GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

本プロトコルの全体的な目的は、gata4、F2C、およびTBX5を最適比率で発現するポリシストロニックMGTコンストラクトを用いて、心筋線維芽細胞から誘導心筋細胞を効率的に作製する方法を実証することです。この手法は、誘導心筋細胞研究のための有用なプラットフォームとなり、誘導心筋細胞プログラミングの高スループットスクリーニングやメカニズム研究を促進させると同時に、この分野の臨床応用への移行を後押しします。本手法の最大の利点は、単一のレトロウイルスコンストラクトを用いるだけで、心筋線維芽細胞を心筋細胞へ効率的に転換できることです。

新生児のαミオシン重鎖GFPトランスジェニックマウスを75% (v/v) エタノールで清浄し、安楽死させます。次に、滅菌済みの鈍端曲がったピンセットを使用し、一方の脇の下からもう一方の脇の下まで水平に切開して体腔を開きます。

心臓を摘出し、氷を入れた24ウェルプレートの1ウェルに配置します。冷PBS中で、蛍光顕微鏡を用いて心臓全体のGFP発現を観察します。滅菌済みピンセットとハサミを用いて、GFP陽性の心臓を3〜4個、60mmのセンターウェル培養皿に移し、心臓を1mm³未満の小さな破片に細切します。

細切にした心臓を10 cmディッシュに移し、2 mLのfiberblastまたはFB培地で満たします。37 °Cのインキュベーター内で、プレートに手を触れずに少なくとも3時間静置します。インキュベーション後、細切にした心臓組織が入ったディッシュに、予熱したFB培地8 mLをゆっくりと加えます。

その後、3日ごとに培地を交換する以外は、組織に刺激を与えないようにインキュベートします。7日目に、培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄します。各プレートに0.05%トリプシン-EDTAを3 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。

FB培地を5 mL加えてトリプシンを不活化し、セルスクレーパーで細胞を穏やかに剥離させます。次に、細胞を回収し、心臓組織の断片による混入を防ぐため、40 µmのセルストレーナーでろ過します。分離した新生マウス心臓から得られた細胞を、200 ×gで5分間遠心分離してペレット化します。

各心臓を、ゆるやかに繋がった状態で4等分に切り分けます。心臓を、8 mLの温めた0.05%tripsin EDTAを含む15 mLコニカルチューブに移し、37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、tripsin EDTAを除去し、5 mLの温めたtype two collagenaseを加えて中速で1分間ボルテックスし、その後、チューブを37 °Cのウォーターバスで3〜5分間インキュベートします。

その後、チューブを再び1分間ボルテックスします。組織片を沈殿させ、上清を5 mLの冷たいFB培地が入った新しいチューブに回収します。組織片に5 mLの新鮮なtype two collagenaseを加え、ボルテックスとインキュベーションの工程を繰り返します。

40 µmのセルストレーナーでろ過し、細胞を含むすべての上清を合わせます。これらの細胞を4°Cで200 ×gにて5分間遠心分離します。その後、いずれかの心筋線維芽細胞分離法に従います。

最終的な細胞ペレットを、10 mLの磁気活性化細胞分取（MACS）バッファーまたはMaxバッファーで1回洗浄します。生細胞数カウント用に10 µLを取り出し、残りの細胞を4°Cで200 ×gにて5分間遠心分離します（細胞数が1 × 10⁷個未満の場合）。細胞ペレットを、冷却した90 µLのMaxバッファーに懸濁した10 µLのThy1.2結合磁気マイクロビーズで再懸濁し、混合します。

ビーズを4 °Cで30分間インキュベートします。細胞をペレット化するため、Max bufferを10 mL加え、サンプルを200 ×gで5分間遠心分離します。Max buffer 10 mLで1回洗浄し、細胞培養フード内で細胞ペレットを合計2 mLの容量に再懸濁します。

maxセパレーターを設置し、LSカラムを装着します。3 mLのmaxバッファーでカラムを平衡化します。細胞懸濁液をLSカラムに通し、2 mLのmaxバッファーで3回洗浄します。

次に、セパレーターからLSカラムを取り出し、2 mLのmax bufferで3回溶出します。溶出液（EIT）を50 mLコニカルチューブに回収します。EITを200 ×gで5分間遠心分離します。

単離した線維芽細胞を10 millilitersのFB培地で再懸濁して細胞数を計測し、心線維芽細胞をリプログラミングするため、ゼラチンでプレコートした24ウェルプレートの組織培養ディッシュに適切な密度で播種します。細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに、poly brainを含む誘導心筋細胞（ICM）培地を500 microliters加えます。単離した線維芽細胞が入った各ウェルに、レトロウイルスを10 microliters加えます。

プレートをレトロウイルス粒子とともに細胞培養インキュベーター内で24〜48時間インキュベートします。その後、ウイルスを含む培地を500 µLの新鮮なICM培地と交換し、2〜3日ごとに培地を交換します。ICM培地に2 µg/mLのピューマイシンを添加し、ウイルス導入細胞のポジティブセレクションを開始します。

3日間の選別後、心筋由来線維芽細胞から心筋細胞への転換を可視化するため、培地を1 µg/mLのピューロマイシンを含む維持用培地に変更します。倒立顕微鏡を用いて、ピューロマイシンで選別したプレートのGFP発現を観察します。最後に、ウイルス処理から14日後に、ICM培地をB 27に置換します。

心筋トロポニンTおよびα-アクチニンを含む心筋マーカーのウイルス導入発現後3～4週間で、中程度の自発的な拍動細胞の局在が現れることがあります。免疫化学染色により、10～14日目までに検出可能です。ここでは、線維芽細胞から変換されGFPを発現しているiCMsにおいて心筋トロポニンTの発現が認められ、またiCMsにおけるα-アクチニンの発現が確認できます。

フローサイトメトリーによる解析では、特にピューロマイシンによる誘導心筋細胞の選択後において、心筋トロポニンTの発現が同様に増加していることが示されています。ここで述べた手法により、単一のコンストラクトにおけるレトロウイルスによるNGT転写因子の導入に基づいた、効率的な誘導心筋細胞の作製が可能となります。