Name: エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶエアサンプリングフィルタからのエンドトキシンとDNA抽出・定量分析法。石英繊維フィルターを用いた大気バイオエアロゾルの室内・室外環境解析に適した手法で、健康影響評価研究に貢献します。

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著者は、Weizmann Institute化学学部のYoav Barak博士の支援とアドバイスに感謝します。この研究は、イスラエル科学財団(助成金#913/12)と、ドイツ連邦教育研究省からの資金提供を受けたミネルバ財団の支援を受けました。

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<li>Costa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+carbonaceous+aerosols+in+Emilia-Romagna+%28Northern+Italy%29+based+on+two+fall%2Fwinter+field+campaigns%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Res%22%5BJournal%5D)">Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns.</a> Atmos. Res. , (2015).</li>
<li>Brent, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development%2C+enhancement%2C+and+evaluation+of+aircraft+measurement+techniques+for+national+ambient+air+quality+standard+criteria+pollutants+%5B%5D%22">Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]</a>. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Hospodsky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+airborne+fungal+and+bacterial+concentrations+and+emission+rates+in+six+occupied+children%27s+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms.</a> Indoor air. , (2014).</li>
<li>Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+Bacterial+Populations+Above+Desert+Soils+of+the+McMurdo+Dry+Valleys%2C+Antarctica%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica.</a> Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).</li>
<li>Ovadnevaite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+NE+Atlantic+marine+aerosol+chemical+composition+and+abundance%3A+Seasonal+trends+and+air+mass+categorization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Geophys.+Res.+Atmos%22%5BJournal%5D)">Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization.</a> J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).</li>
<li>Lodge, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ES%26T+Books%3A+Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%2C+3rd+ed%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed.</a> Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Aerosol+Measurement%3A+Principles%2C+Techniques%2C+and+Applications%22">Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications</a>. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Vincent, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVincent%2C+JH+%22Aerosol+Sampling%3A+Science%2C+Standards%2C+Instrumentation+and+Applications%22">Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2007).</li>
<li>Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Endotoxins+in+Bioaerosols+at+Workplace%3A+A+Critical+Review+of+Literature+and+a+Standardization+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue.</a> Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Lewtas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+combustion+emissions%3A+Characterization+of+causative+agents+and+mechanisms+associated+with+cancer%2C+reproductive%2C+and+cardiovascular+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.-Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects.</a> Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).</li>
<li>Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+as+a+possible+source+for+endotoxins+in+coastal+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total.+Environ%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas.</a> Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3A+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Diath.+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
<li>O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+production%3A+a+review+of+the+current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol production: a review of the current knowledge.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).</li>
<li>O'Dowd, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenically+driven+organic+contribution+to+marine+aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biogenically driven organic contribution to marine aerosol.</a> Nature. 431, 676-680 (2004).</li>
<li>Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+next-generation+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+with+quantitative+PCR+%28qPCR%29+for+enumeration+of+Cryptosporidium+oocysts+in+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples.</a> Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).</li>
<li>Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+enumeration+of+airborne+biocontaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Detection and enumeration of airborne biocontaminants.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).</li>
<li>Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+housing+characteristics+on+bacterial+and+fungal+communities+in+homes+of+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children.</a> Indoor air. , (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+emissions+as+a+primary+source+of+airborne+allergenic+fungal+particles+in+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms.</a> Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6, 1801-1811 (2012).</li>
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<li>Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+enhancement+in+the+analysis+of+airborne+endotoxin+levels+in+various+occupational+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Ind+Hyg+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments.</a> Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).</li>
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<li>Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Endotoxin+Testing+Methods+for+Pharmaceutical+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm+Compd%22%5BJournal%5D)">Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products.</a> Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).</li>
<li>Ebentier, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+a+suite+of+qPCR-based+microbial+source+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods.</a> Water Res. 47, 6839-6848 (2013).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

この作品は、フィルター上に採取したエアロゾル試料中のエンドトキシンおよび存在するDNAの両方を定量化するための抽出および検出方法について説明します。方法は、正確なルーチンを必要とし、限り実験者は、ここで説明するいくつかの本質的で重要なポイントに付着するように容易に行うことができます。 エンドトキシン検出ステップでは、ライセート溶液は非常に粘性であり、ピペッティングの際に泡を生成する傾向があることに注意してください。あなたが泡除去することは困難である、と彼らは、マイクロプレートリーダー値に変化をもたらします。したがって、まず、プレートにのみ、すべての泡が消えていることを確認した後、サンプルを配置ライセート溶液の添加を継続することが重要です。この段階で気泡形成を防止するための有用な技術をピペットでゆっくりと動作するように、ウェルへの溶解液を排出する際にすべての方法、それを押すことではありません。溶解物をendotoに追加されると即座に反応が開始されるようにXIN抽出物は、できるだけ早く読み取りを開始することが不可欠です。溶解物添加工程を短縮するため、マルチチャネルピペットを使用すること...

フィルター上の空気サンプリングは、大気エアロゾル研究の基本的なツールである。1サンプリングフィルタは、様々な化学的、物理的、および収集した周囲の粒子の生物学的特徴付けのための出発点です。2-11このアプローチの利点は、様々な分析ができることです同じサンプルでオフラインで実行。たとえば、12,13は大気科学に複雑な問題を解決するために集められた粒子と助剤の特性を十分に理解を得るために、研究者を可能にするすべての異なる分析からのデータをコンパイル、同じ時に撮影した海洋と内陸空気サンプル期間がこの研究のためにサンプリングされた粒子の毒性及び生物学的組成物。14に対して比較することができる、リポ多糖（LPS）、また内毒素としても知られているグラム陰性細菌の細胞壁の構成要素は、海岸オンとでサンプリングフィルタから抽出しました。内陸部位、および使用して評価しました。カブトガニアメーバ様細胞溶解液（LAL）試験。並行して、ゲノム細菌のコンテンツの評価（総細菌、グラム陰性、およびシアノバクテリア）が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）を使用して同じサンプルについて行きました。 LAL試験はエンドトキシンを含有する水溶液に、カブトガニ、 カブトガニからのアメーバ様細胞の水性抽出物の添加後に形成された濁度の測定値に基づいています。試料中のエンドトキシン濃度を、高速濁度が発生高い。15、Q-PCR分析は、特定のDNA断片が増幅されるように放出された蛍光信号に基づいている。16個の信号のリアルタイムモニタリングによりPCRの対数期の間の反応および標準曲線を用いて較正し、初期DNA量を定量することができます。これら二つの組み合わせは、他の場所で詳述されるように、14は、エンドトキシンとのレベルの良好な推定を提供することができ、他の人と一緒に分析しますサンプルソースの細菌の量。 ここで提示された方法の目的は、フィルターから抽出したバイオエアロゾルのエンドトキシンとDNA含有量の高精度で信頼性の高い分析を得ることです。エアロゾルの物理的および無機化学的特性をサンプリングするための方法はよく知られており、最近では、方法は、その有機物成分を調査するために開発されてきたが、17エアロゾルの生物学的成分に乏しい研究があった。18根拠電流のこの方法は、具体的に、抽出分析、及び空気中のエアロゾルの生物学的部分を同定するための強力な方法を提示することによって、このギャップを解決することである。14 ここでの詳細な方法は、フィルタの分析を含む生物学的な屋内と屋外のエアロゾル研究プロジェクトに広範な用途を見出すことが期待される。20-24

<table><tbody><tr><td>Filter サンプリング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - 大容量エアサンプラー</td><td>Ecotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz Microfiber Filters</td><td>Whatman</td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - 実験室チャンバー炉</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>オパール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Endotoxin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td>シグマアル<td>ドリッチ</td><td>16368&nbsp;</td><td>ラボ用試薬、96%</td></tr><tr><td>エアストリームクラスII生物学的安全キャビネットAC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>Control Standard Endotoxin Associates</td><td>of Cape Cod, Inc. (ケープコッド社)</td><td>E0005-1</td><td>大腸菌&nbsp;O113:H10、0.5 &micro;g /バイアル 1パック</td></tr><tr><td>LAL試薬 Water</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 滅菌シリンジ Luer-Lok Tip</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309605</tr><tr><td>BD Precisionglideシリンジニードル</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>305129</td><td>滅菌&nbsp;</td></tr><tr><td>パラフィルム-M シーリングテープ</td><td>パラフィルム</td><td>P7543</td><td>シグマ カタログ番号</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml、パイロジェンフリー</td></tr><tr><td>直径 1.12 cm コルクボーラー</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601 BD シリーズ - スチール</td><td>さまざまな直径のボーラーを含むコルクボーラーセットの一部。&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mmペトリ皿</td><td>Miniplast Ein-Shemer</td><td>72050-01</td>無<td>菌</td></tr><tr><td>渦の魔神2&nbsp;</td><td>サイエンティフィック・インダストリーズ(株)</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機 5415 D</td><td>エッペンドルフ</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI 蓋付き</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>平底ウェル (蓋付き (個包装))、滅菌済み、パイロジェンフリー</td></tr><tr><td>Synergy HT マルチ検出マイクロプレートリーダー</td><td>Biotek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 離れて</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>対象微生物種の標準DNA</td><td>ATCCまたは他の培養コレクション</td><td></td><td>DNA抽出に適した微生物株または抽出されたDNAのいずれか</td></tr><tr><td>ノイバウアー改良</td>型<td>マリエンフェルト</td><td>640030</td><td>血球計算盤</td></tr><tr><td>TE バッファー、低 EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)&nbsp;0.1 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーPCR用水&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td>PCRプライマー</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>関心のある微生物種を標的</td></tr>に <tr><td>二重標識プローブ</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>関心のある微生物種を標的</td></tr>に <tr><td>スクリューキャップチューブ</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PowerSoil DNA抽出キット&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ、酸洗浄425-600&micro;m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ、酸洗浄 <106 &マイクロ;m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>細胞溶解バッファー、パワーソイルキット</td></tr><tr><td>マジックタッチアイスバケツ</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>FastSYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Splash-Free 96-Well Base</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>ローター A-4-62 MTPバケット付き&nbsp;</td></tr></tbody></table>

エンドトキシンとdnaコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

屋外のエアロゾル研究は、一般的にフィルターにサンプリングされた粒子状物質を使用しています。この手順では、収集された粒子の様々な特徴付けは、並列に実行されることを可能にします。ここで提示された方法の目的は、フィルターから抽出したバイオエアロゾルのエンドトキシンとDNA含有量の高精度で信頼性の高い分析を得ることです。サンプリングされたフィルタのようなリポ多糖類のような高分子量の有機分子の抽出は、発熱物質を含まない水ベースの培地中で試料を振盪することを含みます。その後の分析は、濁度測定を用いて検出することができる酵素反応に基づいています。サンプリングされたフィルタの高い有機含有量の結果として、試料からのDNAの抽出は、元々の土壌のために設計され、DNAの収量を改善するために変更された市販のDNA抽出キットを用いて行われます。定量的ポリメラーゼ連鎖をReactiを使用して、特定の微生物種の検出および定量（Q-PCR）分析に説明し、他の利用可能な方法と比較されます。

それは、「オフライン」サンプリングフィルタの解析を用いた大気エアロゾルを勉強するのが一般的である（ 図2を参照）。32化学をサンプリング問題、有機（ 例えば、タンパク質、炭化水素分子、糖類）と無機（ 例えば 、金属、塩）を含むコンテンツの分析。生物学的分析は、生存および非生存微生物コンテンツ、DNAのアプローチや顕微鏡を用いて種の同定、ならびにDNAに基づく定量化が含まれます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53444/53444fig2.jpg" /> 図2： ファイラー検体分析 フローチャート空気サンプリング（A）の後にフィルタ、下流分析（B）、</st...

ここでは、空気サンプルフィルターからの大気中の生物学的粒子の2つの補完的な分析が説明されています:エンドトキシンとDNAの抽出と検出です。

エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

この手順の全体的な目的は、フィルターで採取した浮遊粒子から抽出したエンドトキシンおよびDNA含量を正確に分析する方法について説明することです。この手法は、健康への影響を理解するなど、屋内および屋外のバイオエアロゾル研究における重要な疑問への回答に役立ちます。フィルターサンプリングの手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYinon Mazarです。大量サンプリングを行う場合は、石英繊維製のフィルターを使用してください。または、研究ニーズに最も適した特定のフィルタータイプおよびフィルターのカットオフサイズを選択してください。有機化合物および生物学的化合物のサンプリングに使用するフィルターは、まず個別にアルミニウム箔で包み、予備焼成を行ってください。その後、ラボ用電気炉を用いて450 °Cで5時間以上焼成します。これにより、既存の有機残留物がすべて除去されます。焼成したフィルターは、サンプリングに使用するまで20 °Cで保存してください。次に、付随するテキストプロトコルに記載されているようなハイボリュームサンプラーを洗浄し、消毒します。その後、あらかじめ焼成したフィルターをフィルターカセットに入れ、メーカーの指示に従ってサンプラーを運転し、適切な試料を採取します。クラス2バイオセーフティキャビネット内で、清潔な1.12 centimeter径のコルクボーラーを用いて、清潔で焼成済みのフィルター材料を22枚の円形に切り出します。これらのピースを使用して、コントロールとして用いるための一連のエンドトキシン添加フィルターを調製します。次に、採取したサンプルを含むフィルターを、清潔な直径1.12 centimeterのコルクボーラーで切り出し、各サンプルを個別のパイロゲンフリーの2 milliliterチューブに入れます。同様に、乾燥させたエンドトキシン添加フィルターも、個別のパイロゲンフリーの2 milliliterチューブに移します。各チューブに1 mLのパイロジェンフリー水を加えます。次に、ラボシェーカーを用いて室温で60分間振盪します。その後、マイクロ遠心分離機を用いてサンプルチューブを375 ×gで10分間遠心分離します。次に、エンドトキシンを含む上清を、新しいパイロジェンフリーの2 mLチューブに移します。エンドトキシン試験用に、蓋付きのパイロジェンフリーの96ウェル平底マイクロプレートを用意します。まず、サンプルの配置を決定してください。次に、マイクロプレートリーダーの電源を入れ、37 °Cで5分ごとに振盪を行うキネティック反応に設定します。続いて、405 nmで測定を行います。この5分ごとの振盪とプレート読取りを18回繰り返します。以前にフィルターへのスパイクに使用した標準エンドトキシン溶液を50 µLずつ、行A1からA10およびB1からB10に加えて、プレートに充填します。ブランクをA11、A12、B11、B12に配置します。次に、遠心分離したスパイクフィルター抽出液およびそのブランクの上清を行CおよびDに加えます。その後、必要に応じて、実験サンプルおよびブランクの上清を残りのウェルに加えます。テストを活性化させるため、各ウェルに50 µLのlimulus amebocyte glycate溶液を迅速に加えます。プレートを水平に静かに揺すります。その後、プレートリーダーにセットして実験ランを開始します。終了後、プレートリーダーからプレートを取り出します。標準曲線を用いて各サンプルのエンドトキシン量を決定し、サンプルフィルターからエンドトキシンが抽出された効率を算出します。まず、付随するテキストプロトコルに従って、DNAを添加したフィルターを準備します。各フィルターサンプルについて、直径425～600 µmのガラスビーズ0.1 gと、直径106 µm以下のガラスビーズ0.3 gを、酸洗浄した混合物として0.5 mLの滅菌チューブに調製します。次に、消毒済みの直径1.12 cmのコルクボーラーを用いて、各フィルターサンプルのランダムに選択した箇所から3つの円形片を切り出します。切り出したフィルターサンプルを、個別のスクリューキャップ付き2 mLチューブに入れます。次に、DNA抽出キットに付属の細胞溶解バッファー60 µLとともに、ガラスビーズ混合物を各チューブに加えます。チューブを閉じ、サンプルをビーズビーターにセットします。ビーズビーターを用いて、ろ過した細胞を1分間機械的に破砕し、その後、サンプルを氷上に1分間置いて冷却します。このサイクルを5回繰り返します。キットサプライヤーのプロトコルに従い、溶解した細胞からDNAを抽出してください。溶出後、DNA回収率を向上させるために、溶出サンプルを抽出カラムに再度ロードしてください。定量PCR装置を事前に電源ONにし、ウォームアップを行っておきます。新しいプログラムファイルを作成し、装置の操作ソフトウェアに定量PCRランの詳細情報を入力します。次に、作業面を表面DNA除染剤で消毒し、滅菌済みのチューブ、チップ、および試薬のみを使用してください。また、作業台の横に氷を入れたバケツを置き、tac polemorarisミックスをそのバケツに入れます。付属のテキストプロトコルの表4に従って、定量PCR反応ミックスを調製します。そして、使用するまで反応ミックスを遮光し、氷上で保存します。次に、作業面に触れないようにし、清潔な状態を維持するために、きれいなマイクロプレートをプレートホルダーに設置します。定量PCRマイクロプレートの各ウェルに、標準DNA、サンプルDNA、またはヌクレアーゼフリー水を1 µLずつ、3連（トリプリケート）で分注します。その後、各反応ウェルにマスター反応ミックスを9 µLずつ加えます。完了後、プレートを光学粘着フィルムで覆い、全辺をしっかりと密封します。プレートバケットを備えた遠心機で、1000 ×gで1分間スピンダウンします。その後、サーモサイクラーにセットします。最後に、設定済みの定量PCRプログラムを起動し、実行します。エンドトキシン抽出において、フィルターサンプルを遠心分離機で回転させ、フィルターからエンドトキシンを抽出します。遠心速度によって抽出効率が異なります。これは特に、エンドトキシン濃度が高い場合に顕著です。選択した特定のフィルターおよび実施したプロトコルについて、抽出効率の予備試験を行う必要があります。クリーンなフィルターにスパイクした場合の抽出効率は、サンプリング済みの石英フィルターよりも高くなりますが、いずれの効率も標準溶液を直接検出した場合よりも低くなります。習熟すれば、適切に実施することでエンドトキシン分析を3時間半で完了させることができます。この手順の後、大気中における生物の輸送に関するさらなる疑問を解消するために、DNAシーケンシングなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、大気サンプルフィルターからエンドトキシンとDNAを効率的に抽出し、それらを正確に分析する方法について十分に理解できるはずです。

air-sampled-filter-analysis-for-endotoxins-and-dna-content

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Environment

環境

このビデオは、化学発光ベースの方法により全血サンプル中のエンドトキシン活性を調査するための迅速なバイオアッセイを示しています。このアッセイは、エンドトキシン媒介性敗血症の早期診断のための迅速で高感度なバイオマーカー検査です。...

エンドトキシン活性アッセイ:血液サンプル中のエンドトキシン活性を調査するための化学発光ベースのバイオアッセイ

このビデオでは、PEG化リポソームドキソルビシンナノ製剤におけるエンドトキシン汚染を推定するためのLimulusアメーバサイト溶解物(LAL)アッセイの比濁法形式について説明しています。エンドトキシンとLAL試薬との反応後の溶液の濁度は、サンプル中のエンドトキシンを推定するのに役立ちます。...

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Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay:ナノ粒子製剤中の細菌エンドトキシン検出法

このビデオは、マクロファージにおける転写因子核因子-κ-B(NF-κB)および活性化因子タンパク質-1(AP-1)のToll様受容体(TLR)依存性活性を調べるアッセイを示しています。TLRは、損傷関連分子パターン(DAMP)を認識すると炎症誘発性シグナル伝達カスケードをトリガーし、NF-κBおよびAP-1を活性化します。遺伝子操作されたレポーターマクロファージは、NF-κBおよびAP-1の活性化により分泌された胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)酵素を産生し、これは発色反応によって検出されます。...

マクロファージにおけるTLR依存性NF-&kcy;B/AP-1転写因子シグナル伝達のアッセイ

私たちは、フィルターカートリッジによる水サンプルのろ過と、フィルターを取り外すためにハウジングを切り開くことなく環境DNA(eDNA)を抽出するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、魚由来のeDNAをメタバーコード化するために開発されましたが、他の生物由来のeDNAにも適用できます。...

ろ過水のサンプルおよび環境DNAの抽出のためのフィルターカートリッジの使用

環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA...

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

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環境の粒子状物質の生物学的組成を理解することは、その人間の健康や病気の広がりの重要な影響の研究にとって重要です。ここでは、異なる環境条件下における浮遊微生物をよりよく調べるバイオエアロゾル サンプリング方法の 3...

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

ナノのエンドトキシンの検出は、ナノメディシン分野の難問の 1 つを表します。ナノ粒子の潜在的なエンドトキシン汚染を推定する 3 種類のラール...

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

このプロトコルは、生体材料インプラント微小環境をモデル化する様々なポリマー表面および吸着タンパク質層に応答して、マウスマクロファージ細胞株におけるTLR依存性NF-аb/AP-1転写因子活性を測定する迅速かつ間接的な方法を研究者に提供する。...

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信頼性が高く正確な現場展開可能なDNA分析は、多くの産業にとって非常に重要です。本論文では、現場での環境微生物分析のための2つの方法を提案します。1) 生物学的抽出フィールドキットを用いた環境サンプルから微生物DNAを分離する方法、2) フィールドqPCRユニットを用いたDNA解析です。...

生物学的抽出フィールドキットとフィールドqPCRユニットを用いた現地での微生物DNA解析

学ぶエアサンプリングフィルタからのエンドトキシンとDNA抽出・定量分析法。石英繊維フィルターを用いた大気バイオエアロゾルの室内・室外環境解析に適した手法で、健康影響評価研究に貢献します。

エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

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