Name: GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶポリシストロン構築物を用いた心臓線維芽細胞からの誘導心筋細胞の効率的な作製法。GATA4、MEF2C、TBX5の最適な発現比により再プログラミング効率と細胞質が向上し、心血管再生研究への応用が期待されます。

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UNC Flow Cytometry CoreおよびUNC Microscopy Coreからの専門的な技術支援に感謝します。Qian研究室とLiu研究室の皆さんには、原稿に対する有益な議論と批評をいただき、感謝いたします。この研究は、NIH/NHLBI R00 HL109079 Liu博士への助成金、および米国心臓協会 (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 およびEllison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian の支援を受けました。

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<li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).</li>
<li>Muraoka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-133+promotes+cardiac+reprogramming+by+directly+repressing+Snai1+and+silencing+fibroblast+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures.</a> Embo J. 33, 1565-1581 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141, 4267-4278 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiac+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).</li>
<li>Protze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+transcription+factor+screening+for+reprogramming+of+fibroblasts+to+cardiomyocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).</li>
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<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+Gata4%2C+Mef2c%2C+and+Tbx5+Influences+the+Efficiency+and+Quality+of+Induced+Cardiac+Myocyte+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming.</a> Circ Res. , (2014).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cardiac+cellular+reprogramming+efficacy+is+enhanced+by+angiogenic+preconditioning+of+the+infarcted+myocardium+with+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor.</a> J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).</li>
<li>Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+thymosin+beta4+and+cardiac+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors.</a> Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).</li>
<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+transcription+factors+is+critical+for+cardiac+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. , 116-216 (2015).</li>
<li>Srivastava, D., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+factors+for+cardiac+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Critical factors for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. 111, 5-8 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルを使用するときに成功したICMの世代のために、全体的な効率に影響を与えるいくつかの重要な要因があります。特に繊維芽細胞を開始する条件及びレトロウイルスをコードするMGTの品質が大幅に再プログラミングの効率に影響を与えることができます。 それは可能な限り新鮮で健康的な線維芽細胞を生成することが重要です。外植片が皿上にプレーティングした後に外植片培養法では、線維芽細胞は、7日前に使用することができます。酵素消化法のために、線維芽細胞は、初期の単離の次の日として使用することができます。凍結や再プログラミングのための線維芽細胞を継代することはお勧めできません。線維芽細胞のこれらの追加の治療は大幅に初期化の効率が低下します。播種密度は、再プログラミングの効率に影響を与える別の重要な要因です。細胞がまばらに播種する場合、それらは、不規則な細胞形態を有すると大きなサイズの不健康になる傾向があります。めったに共同ませんULDこれらの細胞は、ICMSに変換されます。細胞があまりにも密に播種された場合、ウイルス感染のMOI（感染多重度）が低下します。感染していない線維芽細胞の過剰増殖が大...

心血管疾患は依然として世界中で主要な死因であり、年間1730万人が死亡しています1。心筋梗塞(MI)や進行性心不全による心筋細胞の喪失は、罹患率と死亡率の主な原因です2。再生能力が限られているため、成体の哺乳類の心臓は通常、損傷後のポンプ機能障害と心不全に苦しんでいます3-6。そのため、心疾患の治療や疾患モデリングのために、in vivoおよびin vitroで心筋細胞を効率的に(再)生成することは、取り組むべき重要な課題です。
最近の直接リプログラミングの開発は、多能性状態を経ることなく、細胞を一つの分化した表現型から別の表現型に直接再プログラムするもので、再生医療のための有望な代替アプローチを提供します。哺乳類の心臓には豊富な心臓線維芽細胞(CF)が含まれており、これは心臓の細胞の約半分を占め、損傷時に大量に増殖します7-9。したがって、CFの膨大なプールは、機能的なCMに直接再プログラムすることができれば、再生治療のための新しいCMの内因性供給源として機能する可能性があります。Gata4(G)、Mef2c(M)、Tbx5(T)などの転写因子の組み合わせは、マイクロRNAまたは低分子の有無にかかわらず、線維芽細胞をiCMにリプログラミングできることが示されています10-26。重要なことに、この変換はインビボでも誘発することができ、その結果、梗塞性心臓16,27-29における心機能の改善および瘢痕サイズの縮小をもたらす。これらの研究は、直接的な心臓リプログラミングが、負傷した心臓を治癒する潜在的な方法である可能性があることを示しています。しかし、iCMのリプログラミングの効率の低さは、さらなるメカニズム研究の大きなハードルとなっています。さらに、心臓のリプログラミングの再現性は、この技術の別の物議を醸す問題です11,30,31。
ごく最近、私たちは単一のmRNAに同一の2A配列を持つすべての可能なスプライシング順序でG,M,Tをコードするポリシストロニックコンストラクトの完全なセットを生成しました。これらのポリシストロン構造体は、さまざまなG、M、およびTタンパク質の発現レベルをもたらし、これにより、リプログラミング効率が大幅に異なりました25。MGTと名付けられた最も効率的なコンストラクトは、比較的高いMef2cと低いGata4およびTbx5の発現を示し、リプログラミング効率を有意に改善し、CMマーカーの発現、堅牢なカルシウム振動、および自発的な拍動25を備えた大量のiCMを産生した。さらに、MGTポリシストロニックコンストラクトを使用することにより、私たちの研究では、複数のベクターの使用を回避し、G、M、Tの均一な発現比で細胞を生成し、心臓リプログラミング研究のための改善されたプラットフォームを提供しました。実験の再現性を高めるために、ここでは、線維芽細胞の単離方法、レトロウイルス担持MGTカセットの作製方法、iCMの生成方法、およびリプログラミング効率の評価方法について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>抗心筋トロポニン T</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-PO</td><td>1:200 (FACS用) 1:400 (ICC</td></tr><tr><td>用) 抗GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td>1:500 (FACSとICCの両方</td></tr>) <tr><td>抗aActinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>1:500(FACSとICCの両方</td></tr>) <tr><td>抗コネキシン43</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6219</td><td>1:500 (1:500)ICC</td></tr><tr><td>anit-Mef2c</td><td>Abcam</td><td>ab64644</td><td>1:1,000 ICC用&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-Gata4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1237</td><td>1:200 for ICC</td></tr><tr><td>anti-Tbx5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17866</td><td>1:200 for ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash;共役ロバ抗ウサギIgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-545-152</td><td>1:500 FACSとICCの両方</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&ndash;共役ロバ抗マウスIgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>715-605-150</td><td>1:500 FACSとICCの両方</td></tr><tr><td>細胞内染色のためのCytofix/Cytopermキット</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-3 Calcium Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R10145</td><td></td></tr><tr><td>Thy1.2マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-101</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>付きVectashieldソリューションベクターラボ</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td> <td>Corning</td><td>25-052</td><td></td></tr><tr><td>PRMI1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM低血清 ミディア</td>ム<td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>M199 ミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10-060</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10-013</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-002</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11130-050</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11668500</td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11139-03</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ II</td><td>ワージントン</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ミリポア</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィ</td><td>ッシャー9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>レトロウイルス沈殿液ALSTEM</td><td></td><td>VC-200</td><td></td></tr><tr><td>0.4%トリパンブルー溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr>ゼ<tr><td>ラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 および MgCl2 (D-PBS, 1x)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td> <td>Corning</td><td>21022</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;m 酢酸セルロースフィルター&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 組織培養ディッシュ&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>172958</td><td></td></tr><tr><td>60 mm センターウェル培養ディッシュ&nbsp;&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear V-Bottom 2 ml ポリプロピレン ディープ ウェル プレート</td><td>Denville Scientific</td><td>P9639</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ セル ストレーナー キャップ付き&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer MINI</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Cell Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>丸型ガラスカバースリップ</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72195-15</td><td></td></tr></tbody></table>

gata4、mef2c及びtbx5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

誘導された心筋細胞へ心臓線維芽細胞（CFS）の直接変換（ICMS）は、心臓病の治療のための代替戦略を提供することにより、再生医療のための大きな可能性を保持しています。この変換は、GATA4（G）、MEF2C（M）及びTBX5（T）として定義された要素の強制発現によって達成されています。伝統的には、ICMSは、これらの個々の因子を発現するウイルスの混合により生成されます。しかし、効率性を再プログラミングすることは比較的低く、 インビトロ G、M、T-形質導入線維芽細胞のほとんどは、それが困難な再プログラミングのメカニズムを研究すること、完全に再プログラムさになりません。我々は最近、G、Mの化学量論は、Tは、効率的なICMの再プログラミングのために重要であることを示しています。 M、我々のポリシストロンMGTベクトル（以下、MGTと呼ばれる）有意に増加した再プログラミング効率を使用することによって達成GとTの低レベルの相対的な高レベルのG、M、Tの最適な化学量論およびインビトロでの改善されたICMの品質。ここでは、心臓線維芽細胞からMGT構築物ICMSを生成するために使用される方法の詳細な説明を提供します。心臓線維芽細胞の単離、再プログラミングおよび再プログラミングのプロセスの評価のためのウイルスの生成はまた、ICMSの効率的かつ再現可能な生成のためのプラットフォームを提供するために含まれます。

再プログラミングステップは、MGTの導入後、細胞を再プログラミングにおけるGFP発現は、形質導入した細胞の3ピューロマイシン選択が3日目から始まり、PMX-puroの場合、最初の2週間の間、維持され、早ければ一日として検出することができた。 図1の模式によって要約されています-MGT構築物が使用されます。 14日目に10日目では、cTnTのとαActininなどの心臓マーカーの発現が開始線維芽細胞が心筋細胞に向かって再プログラミングを受けていることを示し、両方のICC（ 図2B、ステップ5）およびFACS（ 図2A、ステップ6）によって検出される可能性があります運命。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53426/53426fig1.jpg" /> 図1：各時点での直接の心...

ここでは、レトロウイルスを媒介としたGata4、Tbx5、Mef2cのポリシストロニックコンストラクトによる送達を使用したiCMの生成のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、効率と品質が向上した比較的均質な再プログラムされた細胞集団をもたらし、iCMリプログラミングの将来の研究に価値があります。

GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

本プロトコルの全体的な目的は、gata4、F2C、およびTBX5を最適比率で発現するポリシストロニックMGTコンストラクトを用いて、心筋線維芽細胞から誘導心筋細胞を効率的に作製する方法を実証することです。この手法は、誘導心筋細胞研究のための有用なプラットフォームとなり、誘導心筋細胞プログラミングの高スループットスクリーニングやメカニズム研究を促進させると同時に、この分野の臨床応用への移行を後押しします。本手法の最大の利点は、単一のレトロウイルスコンストラクトを用いるだけで、心筋線維芽細胞を心筋細胞へ効率的に転換できることです。新生児のαミオシン重鎖GFPトランスジェニックマウスを75% (v/v) エタノールで清浄し、安楽死させます。次に、滅菌済みの鈍端曲がったピンセットを使用し、一方の脇の下からもう一方の脇の下まで水平に切開して体腔を開きます。心臓を摘出し、氷を入れた24ウェルプレートの1ウェルに配置します。冷PBS中で、蛍光顕微鏡を用いて心臓全体のGFP発現を観察します。滅菌済みピンセットとハサミを用いて、GFP陽性の心臓を3〜4個、60mmのセンターウェル培養皿に移し、心臓を1mm³未満の小さな破片に細切します。細切にした心臓を10 cmディッシュに移し、2 mLのfiberblastまたはFB培地で満たします。37 °Cのインキュベーター内で、プレートに手を触れずに少なくとも3時間静置します。インキュベーション後、細切にした心臓組織が入ったディッシュに、予熱したFB培地8 mLをゆっくりと加えます。その後、3日ごとに培地を交換する以外は、組織に刺激を与えないようにインキュベートします。7日目に、培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄します。各プレートに0.05%トリプシン-EDTAを3 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。FB培地を5 mL加えてトリプシンを不活化し、セルスクレーパーで細胞を穏やかに剥離させます。次に、細胞を回収し、心臓組織の断片による混入を防ぐため、40 µmのセルストレーナーでろ過します。分離した新生マウス心臓から得られた細胞を、200 ×gで5分間遠心分離してペレット化します。各心臓を、ゆるやかに繋がった状態で4等分に切り分けます。心臓を、8 mLの温めた0.05%tripsin EDTAを含む15 mLコニカルチューブに移し、37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、tripsin EDTAを除去し、5 mLの温めたtype two collagenaseを加えて中速で1分間ボルテックスし、その後、チューブを37 °Cのウォーターバスで3〜5分間インキュベートします。その後、チューブを再び1分間ボルテックスします。組織片を沈殿させ、上清を5 mLの冷たいFB培地が入った新しいチューブに回収します。組織片に5 mLの新鮮なtype two collagenaseを加え、ボルテックスとインキュベーションの工程を繰り返します。40 µmのセルストレーナーでろ過し、細胞を含むすべての上清を合わせます。これらの細胞を4°Cで200 ×gにて5分間遠心分離します。その後、いずれかの心筋線維芽細胞分離法に従います。最終的な細胞ペレットを、10 mLの磁気活性化細胞分取（MACS）バッファーまたはMaxバッファーで1回洗浄します。生細胞数カウント用に10 µLを取り出し、残りの細胞を4°Cで200 ×gにて5分間遠心分離します（細胞数が1 × 10⁷個未満の場合）。細胞ペレットを、冷却した90 µLのMaxバッファーに懸濁した10 µLのThy1.2結合磁気マイクロビーズで再懸濁し、混合します。ビーズを4 °Cで30分間インキュベートします。細胞をペレット化するため、Max bufferを10 mL加え、サンプルを200 ×gで5分間遠心分離します。Max buffer 10 mLで1回洗浄し、細胞培養フード内で細胞ペレットを合計2 mLの容量に再懸濁します。maxセパレーターを設置し、LSカラムを装着します。3 mLのmaxバッファーでカラムを平衡化します。細胞懸濁液をLSカラムに通し、2 mLのmaxバッファーで3回洗浄します。次に、セパレーターからLSカラムを取り出し、2 mLのmax bufferで3回溶出します。溶出液（EIT）を50 mLコニカルチューブに回収します。EITを200 ×gで5分間遠心分離します。単離した線維芽細胞を10 millilitersのFB培地で再懸濁して細胞数を計測し、心線維芽細胞をリプログラミングするため、ゼラチンでプレコートした24ウェルプレートの組織培養ディッシュに適切な密度で播種します。細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに、poly brainを含む誘導心筋細胞（ICM）培地を500 microliters加えます。単離した線維芽細胞が入った各ウェルに、レトロウイルスを10 microliters加えます。プレートをレトロウイルス粒子とともに細胞培養インキュベーター内で24〜48時間インキュベートします。その後、ウイルスを含む培地を500 µLの新鮮なICM培地と交換し、2〜3日ごとに培地を交換します。ICM培地に2 µg/mLのピューマイシンを添加し、ウイルス導入細胞のポジティブセレクションを開始します。3日間の選別後、心筋由来線維芽細胞から心筋細胞への転換を可視化するため、培地を1 µg/mLのピューロマイシンを含む維持用培地に変更します。倒立顕微鏡を用いて、ピューロマイシンで選別したプレートのGFP発現を観察します。最後に、ウイルス処理から14日後に、ICM培地をB 27に置換します。心筋トロポニンTおよびα-アクチニンを含む心筋マーカーのウイルス導入発現後3～4週間で、中程度の自発的な拍動細胞の局在が現れることがあります。免疫化学染色により、10～14日目までに検出可能です。ここでは、線維芽細胞から変換されGFPを発現しているiCMsにおいて心筋トロポニンTの発現が認められ、またiCMsにおけるα-アクチニンの発現が確認できます。フローサイトメトリーによる解析では、特にピューロマイシンによる誘導心筋細胞の選択後において、心筋トロポニンTの発現が同様に増加していることが示されています。ここで述べた手法により、単一のコンストラクトにおけるレトロウイルスによるNGT転写因子の導入に基づいた、効率的な誘導心筋細胞の作製が可能となります。

improved-generation-induced-cardiomyocytes-using-polycistronic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

このプロトコルは、マウス多能性幹細胞（PSC）から機能洞結節組織を生成する方法について説明します。 T-BOX3（TBX3）過剰発現プラス心臓ミオシン-重鎖（MYH6）プロモーター抗生物質選択は、高純度のペースメーカー細胞凝集につながる。これらの「誘導された-洞房-体」（「iSABs」）、80％以上のペースメーカー細胞を含む非常に増加鼓動率を示し、ex vivoで心筋をペーシングすることができます。...

MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7...

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1...

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

ここで心臓の生理学をエミュレートする電気的・機械的刺激を用いたセル人口をトレーニングするためのプロトコルを提案する.この電気刺激は扱われた細胞の cardiomyogenic...

細胞の Cardiomyogenic の可能性を高めるに同時電気的・機械的刺激

この方法の目的は、前駆細胞の仕様および機能性を研究するためにインビトロで心臓界特異的心臓前駆細胞を生成し、心臓病モデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成することである。...

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価

このプロトコルは、マウスの心臓の発達における心臓細胞のエレクトロポレーションベースのトランスジェネシスのための詳細な方法論的フレームワークを示しています。ここで提供されるビデオアセットは、この汎用性の高い手法の学習を容易にします。...

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

学ぶポリシストロン構築物を用いた心臓線維芽細胞からの誘導心筋細胞の効率的な作製法。GATA4、MEF2C、TBX5の最適な発現比により再プログラミング効率と細胞質が向上し、心血管再生研究への応用が期待されます。

GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

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