイで測定します。この方法は、骨髄由来マクロファージの代謝表現型に関する洞察を提供しますが、すべてのタイプのマクロファージまたは免疫細胞にも適用できます。私たちは、他の科学者から頻繁に彼らの代謝アクセス細胞フラックスアッセイを支援するための要求を他の科学者から受けているため、この方法をJで発表するというアイデアを持っていました培養の8日目に、目視検査によって成熟マクロファージの存在を確認し、成熟骨髄由来マクロファージを10ミリリットルのクエン酸生理食塩水で5分間インキュベートします。

細胞が分離したときの摂氏37度。培養物を10ミリリットルのPBSで洗浄し、生細胞の数を数えます。次に、ウェルごとに4番目のセルに10の5倍を播種します。

XFE 96細胞培養では、ウェルあたり100マイクロリットルの培地にマイクロプレートを充填し、ピペットを各ウェルの側面の約半分の角度で保持します。細胞を分注するには、バックグラウンド補正ウェルA1、A12、H12、およびH12に培地のみを追加します。その後、細胞を細胞培養フード内で室温で1時間沈殿させます。

接着性培養を確認した後、細胞を摂氏37度5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。プレーティングの3時間後、24時間、必要に応じて、条件ごとに4〜6ウェルの細胞を刺激する。細胞外フラックスアッセイの前日に骨髄由来マクロファージを分極するには、センサーカートリッジをユーティリティプレートの隣に逆さまに置き、各プレートに200マイクロリットルのクリン溶液を十分に充填します。

次に、センサーカートリッジをユーティリティプレートに下げてセンサーをCain溶液に浸し、Cain溶液のレベルがセンサーを水没させ続けるのに十分な高さであることを確認します。次に、カートリッジを非二酸化炭素摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。翌日、分極したマクロファージから上清を静かに取り除き、新たに調製したアッセイ100μリットルで細胞を洗浄します。

井戸あたりのミディアム。各ウェルに180マイクロリットルのアッセイ培地を加え、顕微鏡を使用して細胞が洗い流されていないことを確認します。細胞がまだ付着している場合は、アッセイの実行の1時間前に、細胞がインキュベートされている間に、プレートを摂氏37度の非二酸化炭素インキュベーターに置きます。

表に示されているように10 x注入化合物混合物を調製し、混合物を摂氏37度に温めます。.次に、付属のローディングガイドを使用して、センサーカートリッジに適切な量の化合物とポートA、B、C、およびDをロードし、細胞外フラックスアッセイによって分極したマクロファージの生体エネルギーを特徴付けます。アッセイウィザードを使用して、2分間の混合時間と3分の測定時間、および4回の注入のそれぞれ前と最後の注入後に少なくとも3回の混合およびレート測定ループを含むアッセイテンプレートを作成します。

次に、アッセイを開始し、装置の指示に従って指示に従います。カートリッジプレートに水和プローブをロードして、装置とセルプレートによるキャリブレーションを可能にします。指示されたら、アッセイの終了時に、アッセイ培地をすべて慎重に廃棄し、分析した細胞培養マイクロプレートをマイナス20°Cで正常化するまで保存します。

細胞増殖アッセイキットを使用して細胞を正常化するには、プレートを解凍し、ウェルあたり200マイクロリットルの新たに調製した細胞溶解バッファーで細胞を室温で5分間インキュベートします。最後に、約480ナノメートルの励起と約520ナノメートルの発光最大値で蛍光を測定します。取得した蛍光測定値を使用して、すべてのナイーブマクロファージウェルの平均細胞数が1に設定される比率を計算し、これらの比率をタツノオトシゴ波解析ソフトウェアにエクスポートします。

データを正規化するために、細胞外フラックスアッセイは通常、グルコースの注入後にこの代表的な図で示されているように、細胞外酸性化率またはECARおよび酸素消費率、またはOCRプロットを生成します。ECARの観察された増加は解糖速度を表します。すべてのliga mycinによるTPシンターゼ阻害後にECARで観察された追加の増加は、解糖系の予備と容量に関するさらなる情報を提供します。OCR値を解析する際、CINインジェクションはミトコンドリアA TP合成に使用される酸素消費量の計算を容易にし、FCCPはミトコンドリア呼吸を切り離します。

対応するOCR測定では、最大呼吸能力と予備呼吸能力の腐敗に関するデータが得られ、アンチマイシン注射はミトコンドリア複合体1と3をブロックし、残りのOCRは非ミトコンドリア酸素消費量を表します。LPSによるマクロファージの活性化は、解糖代謝の増加を誘導します。LPSとILの違いにより、酸素消費率を観察すると、4つの治療マクロファージがさらに明らかになります。

実際、LPSで治療されたマクロファージでは最大の酸化代謝が非常に抑制されますが、IL 4はMの2つのマクロファージで強い呼吸を誘発します。一度習得すると、細胞外インフルエンザアッセイは、適切に実施されれば2時間で完了することができます。この手順を試みるときは、分離時に最大の呼吸を促進するために、FCCPと一緒に獣医を注射することを覚えておくことが重要です。

この手法の後、Elizaのような追加のアッセイを実施して、効率的なマクロファージ分極を評価することができます。この技術は、免疫学の分野の研究者が幅広い免疫細胞の代謝特性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、マクロファージの代謝表現型を評価するための細胞外フラックス分析の方法について十分に理解できるはずです。