クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

このコロイド金免疫クロマトグラフ試験ストリップの総合的な目的は、鯨類のミオグロビンをアザラシやその他の動物のミオグロビンと区別することです。この手法により、鯨類肉の迅速かつオンサイトでのスクリーニングが可能となり、不法な取引や消費を抑制することができます。本技術の主な利点は、0.3 gの筋肉組織をホモジナイズした後、5〜10分で直接結果を確認できることであり、極めて高い特異性と感度を備えている点にあります。

したがって、本手法により、現場での鯨類肉の迅速な検出が可能となります。また、馬肉や豚肉などの他の食肉にも適用可能です。鯨類のミオグロビンに対して反応性を持つモノクローナル抗体を作製するための合成ペプチドを設計するために、さまざまな動物のミオグロビン抗原反応領域のアミノ酸配列を解析します。

まず、GenBankからマグロ、ニワトリ、ダチョウ、家畜哺乳類、アザラシ、および18種の鯨類から得られたミオグロビンのアミノ酸配列を取得します。次に、適切なソフトウェアを使用して配列アライメントを行います。起動バーの「Align Edit/Build Alignment」を選択して、Alignment Explorerを起動してください。

「Create New Alignment」を選択し、「OK」をクリックします。「DNA」と「Protein」のどちらの配列アラインメントを作成するかを問うダイアログが表示されます。「Protein」ボタンをクリックし、「Data」→「Open」→「Retrieve sequences from File」を選択して、配列ファイルを選択します。「Edit」メニューから「Select All」コマンドを選択し、マルチプルシーケンスアラインメントを作成するために、データセット内のすべての配列の全サイトを選択します。

メインメニューから「Alignment」を選択し、「Align by ClustalW」をクリックします。タンパク質重み行列として「BLOSUM」を選択し、「OK」ボタンをクリックします。3番目のステップは、配列アラインメントの解析です。

5つの抗原反応部位に着目し、鯨類の間で保存されているフラグメントを特定します。アライメントにおけるアスタリスクはコンセンサスを表し、単一の完全に保存された残基が存在する部位を示します。その結果、鯨類において2つの保存されたフラグメントが見出されました。

次に、候補となる配列断片を合成し、モノクローナル抗体の作製に使用します。まず、コロイド金溶液の最適pHを決定します。ここで最適pHとは、モノクローナル抗体とコロイド金溶液の混合液が2時間にわたって赤色を保持できる最小のpHと定義します。pH 5から9まで変化させた100 µLのコロイド金溶液に、0.15 µgの精製検出モノクローナル抗体を添加します。

本デモンストレーションでは、pH 6とpH 8で検証を行います。この最適化ステップにより、pH 8が最適pHであると判断されました。次に、pH 8のコロイド金溶液 100 µLに、精製した検出用モノクローナル抗体をさまざまな量で添加し、モノクローナル抗体の最適濃度を決定します。

本研究における最適濃度である6 µg/mLに設定することで、混合液の色を赤色に維持し、黒色の沈殿を生成させずに済みます。最適化ステップの結果に基づき、精製した検出用モノクローナル抗体60 µgを、10 mLのコロイド金溶液に滴下して加えます。この混合液を室温で10分間、緩やかに乳化させます。

バックグラウンドの干渉を減らすため、PBSで調製した5%BSA溶液を2mL混合液に加え、室温で15分間穏やかに乳化させます。この混合液を4°Cで10,000 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、未結合の抗体を含む上清を注意深く取り除き、得られたペレットを1%BSAおよび0.1%Tween-20を含むPBS-T 4mLに懸濁させます。

遠心分離と懸濁を1回または2回繰り返します。最終的な沈殿物を1mLのPBS-Tに懸濁し、使用まで4°Cで保存します。免疫ストリップの設計図をここに示します。

段ボール、パッド、およびニトロセルロース膜の寸法はプロトコルの本文に記載されています。保存期間を延ばすため、イムノストリップの調製および組み立ては低湿度の研究室環境で行ってください。マイクロピペットを使用して、金コロイド標識モノクローナル抗体溶液をコンジュゲートパッドに飽和するまで加え、組み立て前に37 °Cで1時間乾燥させてください。

コンジュゲートパッドが乾燥したら、両面テープを使用して、まずニトロセルロース膜をカードボードに貼り付けます。イムノストリッププリンターを用いて、ニトロセルロース膜のテストゾーンとコントロールゾーンに、それぞれ特異的抗原捕捉モノクローナル抗体と迅速抗マウスIGGを分注します。2つのゾーンの間には5ミリメートル以上の距離を維持してください。

次に、ニトロセルロース膜の一方にコンジュゲートパッドを、もう一方に吸収パッドを貼り付け、各側のパッドを約2 mm重ねます。コンジュゲートパッドの上にサンプルパッドを2 mm重ねて、カードボードに貼り付けます。ペーパーカッターを使用して、幅6 mmのストリップを作成します。

ストリップを乾燥剤とともにアルミホイル袋に封入し、使用時まで4°Cで保存します。交差反応試験のサンプルを調製するには、0.03 gの生筋組織に0.1% BSA含有PBSを1 mL加えます。その後、竹串または研磨棒を用いてサンプルを均質化します。

免疫ストリップのテストエリアとは反対側の端を持ち、サンプルパッド部分を検体に5〜10分間浸します。結果を直接観察してください。さまざまな筋肉サンプルを3連（triplicate）でテストします。

Tテストラインは、2種類のモノクローナル抗体がともに鯨類ミオグロビンを検出した際に陽性信号を示すように設計されています。非鯨類動物由来のミオグロビンは、これら2種類のモノクローナル抗体のうち一方しか検出できないため、他の動物の筋肉サンプルを検査した場合はテストラインは陰性の結果を示します。Cコントロールラインは、迅速抗マウスIGGがコロイド金標識検出抗体と結合するため、常に陽性の結果を示すはずです。

コントロールライン（Control line）で不合格の結果が出た場合は、ストリップ上の材料の品質が低いことを示しています。ハイブリドーマ上清を用いたウェスタンブロット分析では、CGF5H9モノクローナル抗体が、鯨類およびその他の哺乳類を、予測分子量約17kDaの単一の染色バンドとして検出することが示されています。ミンククジラでは、他の鯨類のバンドと比較して、相対的に薄いバンドが認められます。

マグロ、アザラシ、およびニワトリではバンドが認められません。一方、ブタでは約50kDaにバンドが観察されます。ドット血清分析によっても同一の結果が得られます。

CSF1H13モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法による血液分析では、ブタおよびマグロにおいて複数の非特異的バンドが見られますが、CSF1H13は鯨類のみと反応するため、極めて特異性が高いと言えます。また、アザラシでは予測分子量である約17kDaにバンドが認められました。ドットブロット法による血液分析でも同様の結果が得られています。

精製CGF5H9を用いた種異なる筋肉抽出液の間接ELISAの結果、ウシ、ヤギ、イヌ、ウサギ、および鯨類で陽性シグナルが、ブタで弱い陽性シグナルが認められ、マグロ、ニワトリ、およびアザラシでは陰性シグナルが認められた。CSF1H13は、鯨類およびアザラシに対して高い親和性を示す。これら両方のモノクローナル抗体は、異なる科に属する4種の鯨類すべてと強く反応することができ、多様な鯨類に対する広範な反応性が示された。

免疫コロイダル金ストリップの特異性を、これらの代表的な結果に示します。非鯨類（cetacean）の筋肉試料を用いた場合、コントロールラインにのみ単一のバンドが現れます。一方、鯨類の筋肉試料を用いた場合は、テストラインとコントロールラインの両方にシグナルバンドが現れます。

適切に実施すれば、標識抗体の調製とストリップの作製は、習熟した後は4時間で完了させることができます。この手順を行う際は、ペプチドを慎重に設計することが重要です。適切なモノクローナル抗体をスクリーニングするために、複数の手法を用いてください。

また、標識抗体を調製するために高品質のコロイド金を使用してください。これらの手順に従い、クジラ類などの種やその由来といった追加の疑問を明らかにするために、PCRベースのDNA解析などの他の手法を行うことができます。強力で海洋哺乳類にのみ親和性を示すCSF1H13モノクローナル抗体は、さまざまな形式のELISAに利用でき、海洋哺乳類におけるミオグロビンの生物学的、生理学的、および化学的側面を研究するための多くの機会を提供します。

このビデオを視聴することで、特異的なモノクローナル抗体を作製し、それをクイックテストストリップに適用する方法について深く理解することができます。