エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

この手順の全体的な目的は、フィルターで採取した浮遊粒子から抽出したエンドトキシンおよびDNA含量を正確に分析する方法について説明することです。この手法は、健康への影響を理解するなど、屋内および屋外のバイオエアロゾル研究における重要な疑問への回答に役立ちます。フィルターサンプリングの手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYinon Mazarです。

大量サンプリングを行う場合は、石英繊維製のフィルターを使用してください。または、研究ニーズに最も適した特定のフィルタータイプおよびフィルターのカットオフサイズを選択してください。有機化合物および生物学的化合物のサンプリングに使用するフィルターは、まず個別にアルミニウム箔で包み、予備焼成を行ってください。

その後、ラボ用電気炉を用いて450 °Cで5時間以上焼成します。これにより、既存の有機残留物がすべて除去されます。焼成したフィルターは、サンプリングに使用するまで20 °Cで保存してください。

次に、付随するテキストプロトコルに記載されているようなハイボリュームサンプラーを洗浄し、消毒します。その後、あらかじめ焼成したフィルターをフィルターカセットに入れ、メーカーの指示に従ってサンプラーを運転し、適切な試料を採取します。クラス2バイオセーフティキャビネット内で、清潔な1.12 centimeter径のコルクボーラーを用いて、清潔で焼成済みのフィルター材料を22枚の円形に切り出します。

これらのピースを使用して、コントロールとして用いるための一連のエンドトキシン添加フィルターを調製します。次に、採取したサンプルを含むフィルターを、清潔な直径1.12 centimeterのコルクボーラーで切り出し、各サンプルを個別のパイロゲンフリーの2 milliliterチューブに入れます。同様に、乾燥させたエンドトキシン添加フィルターも、個別のパイロゲンフリーの2 milliliterチューブに移します。

各チューブに1 mLのパイロジェンフリー水を加えます。次に、ラボシェーカーを用いて室温で60分間振盪します。その後、マイクロ遠心分離機を用いてサンプルチューブを375 ×gで10分間遠心分離します。

次に、エンドトキシンを含む上清を、新しいパイロジェンフリーの2 mLチューブに移します。エンドトキシン試験用に、蓋付きのパイロジェンフリーの96ウェル平底マイクロプレートを用意します。まず、サンプルの配置を決定してください。

次に、マイクロプレートリーダーの電源を入れ、37 °Cで5分ごとに振盪を行うキネティック反応に設定します。続いて、405 nmで測定を行います。この5分ごとの振盪とプレート読取りを18回繰り返します。

以前にフィルターへのスパイクに使用した標準エンドトキシン溶液を50 µLずつ、行A1からA10およびB1からB10に加えて、プレートに充填します。ブランクをA11、A12、B11、B12に配置します。次に、遠心分離したスパイクフィルター抽出液およびそのブランクの上清を行CおよびDに加えます。その後、必要に応じて、実験サンプルおよびブランクの上清を残りのウェルに加えます。

テストを活性化させるため、各ウェルに50 µLのlimulus amebocyte glycate溶液を迅速に加えます。プレートを水平に静かに揺すります。その後、プレートリーダーにセットして実験ランを開始します。

終了後、プレートリーダーからプレートを取り出します。標準曲線を用いて各サンプルのエンドトキシン量を決定し、サンプルフィルターからエンドトキシンが抽出された効率を算出します。まず、付随するテキストプロトコルに従って、DNAを添加したフィルターを準備します。

各フィルターサンプルについて、直径425～600 µmのガラスビーズ0.1 gと、直径106 µm以下のガラスビーズ0.3 gを、酸洗浄した混合物として0.5 mLの滅菌チューブに調製します。次に、消毒済みの直径1.12 cmのコルクボーラーを用いて、各フィルターサンプルのランダムに選択した箇所から3つの円形片を切り出します。切り出したフィルターサンプルを、個別のスクリューキャップ付き2 mLチューブに入れます。

次に、DNA抽出キットに付属の細胞溶解バッファー60 µLとともに、ガラスビーズ混合物を各チューブに加えます。チューブを閉じ、サンプルをビーズビーターにセットします。ビーズビーターを用いて、ろ過した細胞を1分間機械的に破砕し、その後、サンプルを氷上に1分間置いて冷却します。

このサイクルを5回繰り返します。キットサプライヤーのプロトコルに従い、溶解した細胞からDNAを抽出してください。溶出後、DNA回収率を向上させるために、溶出サンプルを抽出カラムに再度ロードしてください。

定量PCR装置を事前に電源ONにし、ウォームアップを行っておきます。新しいプログラムファイルを作成し、装置の操作ソフトウェアに定量PCRランの詳細情報を入力します。次に、作業面を表面DNA除染剤で消毒し、滅菌済みのチューブ、チップ、および試薬のみを使用してください。

また、作業台の横に氷を入れたバケツを置き、tac polemorarisミックスをそのバケツに入れます。付属のテキストプロトコルの表4に従って、定量PCR反応ミックスを調製します。そして、使用するまで反応ミックスを遮光し、氷上で保存します。

次に、作業面に触れないようにし、清潔な状態を維持するために、きれいなマイクロプレートをプレートホルダーに設置します。定量PCRマイクロプレートの各ウェルに、標準DNA、サンプルDNA、またはヌクレアーゼフリー水を1 µLずつ、3連（トリプリケート）で分注します。その後、各反応ウェルにマスター反応ミックスを9 µLずつ加えます。

完了後、プレートを光学粘着フィルムで覆い、全辺をしっかりと密封します。プレートバケットを備えた遠心機で、1000 ×gで1分間スピンダウンします。その後、サーモサイクラーにセットします。最後に、設定済みの定量PCRプログラムを起動し、実行します。

エンドトキシン抽出において、フィルターサンプルを遠心分離機で回転させ、フィルターからエンドトキシンを抽出します。遠心速度によって抽出効率が異なります。これは特に、エンドトキシン濃度が高い場合に顕著です。

選択した特定のフィルターおよび実施したプロトコルについて、抽出効率の予備試験を行う必要があります。クリーンなフィルターにスパイクした場合の抽出効率は、サンプリング済みの石英フィルターよりも高くなりますが、いずれの効率も標準溶液を直接検出した場合よりも低くなります。習熟すれば、適切に実施することでエンドトキシン分析を3時間半で完了させることができます。

この手順の後、大気中における生物の輸送に関するさらなる疑問を解消するために、DNAシーケンシングなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、大気サンプルフィルターからエンドトキシンとDNAを効率的に抽出し、それらを正確に分析する方法について十分に理解できるはずです。