Name: クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶ金コロイドイムノクロマト法テストストリップによるクジラミオグロビンの迅速検出法。現場で5〜10分で結果が得られ、違法取引防止に貢献する高感度・高特異性の手法です。

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サンプル収集のために、台湾鯨類協会、国立成功大学の海洋生物学および鯨類研究センター、遠鴗海洋公園、国立嘉義大学の動物病診断センターの同僚に感謝します。このプロジェクトは、台湾農業委員会(100AS-02.1-FB99)からWCYへの助成金によって資金提供されました。

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

担体タンパク質にコンジュゲートした合成ペプチドを使用することにより、その同族タンパク質と比較して著しくより効果的です。 mAbは既知の相対位置を有するエピトープを使用して開発されているので、サンドイッチに基づく技術については、本研究では2 mAbは、標的抗原エピトープとの互いの相互作用を妨害する可能性はありません。また、天然のタンパク質との反応性及び合成ペプチドコンジュゲートで免疫したマウスの抗体は、天然タンパク質19から製造天然タンパク質と抗体との反応性よりも強いかもしれません。合成ペプチド複合体の使用は、したがって、効果的な免疫手順や適切な抗ペプチドモノクローナル抗体の生成のために推奨されます。 タンパク質の構造は、主にポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列を含みます。各アミノ酸は、特定の特性をもたらす、その側鎖を有しており、わずかにアミノACIを変更しますD配列は、構造変化をもたらします。 10〜20アミノ酸長を有するペプチドは、抗体調製のための理想的であるので、C末端領域における合成ペプチド（免疫原）の長さは、コア抗原性領域が認識されることを確実にするために...

歴史的に、鯨類の肉は世界の多くの地域で消費され、この消費は今日も続いています。鯨類の栄養段階により、高濃度の水銀やその他の毒素が肉に存在することが知られています2。したがって、鯨類の肉の摂取は、妊婦などのハイリスクグループだけでなく、一般の人々にとっても健康問題につながる可能性があります3。さらに、鯨類の肉が人獣共通感染症または潜在的に人獣共通感染症の病原体に汚染されることも、その加工および保管中に発生する可能性があります4。経験豊富なエージェントでも、見た目だけで鯨類の肉を識別することは困難です。したがって、鯨類の肉を他の肉と区別するためには、信頼性の高い科学的同定方法が必要です。これは、鯨類の肉の消費を制限するのに役立ちます。
現在の種の同定方法には、分子技術と免疫学的方法が含まれます。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)やDNAシーケンシングなどの分子技術を用いて、生肉5や分解サンプル6だけでなく、調理済みソーセージや飼料などの加工食品7,8からもサンプルを同定することができる。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの免疫学的方法は、豚肉9、牛肉10、ナマズ11などの肉含有量を検出するために、食品製造に一般的に適用されています。鯨類の肉を同定するためのPCRベースのDNA分析が利用可能であり12、日本、韓国、フィリピン、台湾、香港、ロシア、ノルウェー、および米国における鯨類の違法な国際取引の防止に役立っています1。これらの方法は効果的で信頼性がありますが、完了するまでに数時間から数日かかり、面倒な手順を伴う場合があります。鯨類の肉の同定は通常、分子技術に基づいており、現在利用可能な免疫学的方法はありません。規制当局にとって、鯨類の肉を同定するために現場で使用できる信頼性と迅速な技術を開発することが非常に望ましいです。
イムノクロマトグラフィーストリップは、現場での使用に適した簡単なプロトコルで迅速な結果が得られるという利点を持つ検出ツールとして使用されます。イムノクロマトグラフィーストリップとELISAの原理は非常に似ており、抗体、抗原、および標識が含まれます。コロイド状金、カーボン、ラテックスなどの多くの異なる標識が、イムノクロマトグラフィーストリップの開発に使用されてきました。現在、この方法は、抗生物質、毒素、細菌、ウイルス13の検出に一般的に使用されているが、肉14,15のタンパク質の同定にはほとんど使用されていない。ここでは、鯨類ミオグロビン(Mb)の迅速な検出のためのラテラルフロークロマトグラフィー酵素免疫測定法を提案します。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protein G HP SpinTrap&nbsp;</td><td>ジェ&nbsp;Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>スピンカラム Protein G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies</td></tr> Mini <tr><td>Trans-Blot Bio-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>抗体ブロッカーソリューション&nbsp;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>サンプル中の非特異的IgGの非特異的結合相互作用を最小限に抑えるには</td></tr><tr><td>BCIP/NBTホスファターゼ基質&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質検出器HRPマイクロウェルキット、抗マウスKPL</td><td></td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc免疫プレートMaxiSorp ELISAプレート</td><td>サーモ&nbsp;フィッシャーサイエンティフィック</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>マルチスカン&nbsp;EX ELISAリーダー&nbsp;</td><td>サーモ&nbsp;エレクトロン&nbsp;Corporation</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>金コロイド(40nm)溶液&nbsp;</td><td>REGAバイオテクノロジー株式会社</td><td></td><td>40-50 nmは、イムノストリップ、</td></tr><tr><td>ウシ、血清、アルブミン、</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr>、<tr><td>ラピッドテスト、イmmノストリッププリンター</td><td>、REGAバイオテクノロジー、株式会社に適しています。</td><td>アギスマート RP-1000&nbsp;</td><td>研究開発目的のイムノストリップの小規模生産にのみ適しています</td></tr><tr><td>ストリップコンポーネント(NCメンブレン、サンプルパッド(#33ガラス、S&S)、共役パッド(#16S、S&S)と吸収パッド(CF6、Whatman))</td><td>レガ・バイオテクノロジー(株)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フロイントアジュバントと不完全なフロイント'sアジュバント&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881、F5506</td> 免疫原アクリルアミド、ゲル緩衝液、過硫酸アンモニウム(APS)、テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)<td>の油中水型エマルジョンの製造に使用されます</td></tr><tr><td>。</td><td></td><td>SDS-PAGE</td>Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610436 Protein staining in SDS-PAGE gels Laemmli sample buffer and &beta;-mercaptoethanol Bio-Rad 1610737, 1610710 Protech <td></td> Gel preparation for</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>SDS-PAGE gels ロード前にタンパク質サンプルを希釈します。</td></tr></tbody></table>

クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

このプロトコルは、鯨類のミオグロビン(Mb)をアザラシや他の動物のミオグロビン(Mb)と区別するために使用できるサンドイッチ形式に基づくコロイド金イムノクロマトグラフィーテストストリップの開発を説明しています。このストリップは、鯨類の肉の迅速かつその場でのスクリーニングを提供し、それによってその違法な取引と消費を抑制します。鯨類のMbに対して反応性を持つ2つのモノクローナル抗体(mAb)を開発しました。2つの合成ペプチド(一般ペプチドと特異的ペプチド)を設計し、その後、モノクローナル抗体(サブクラスIgG1)を上げるために、さまざまな動物由来のMb抗原反応領域のアミノ酸配列を分析しました。mAbは、間接ELISAでスクリーニングしたハイブリドーマ、ウェスタンブロット、およびドットブロットから選択しました。CGF5H9は、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、クジラ類のMbsに特異的であり、ニワトリ、マグロ、アザラシのMbsには弱いか、まったく親和性がありませんでした。CSF1H13アザラシやクジラ類には強い親和性で結合できますが、他の動物には親和性を示しませんでした。この研究では、4つの科(Balaenopteridae、Delphinidae、Phocoenidae、Kogiidae)の鯨類サンプルを使用し、その結果、これら2つのmAbが異なる鯨類由来のMbsに広く結合できることが示されました。これらのモノクローナル抗体をサンドイッチ型コロイド金イムノクロマトグラフィー試験ストリップに適用しました。CGF5H9は多くの種を認識するため、金コロイド標識を行い、検出抗体として使用しました。試験ゾーンにコーティングされたCSF1H13は、鯨類とアザラシの存在を検出し、マグロ、ニワトリ、アザラシ、陸生哺乳類5種、鯨類15種の筋肉サンプルを三重に試験しました。すべての鯨類のサンプルは陽性の結果を示し、他のすべてのサンプルは陰性の結果を示しました。

モノクローナル抗体の特性 私たちは、鯨類のMBの、それぞれ2合成ペプチド（MKASEDLKKHGNTVLCとAIIHVLHSRHPAEFGC）を、認識2のIgG 1モノクローナル抗体（CGF5H9とCSF1H13）を開発し、これらはクジラMbのを迅速に検出するためのサンドイッチ型金コロイドイムノクロマト法テストストリップを構築するために使用しました。 図2は CGF5H9はおおよそ17キロダルトンの予測分子量で、単一の染色バンドとして鯨類および他の哺乳動物を検出することを示しています。ミンククジラ（ ミンクacutorostrata）は、他のクジラ類のバンドよりも比較的暗いバンドを示しています。約50キロダルトンのバンドが豚のために観察されるのに対し、バンドは、マグロ、鶏やシールのために存在しません。豚やマグロのための複数の非特異的なバンドがありますが、それはおおよそ17 kの予想分子量のバンドとしての鯨類やアザラシにのみ反応するため、CSF1H13は、非...

このプロトコルは、鯨類のミオグロビンに強く反応する2つのIgGクラスモノクローナル抗体(mAb)の開発について説明しています。これらのモノクローナル抗体は、サンドイッチフォーマットに基づく金コロイドイムノクロマトグラフィー試験ストリップに適用され、鯨類のMbをアザラシや他の動物と区別します。

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

このコロイド金免疫クロマトグラフ試験ストリップの総合的な目的は、鯨類のミオグロビンをアザラシやその他の動物のミオグロビンと区別することです。この手法により、鯨類肉の迅速かつオンサイトでのスクリーニングが可能となり、不法な取引や消費を抑制することができます。本技術の主な利点は、0.3 gの筋肉組織をホモジナイズした後、5〜10分で直接結果を確認できることであり、極めて高い特異性と感度を備えている点にあります。したがって、本手法により、現場での鯨類肉の迅速な検出が可能となります。また、馬肉や豚肉などの他の食肉にも適用可能です。鯨類のミオグロビンに対して反応性を持つモノクローナル抗体を作製するための合成ペプチドを設計するために、さまざまな動物のミオグロビン抗原反応領域のアミノ酸配列を解析します。まず、GenBankからマグロ、ニワトリ、ダチョウ、家畜哺乳類、アザラシ、および18種の鯨類から得られたミオグロビンのアミノ酸配列を取得します。次に、適切なソフトウェアを使用して配列アライメントを行います。起動バーの「Align Edit/Build Alignment」を選択して、Alignment Explorerを起動してください。「Create New Alignment」を選択し、「OK」をクリックします。「DNA」と「Protein」のどちらの配列アラインメントを作成するかを問うダイアログが表示されます。「Protein」ボタンをクリックし、「Data」→「Open」→「Retrieve sequences from File」を選択して、配列ファイルを選択します。「Edit」メニューから「Select All」コマンドを選択し、マルチプルシーケンスアラインメントを作成するために、データセット内のすべての配列の全サイトを選択します。メインメニューから「Alignment」を選択し、「Align by ClustalW」をクリックします。タンパク質重み行列として「BLOSUM」を選択し、「OK」ボタンをクリックします。3番目のステップは、配列アラインメントの解析です。5つの抗原反応部位に着目し、鯨類の間で保存されているフラグメントを特定します。アライメントにおけるアスタリスクはコンセンサスを表し、単一の完全に保存された残基が存在する部位を示します。その結果、鯨類において2つの保存されたフラグメントが見出されました。次に、候補となる配列断片を合成し、モノクローナル抗体の作製に使用します。まず、コロイド金溶液の最適pHを決定します。ここで最適pHとは、モノクローナル抗体とコロイド金溶液の混合液が2時間にわたって赤色を保持できる最小のpHと定義します。pH 5から9まで変化させた100 µLのコロイド金溶液に、0.15 µgの精製検出モノクローナル抗体を添加します。本デモンストレーションでは、pH 6とpH 8で検証を行います。この最適化ステップにより、pH 8が最適pHであると判断されました。次に、pH 8のコロイド金溶液 100 µLに、精製した検出用モノクローナル抗体をさまざまな量で添加し、モノクローナル抗体の最適濃度を決定します。本研究における最適濃度である6 µg/mLに設定することで、混合液の色を赤色に維持し、黒色の沈殿を生成させずに済みます。最適化ステップの結果に基づき、精製した検出用モノクローナル抗体60 µgを、10 mLのコロイド金溶液に滴下して加えます。この混合液を室温で10分間、緩やかに乳化させます。バックグラウンドの干渉を減らすため、PBSで調製した5%BSA溶液を2mL混合液に加え、室温で15分間穏やかに乳化させます。この混合液を4°Cで10,000 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、未結合の抗体を含む上清を注意深く取り除き、得られたペレットを1%BSAおよび0.1%Tween-20を含むPBS-T 4mLに懸濁させます。遠心分離と懸濁を1回または2回繰り返します。最終的な沈殿物を1mLのPBS-Tに懸濁し、使用まで4°Cで保存します。免疫ストリップの設計図をここに示します。段ボール、パッド、およびニトロセルロース膜の寸法はプロトコルの本文に記載されています。保存期間を延ばすため、イムノストリップの調製および組み立ては低湿度の研究室環境で行ってください。マイクロピペットを使用して、金コロイド標識モノクローナル抗体溶液をコンジュゲートパッドに飽和するまで加え、組み立て前に37 °Cで1時間乾燥させてください。コンジュゲートパッドが乾燥したら、両面テープを使用して、まずニトロセルロース膜をカードボードに貼り付けます。イムノストリッププリンターを用いて、ニトロセルロース膜のテストゾーンとコントロールゾーンに、それぞれ特異的抗原捕捉モノクローナル抗体と迅速抗マウスIGGを分注します。2つのゾーンの間には5ミリメートル以上の距離を維持してください。次に、ニトロセルロース膜の一方にコンジュゲートパッドを、もう一方に吸収パッドを貼り付け、各側のパッドを約2 mm重ねます。コンジュゲートパッドの上にサンプルパッドを2 mm重ねて、カードボードに貼り付けます。ペーパーカッターを使用して、幅6 mmのストリップを作成します。ストリップを乾燥剤とともにアルミホイル袋に封入し、使用時まで4°Cで保存します。交差反応試験のサンプルを調製するには、0.03 gの生筋組織に0.1% BSA含有PBSを1 mL加えます。その後、竹串または研磨棒を用いてサンプルを均質化します。免疫ストリップのテストエリアとは反対側の端を持ち、サンプルパッド部分を検体に5〜10分間浸します。結果を直接観察してください。さまざまな筋肉サンプルを3連（triplicate）でテストします。Tテストラインは、2種類のモノクローナル抗体がともに鯨類ミオグロビンを検出した際に陽性信号を示すように設計されています。非鯨類動物由来のミオグロビンは、これら2種類のモノクローナル抗体のうち一方しか検出できないため、他の動物の筋肉サンプルを検査した場合はテストラインは陰性の結果を示します。Cコントロールラインは、迅速抗マウスIGGがコロイド金標識検出抗体と結合するため、常に陽性の結果を示すはずです。コントロールライン（Control line）で不合格の結果が出た場合は、ストリップ上の材料の品質が低いことを示しています。ハイブリドーマ上清を用いたウェスタンブロット分析では、CGF5H9モノクローナル抗体が、鯨類およびその他の哺乳類を、予測分子量約17kDaの単一の染色バンドとして検出することが示されています。ミンククジラでは、他の鯨類のバンドと比較して、相対的に薄いバンドが認められます。マグロ、アザラシ、およびニワトリではバンドが認められません。一方、ブタでは約50kDaにバンドが観察されます。ドット血清分析によっても同一の結果が得られます。CSF1H13モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法による血液分析では、ブタおよびマグロにおいて複数の非特異的バンドが見られますが、CSF1H13は鯨類のみと反応するため、極めて特異性が高いと言えます。また、アザラシでは予測分子量である約17kDaにバンドが認められました。ドットブロット法による血液分析でも同様の結果が得られています。精製CGF5H9を用いた種異なる筋肉抽出液の間接ELISAの結果、ウシ、ヤギ、イヌ、ウサギ、および鯨類で陽性シグナルが、ブタで弱い陽性シグナルが認められ、マグロ、ニワトリ、およびアザラシでは陰性シグナルが認められた。CSF1H13は、鯨類およびアザラシに対して高い親和性を示す。これら両方のモノクローナル抗体は、異なる科に属する4種の鯨類すべてと強く反応することができ、多様な鯨類に対する広範な反応性が示された。免疫コロイダル金ストリップの特異性を、これらの代表的な結果に示します。非鯨類（cetacean）の筋肉試料を用いた場合、コントロールラインにのみ単一のバンドが現れます。一方、鯨類の筋肉試料を用いた場合は、テストラインとコントロールラインの両方にシグナルバンドが現れます。適切に実施すれば、標識抗体の調製とストリップの作製は、習熟した後は4時間で完了させることができます。この手順を行う際は、ペプチドを慎重に設計することが重要です。適切なモノクローナル抗体をスクリーニングするために、複数の手法を用いてください。また、標識抗体を調製するために高品質のコロイド金を使用してください。これらの手順に従い、クジラ類などの種やその由来といった追加の疑問を明らかにするために、PCRベースのDNA解析などの他の手法を行うことができます。強力で海洋哺乳類にのみ親和性を示すCSF1H13モノクローナル抗体は、さまざまな形式のELISAに利用でき、海洋哺乳類におけるミオグロビンの生物学的、生理学的、および化学的側面を研究するための多くの機会を提供します。このビデオを視聴することで、特異的なモノクローナル抗体を作製し、それをクイックテストストリップに適用する方法について深く理解することができます。

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