クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

このコロイド金イムノクロマトグラフィーテストストリップの全体的な目標は、鯨類のミオグロビンをアザラシや他の動物のミオグロビンと区別することです。この方法は、鯨類の肉の迅速かつその場でのスクリーニングを提供し、それによってその違法な取引と消費を抑制することができます。この技術の主な利点は、03グラムの筋肉を均質化した後、5〜10分で優れた特異性と感度で成功した結果を直接観察できることです。

したがって、この方法では、野外で鯨類の肉を迅速に検出できます。また、馬肉や豚肉などの他の肉にも適用できます。鯨類のミオグロビンに対して反応性を持つモノクローナル抗体を産生する合成ペプチドを設計するために、様々な動物由来のミオグロビン抗原反応領域のアミノ酸配列を解析しています。

まず、マグロ、ニワトリ、ダチョウ、家畜哺乳類、アザラシ、および18種の鯨類からミオグロビンのアミノ酸配列をGenBankから取得します。次に、適切なソフトウェアを使用してシーケンスをアライメントします。Alignment Explorer を起動するには、起動バーで Align Edit/Build Alignment を選択します。

[新しい線形を作成]を選択し、[OK]をクリックします。DNAまたはタンパク質配列のアラインメントを構築しているかを尋ねるダイアログが表示されます。Protein(タンパク質)ボタンをクリックし、Data Open Retrieve sequences from Fileを選択し、sequence fileを選択します。「編集」「すべて選択」メニュー・コマンドを選択して、データ・セット内のすべてのシーケンスのすべての部位を選択し、複数シーケンス・アラインメントを作成します。

メインメニューから「Alignment by ClustalW」を選択します。タンパク質重量マトリックスとしてBLOSUMを選択し、OKボタンをクリックします。3番目のステップは、シーケンスのアラインメントを分析することです。

5つの抗原反応性部位に着目し、鯨類間で保存されている断片を見つけます。アスタリスクは、アライメントのコンセンサスを象徴し、完全に保存された単一の残基を持つ位置を示します。鯨類では2つの保存された断片が見つかりました。

その後、候補配列フラグメントを合成し、モノクローナル抗体の産生に使用します。この手順は、モノクローナル抗体と金コロイド溶液の混合物を2時間赤色に保つ最小pHとして定義される金コロイド溶液の最適pHを決定することから始めます。精製した検出モノクローナル抗体を、pH値が5〜9の範囲で変化する100マイクロリットルの金コロイド溶液に添加します。

このデモンストレーションでは、pH 6 と pH 8 を試験します。この最適化ステップでは、pH 8 が最適 pH と見なされました。次に、pH 8の100マイクロリットルの金コロイド溶液に、精製した検出モノクローナル抗体を様々な量加えることにより、モノクローナル抗体の最適濃度を決定します。

この研究では1ミリリットルあたり6マイクログラムの最適濃度は、混合物の色を赤に保ち、黒色の沈殿物はありません。最適化ステップの結果に基づいて、精製した検出モノクローナル抗体60μgを10mLの金コロイド溶液に滴下します。混合物を室温で10分間穏やかに乳化します。

PBS溶液中の5%BSA溶液を2ミリリットル加え、室温で15分間穏やかに乳化して、バックグラウンド干渉を減らします。混合物を10, 000倍gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離後、非標識抗体で上清を慎重に除去し、得られたペレットを1%BSAと0.1%Tween-20を含む4mLのPBS-Tに懸濁します。

遠心分離と懸濁を1回または2回繰り返します。最終沈殿物を1mLのPBS-Tに懸濁し、使用するまで摂氏4度で保存します。ここには、免疫ストリップのデザインの図を示します。

段ボール、パッド、およびニトロセルロースメンブレンの寸法は、プロトコルテキストに記載されています。保管寿命を延ばすために、免疫ストリップは低湿度の実験室環境条件で準備および組み立てる必要があります。マイクロピペットを使用して、コロイド金標識モノクローナル抗体溶液をコンジュゲートパッドに加えて飽和させ、パッドを摂氏37度で1時間乾燥させてから組み立てます。

コンジュゲートパッドが乾いたら、まず両面テープを使用してニトロセルロースメンブレンを段ボールに貼り付けます。イムノストリッププリンターを使用して、モノクローナル抗体を捕捉する特異的抗原と迅速抗マウスIGGを、ニトロセルロースメンブレン上のテストゾーンとコントロールゾーンにそれぞれ分配します。2 つのゾーン間の距離を 5 mm 以上に保ちます。

次に、ニトロセルロース膜の片側にコンジュゲートパッドを貼り付け、反対側に吸収パッドを貼り付けて、両側のパッドを約2mm重ねます。サンプルパッドをコンジュゲートパッドの上に2mm置き、段ボールに貼り付けます。ペーパーカッターを使用して、幅6ミリメートルのストリップを作成します。

ストリップを乾燥剤を入れたアルミホイルバッグに詰め、使用するまで摂氏4度で保管します。交差反応性試験用のサンプルを調製するには、0.03gの生筋肉に0.1%BSAを含むPBS1mLを加えます。また、竹の棒や砥石を使用してサンプルを均質化します。

免疫ストリップを試験領域の反対側の端で保持し、サンプルパッド部分を試験片に5〜10分間浸します。結果を直接観察します。さまざまな筋肉サンプルをトリプリケートでテストします。

Tテストラインは、両方のモノクローナル抗体が鯨類のミオグロビンを検出したときに陽性のシグナルを示すように設計されています。非鯨類動物由来のミオグロビンは、これら2つのモノクローナル抗体のいずれかによってのみ検出できるため、他の動物の筋肉サンプルを検査すると、検査ラインは陰性の結果を示します。Cコントロールラインは、迅速な抗マウスIGGがコロイド金標識検出抗体に結合するため、常に陽性の結果を示すはずです。

コントロールラインの結果が失敗した場合は、ストリップ上の材料の品質が悪いことを示しています。ハイブリドーマ上清を用いた西洋血液分析により、CGF5H9モノクローナル抗体は、予測分子量約17kDaでクジラ類や他の哺乳類を単一の染色バンドとして検出することが示されています。一般的なミンククジラは、他のクジラ類のバンドよりも比較的暗いバンドを示しています。

マグロ、アザラシ、チキンのバンドはありません。一方、ブタには約50kDaのバンドが観察されます。ドット血液分析でも同じ結果が得られます。

CSF1H13モノクローナル抗体を用いた西洋の血液分析では、ブタとマグロに対して複数の非特異的なバンドが示されていますが、CSF1H13は鯨類とのみ反応するため、特異性が高いです。そして、シールは、約17kDaの予測分子量でバンドを持っています。ドット血液分析でも同じ結果が得られます。

精製されたCGF5H9を用いた異なる種の筋肉抽出物の間接ELISAの結果は、ウシ、ヤギ、イヌ、ウサギ、クジラ類では正のシグナル、ブタでは弱い正のシグナル、マグロ、ニワトリ、アザラシではネガティブなシグナルを示しています。CSF1H13は、クジラ類やアザラシに対して高い親和性を示します。どちらのモノクローナル抗体も、異なる科に属する4つの鯨類種すべてと強く反応することができ、多様な鯨類種に対して幅広い反応性を示す。

免疫コロイド金ストリップの特異性は、これらの代表的な結果によって示されています。非鯨類の筋肉サンプルを使用すると、コントロールラインには1つのバンドしかありません。ただし、鯨類の筋肉サンプルを使用する場合、信号帯域はテストラインとコントロールラインの両方に存在します。

一度習得すれば、標識抗体の調製とこのストリップの構築は、適切に行われれば4時間で完了します。この手順を試みるときは、ペプチドを慎重に設計することを忘れないようにすることが重要です。適切なモノクローナル抗体をスクリーニングするには、いくつかの方法を使用してください。

また、高品質の金コロイドを使用して、標識抗体を調製します。これらの手順に続いて、PCRベースのDNA分析などの他の方法を実行して、鯨類の種やそれがどこから来たのかなどの追加の質問に答えることができます。強力で海洋哺乳類のみに親和性を示すCSF1H13モノクローナル抗体は、海洋哺乳類のミオグロビンの生物学的、生理学的、化学的側面を研究するための他の多くの機会を提供するさまざまな形式のELISAで使用できます。

このビデオを見れば、特定のモノクローナル抗体を開発し、その後それらをクイックテストストリップに適用する方法について十分に理解できるはずです。