Name: マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 学ぶプロバイオティクス酵母Saccharomyces boulardiiの形質転換法とマウス消化管免疫組織への回収技術。抗生物質非依頼の遺伝子操作と経口ワクチン研究への応用を解説します。

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著者らは、トレイシーJ.ラムに授与免疫とワクチンおよびNIH新イノベーター賞（1DP2AI112242-01）のための児童センターを通じて資金調達を認めます。著者らはまた、RAD1 Sの寛大な貢献のためナタリアP. Degtyarevaに感謝セレビシエ 。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

一緒に、プロトコルは、本明細書中に腸への異種治療用タンパク質の送達のための栄養要求性プロバイオティクス酵母株の開発とテストのために必要な基本的な手順を説明します。この操作および組換えプロバイオティクス酵母のテストは、個々の研究室では現在、慣れていない可能性があるとの技術とリソースが必要です。多数の以前の研究では、複数の酵母とマウスの株については、上記のプロトコルを説明したがこのように、これらの方法では、筆者の知る限り詳細な、統一された形で提示されていません。さらに、本原稿は、一般的に使用される実験室酵母株未満の十分に特徴づけされているプロバイオティクス酵母の遺伝子操作のための現在の標準化されたプロトコルを、適応に特に重点を置きます。 （パート1で説明した）突然変異誘発および形質転換（パート2）の両方のための多くのステップは、このような二倍体の操作のために最適化されなければならない、プロバイオティクス酵母isolatエス。本稿では、動物の扱い（パート3）と小腸のパイエル板免疫組織（パート4）の解剖に関連する潜在的な落とし穴を説明します。 多くの産業および臨床的に関連する酵母株は、大規...

プロバイオティック微生物は、効率的かつ経済的に消化管に異種タンパク質を提供する魅力的な潜在的な手段です。これらの生物は、まだ1コロニーを形成しない消化管通過を存続制御の投与を可能にし、薬物が発現への曝露を制限することが可能です。また、簡単に大規模で異種タンパク質を産生するために、これらの生物を設計する能力は、それらを合成送達粒子への経済的な代替をレンダリングします。しかし、このようなアプローチの開発は、最近2 ブラウディプロバイオティクス酵母サッカロマイセスの栄養要求株を用いて実証されたように、実験技術の知識が伝統的に酵母および分子生物学から動物取扱技術および免疫学的方法に至るまで、与えられた研究の中に結合していない必要があります。したがって、本明細書に記載の個々の手順は、それ自体では小説ではありませんが、実験室プロトコルは、本稿の目的は、マウス消化管への薬物送達ビヒクルとしてプロバイオティクス酵母の実験的試験のために必要な技術と統合された導入を提示することです。提供に不可欠なプロトコルをまとめたものです：簡単に遺伝的に操作することができる酵母の栄養要求性変異株の1）の生成は、酵母培養物の2）の形質転換は、異種タンパク質を発現します。強制経口投与を介して腸への組換え酵母の3）投与;そして4）その異種タンパク質発現のマウス腸及び評価から実行可能な組換えプロバイオティクス酵母の回復を。 多数の正および負の選択方法は、酵母種の操作のために存在するが、まず、このような栄養要求性マーカーの使用を介して負の選択は、酵母を形質転換し、選択することができる効率および容易さの両方を増加させます。共同での抗生物質を使用して形質転換体の正の選択、ntrast、大幅酵母操作のコストを増加させます。また、抗生物質を含む固体培地上での酵母の選択が出て、合成ドロップ固形培地（未発表の観察）での栄養要求性酵母の選択に相対的な形質転換されていないバックグラウンドコロニーの増加成長を可能にすることができます。栄養要求性酵母は、必須アミノ酸またはウラシルの合成のための重要な酵素を欠いている株です。このような酵母は、酵母は不可欠な代謝産物を欠いているメディアアウト合成ドロップ上にめっきされたときにこのように、負の選択を可能にする、不足している代謝物または代謝遺伝子を補充した場合にのみ成長することができます。多くの一般的に使用されるサッカロマイセス・セレビシエ実験室株は、すでに実際には栄養要求性変異株3です。工業、臨床、およびプロバイオティクス酵母株は、しかし、一般的にすべての必要な栄養素を合成する能力を持つ原栄養です。このような酵母のより効率的な遺伝子操作を有効にするには、栄養要求性遺伝子を選択的に標的とすることができます抗生物質を含まない選択することができる株を生成します。 6 -栄養要求性マーカー遺伝子の標的特異的4を標的 CRISPR / Cas9を通してより最近、相同組換えに頼るまたはPCR媒介性の遺伝子破壊を介して達成することができます。また、UV突然変異誘発は、すぐにでも、複数のプラスミドを用いた形質転換は7技術的に困難な酵母株に栄養要求性変異体を生成することができます。 PCRの標的化およびCRISPR / Cas9が広範囲に他の場所に記載されているが、この写本の一つは負の選択ではなく、酵母形質転換体の正の抗生物質の選択を可能にする栄養要求株を作成するために、UV突然変異誘発アプローチを説明する詳細なプロトコルである部分で提示。 異種タンパク質の経口送達のためのそのような栄養要求性株の使用で次の必要なステップでは、プラスミドDNAと酵母の形質転換です。賛否の最初の成功の変換以来1978年8 サッカロミセス・セレビシエについて報告Tスフェロプラストは、多数の変更は、効率を高め、酵母種の遺伝的に改変することができると容易に特徴付けられています。 S.へのDNAの形質転換の成功のためのエレクトロポレーションの使用セレビシエは、最初の 1985年9で説明した、それ以来浸透圧的支持細胞10から1 Mソルビトールインキュベーションの添加によって改善されました。エレクトロポレーションの効率はさらに酵母種および株、細胞数及び増殖の位相、電気容量、電界強度、および特定のバッファ11に依存することが示されています。それは特別な機器を必要としないように元々伊藤ら 12によって記載リチウムアセテート（LiOAc）変換は、最も一般的に使用される形質転換プロトコルの一つです。さらなる分析は、細胞が中期対数期に回収されたときLiOAc酵母形質転換の効率が大幅に増加することを示しました成長及びC 12 42℃でポリエチレングリコール（PEG）及びDNAの存在下で熱ショックを与えています。 PEGと全体無傷の酵母のインキュベーションは、おそらく、細胞膜へのDNAの付着を向上させることを通じて、ならびに膜13上の他の効果を経由して、効率的な形質転換のために不可欠です。リチウム自体も無傷の細胞14の透過性を増大させます。なお、ほとんどの実験室S.セレビシエ株は容易LiOAc変換3を用いて形質転換することができ、他の酵母種は、より効率的に代替プロトコルを用いて形質転換することができる。 ピキア・パストリス 、例えば、最も効率的にエレクトロポレーションではなく、LiOAc変換13を介して変換される。これは、複数のテストするため、重要です遺伝的に特徴づけられていない酵母株を変更しようとすると、インキュベーション期間および試薬濃度を最適化するための形質転換の方法および。この原稿は、このようにLiOAc trの両方を記述栄養要求性変異株と野生型S.の形質転換のための技術としてansformationとエレクトロポレーションブラウディ 。興味のある読者は、酵母形質転換、代替プロトコル、およびアクション13,15の可能なメカニズムのさらなる議論の進化の徹底的な説明については、最近のレビューに向けられています。プラスミドは簡単に検出可能なタンパク質をコードする酵母の形質転換は、異種タンパク質の適切な発現および機能を確保するために、下流のテストのために、さらに不可欠です。無数の異なるタンパク質は、治療研究と、ELISAを免疫ブロッティングによるタンパク質の検出のために利用可能な抗体、および他の技術の最終的な目的に応じて適宜選択することができます。これらの技術のためのプロトコルは、完全に別の箇所16,17に記載されている、標準曲線と比較することによって形質転換された酵母からの異種タンパク質の産生のレベルを決定するために用いることができます。デモの目的のために、ショーへ酵母の生物学において非常に一般的に使用されるタンパク質の産生に成功し、この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して、後続の検出を可能にコードするプラスミド緑色蛍光タンパク質（GFP）との変換を示します。 異種タンパク質を発現するプロバイオティック生物の生産にも同様に重要な部分3および4に記載されているように、胃腸組織内のこれらの微生物の適切な投与および検出です。強制経口投与を介して組換え酵母の投与からC57BL / 6マウスを、直接胃に酵母の制御された量の送達を可能にする自然18嘔吐することができません。しかし、不適切な動物の取り扱いと強制経口投与は、食道損傷や穿 ​​孔、胃穿孔、気管内投与、および誤嚥性肺炎19,20につながることができます。悪い技術と経験不足はさらに、マウスの免疫応答と実験RESUの変動を増加させることができます強制経口投与21,22時に動物のストレスに起因しているLTS、。適切な手法で実践は、このように、動物の不快感を減衰させることができるだけでなく、実験結果の精度を高めることができます。本稿では説明し、組換え酵母の制御された用量の投与のための動物の取り扱いと強制経口投与を示しています。 最後に、酵母および異種タンパク質の存在のためのリンパ組織を分析することによって組換え酵母の配信の成功を確認することが重要です。最も簡単かつ予測酵母の存在について試験することができる胃腸の免疫組織がパイエル板です。パイエル板は、粘膜免疫応答の誘導23の主要な部位である小腸に沿って二次リンパ器官です。内腔からの抗原は、上皮でmicrofold（M）細胞を介してtranscellularly転送され、パイエル板中に放出され、このように同封さらしますD抗原腸の管腔内容物に細胞を提示します。腸上皮を横切る粒子の取り込みはまた、杯細胞によって達成することができますが、これらの細胞のみを取る粒子径24で0.02μm未満に示されています。経上皮樹状突起はまた、腸管腔25から小さな粒子を取るCD103 +樹状細胞（DC）から延長しました。しかし、CD103 + DCは、細菌よりも大きな粒子を取ることが実証された報告は現在のところ存在しません。したがって、無傷のプロバイオティック酵母は、直径が3~6ミクロンの間の平均サイズ、M細胞によって取り込まれ、パイエル板に転写される可能性が最も高いです。ここで説明するこの手順では、簡単にプロバイオティクス細菌の取り込みを評価するために適合させることができるものの、生存可能な遺伝子組換え酵母のためのパイエル板の収集およびスクリーニングするためのプロトコルです。 要約すると、送達するための組換えプロバイオティクス酵母を評価します腸へrapeuticタンパク質は、動物の取り扱いおよび免疫学に分子生物学に及ぶ実験技術に習熟する必要があります。 1のためにここに提示されているプロトコル）を簡単に否定的に抗生物質を含まない選択することができます生成と栄養要求性酵母株のスクリーニングは、2）代替プロトコルは、酵母を形質転換し、異種タンパク質の発現を可能にする、3）適切な動物ハンドリング技術とのための強制経口投与のデモンストレーション組換え酵母の胃内送達、およびパイエル板の解剖のための4）プロトコル、生存組換え酵母で機能的異種タンパク質をスクリーニングします。組み合わせることで、これらのプロトコルは、胃腸管に異種治療用タンパク質を送達することができるプロバイオティクス酵母株の生成およびテストを可能にします。

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 分光光度計</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>酵母培養の細胞濃度とOD600を決定するための分光光度計の例</td></tr><tr><td>ニューブランズウィック ローラードラム</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1053-4004</td><td>酵母培養インキュベーション用ローラードラムの例</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Stratalinker</td></tr><tr><td>スチュアートコロニーカウンター SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>プレートスタンド、拡大記録付き、ペンSciencewareコロニーカウンターからの感知圧力によるコロニーカウント</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>手持ちコロニーカウンターペン</td></tr><tr><td>レプリカメッキデバイス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>09-718-1</td><td>レプリカメッキスタンドとパッドの例&nbsp;</td></tr><tr><td>ベルベットスクエアフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>09-718-2L</td><td></td></tr><tr><td>型滅菌セルスプレッダー&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボ核酸、サケ精巣からの一本鎖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>酵母LiOAc形質転換用サンプルキャリアDNA</td></tr><tr><td>強制針</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp;002</td><td>15-20 gのマウスの場合、推奨される針は22ゲージ(1.25 mmボール)、1インチの長さのまっすぐな再利用可能な強制針です。体重が20より大きいマウスの場合&nbsp;g、20ゲージ以上の直線または湾曲した強制針を使用することができます</td></tr><tr><td>1mlの滅菌スリップチップ使い捨てツベルクリン注射器</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡科学などの鈍い鉗子 科学 7インチ(178mm)の鋸歯状の先端、広いグリップ鉗子</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>77937-28</td><td>解剖に必要な鈍い鉗子の例&nbsp;</td></tr><tr><td>直線および湾曲した解剖ハサミ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72966-02および72966-03</td><td>解剖に必要なハサミの例</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life技術</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

開発により、粘膜免疫系をより直接的に標的とすることが可能になり、胃腸障害と戦う能力が向上するでしょう。特にプロバイオティクス酵母をこのアプローチに適応させることには、いくつかの利点があります。これらの株は、多種多様な複雑な異種タンパク質を合成する可能性だけでなく、腸を通過する間にそれらのタンパク質を生き残り、保護することもできる。しかし、重要なことに、このアプローチには、通常は併用されない多くの多様なラボ技術の専門知識が必要です。さらに、酵母形質転換の個々のプロトコルは、一般的に使用される実験室株に対して十分に特徴付けられていますが、ここでは、代替アプローチと、あまり特性化されていないプロバイオティクス株の形質転換を最適化することの重要性に重点が置かれています。これらの方法を詳述することは、経口薬物送達媒体としてプロバイオティクス酵母を試験するための最良のアプローチに関する議論を促進するのに役立ち、実際に胃腸療法のためのこの新しい戦略の開発を進めるのに役立ちます。

UV照射後の生存曲線の生成は、別個のコロニー形成単位（CFU）を形成することができるように希釈された酵母細胞のプレーティングを必要とします。上記のように収集された各500μlのサンプルは、約5×10 6個の細胞が含まれています。しかし、プレート当たり100以上のコロニーが正確に区別することが困難です。希釈していない試料ならびに照射細胞の連続1時10希釈をプレーティングすることは、したがって、図1に示されているように、CFUは、各UV線量で列挙することができることを保証する。希釈係数を乗じたCFUカウントは、その後の総数で割って各用量での生存率を決定するために、各500μlのサンプル中の元照射された細胞。 図2は、二倍体野生型Sの計算された割合を示していますブラウディ細胞0μJ、5000μJ、万μJ、15,000μJ20,000μJ、22,500μJ、25,000を生き残ることができますμJ、35,000μJ、および50,000μJ。これらのデータ...

ここで提示は、開発変換、管理、およびプロバイオティクス酵母サッカロマイセス・ブラウディの異種タンパク質の発現を試験するために使用することができる技術の統一説明します。

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

これらの手順の総合的な目的は、異種タンパク質を発現させ、マウスの胃腸管へと届けるための形質転換が容易なプロバイオティック酵母株を開発することです。これらの手法の主な利点は、プロバイオティック酵母の栄養要求性株を迅速に作製できることです。これにより、これらの変異酵母を抗生物質による選択に頼ることなく遺伝的に操作することが可能になります。マウスへの経口投与およびパイエル斑の採取により、変異酵母の胃腸免疫組織への付着を確認することも可能です。これらの手法は、経口ワクチンの分野における重要な疑問への回答に寄与し、胃腸治療薬を届けるためのプロバイオティクスの検証実験を促進します。YPD培地を調製し、酵母を飽和状態まで一晩培養した後、プラスチック製キュベット内で細胞を水で10倍に希釈してください。次に、分光光度計でブランク測定を行い、オーバーナイト培養液の吸光度を測定します。滅菌蒸留水 20 milliliters を用いて、細胞濃度を 10 to the seventh cells per milliliter まで希釈します。その後、希釈した細胞を滅菌プラスチックシャーレに注ぎ、蓋を外した状態でプレートをUVクロスリンカーに入れます。次に、細胞溶液にUV照射を累積的に段階的に行い、各段階後に500 µLずつ分注して殺細胞曲線を作成し、スクリーニングに最適な生存率を決定します。滅菌水を用いて、細胞を1から10段階で段階希釈します。その後、各希釈液の細胞を最大速度で1分間遠心分離し、ペレット化します。上清を吸引し、酵母細胞の播種に適した滅菌水 100 µL で細胞を再懸濁します。次に、再懸濁した細胞の全量を YPD 固形培地を含むプレートに分注し、滅菌スプレッダーを用いて各プレート上に細胞を均一に分散させます。生存曲線をプロットし、テキストプロトコルに従ってスクリーニングに使用する UV 照射量を決定します。スクリーニング用に選択した用量のUV照射に酵母を曝露させた後、照射した細胞の全量をペレット化し、100 µLの滅菌水を用いてペレットを再懸濁します。3つのURA3欠損型ニュートン株を選抜するため、テキストプロトコルに従い、5-FOA含有最小培地に塗布します。5-FOAプレート上の単一コロニーの一部を滅菌した爪楊枝の先で回収し、それをYPD、5-FOA、およびウラシル欠損プレートに再度ストリークすることで、URA3欠損表現型を確認します。プレートをラップで包み、30 °Cで2〜4日間、倒立させて培養します。YPDおよび5-FOAプレートではコロニーが増殖し、ウラシル欠損プレートでは増殖しないことを確認して、oxytrophicの状態を検証します。照射後の酵母のURA-3欠損状態を確認した後、単一の変異コロニーを10 mLのYPDに接種し、30 °Cの恒温室で培養して、酢酸リチウム法による形質転換のためのオーバーナイト培養を行います。翌日、50 mLの新鮮で温めたYPDを用いて、オーバーナイト培養液をOD600が0.16から0.2になるまで希釈し、細胞密度が約1×10⁷ cells/mL（通常は約4時間後）に達するまで、200 RPMに設定したオービタルシェーカーで培養します。プロトコルに従って水および酢酸リチウムで細胞を洗浄した後、再懸濁した細胞50 µLをプラスミドおよびキャリアDNAを含む形質転換混合液に加えます。次に、PEG、TE、および酢酸リチウムを300 µL加え、ボルテックスで混合します。調製物を30 °Cで、オービタルシェーカーを用いて200 RPMで30分間インキュベートします。その後、テキストプロトコルに記載されている通りに形質転換を続行します。テキストプロトコルに従って酵母培養物を調製した後、血球計数計を用いて細胞濃度を測定し、10⁹ cells/mLに調整します。2500 ×gで3分間遠心分離し、細胞をペレット化します。次に、上清を捨て、適量の滅菌水を加えて穏やかにピペッティングし、細胞を再懸濁します。1 mLの滅菌シリンジに適したゲージの胃管針を取り付け、気泡が入らないように注意して酵母サンプルを充填します。対照群のマウスに投与するための滅菌水を別のシリンジに充填します。利き手ではない方の手で投与対象のマウスを拾い上げ、人差し指と親指で首周りの皮膚をしっかりと掴みます。小指の下に尾を固定します。マウスが頭を動かせないよう、しっかりと固定してください。次に、経口投与針を口蓋と喉の奥に沿わせ、中心からわずかに左側に寄せて、マウスの食道にゆっくりと挿入します。マウスが針の先端（バルブ部分）を飲み込むまで待ちます。抵抗を感じたり、マウスが喘いだりした場合は、ゆっくりと針を抜き、もう一度食道を探してください。マウスがゾンデ針の先端（バルブ部分）を飲み込んだら、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し、酵母をマウスの胃に直接投与します。ゾンデ針を胃と食道からゆっくりと抜き、マウスをケージに戻します。マウスの呼吸と動作が正常であることを確認し、経口投与が適切に行われたかを確認します。テキストのプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、腹部が完全に露出するように配置し、70% ethanolで腹部をスプレーします。ハサミを使用して、被毛と皮膚に横方向の切開を加えます。次に、手で切開口を広げて、腹腔器官を覆う薄い漿膜層である腹膜をさらに露出させます。腹膜を優しく持ち上げ、横方向に切開して腸管を露出させます。その後、鈍端鉗子を用いて、小腸を腸間膜動脈、脂肪、およびその他の組織から慎重に剥離します。マウス腹部左上方の胃から、大腸の起点にある大きな腸組織の嚢状構造である盲腸まで、小腸を露出させます。次に、小腸に沿って1〜2 mmのほぼ円形の不透明な組織のパッチを探し、パイエル板を単離します。その後、曲剪を用いて、周囲の組織が混入しないようマージンを残しながら、パイエル板のドーム部分を切り出します。摘出したパイエル板を完全IMDMに転送します。次に、パイエル板を懸濁させた溶液を40 µmのセルストレーナーに注ぎます。完全IMDMでパイエル板を洗浄した後、1 mLシリンジのプランジャーを用いて組織を穏やかに分散させ、細胞を50 mLチューブに回収します。ろ過した細胞を1800 RPMで7分間遠心分離してペレット化します。その後、テキストプロトコルに従って細胞を播種し、解析します。この図は、放射線照射したS Boulardii細胞の連続希釈後の播種結果を示しています。連続希釈を行うことで、各UV線量におけるCFの使用数を算出することが可能になります。これらの酵母プレートの画像から、変異コロニーがYPDおよび5-FOAプレートでは一貫して増殖し、ウラシル欠如プレートでは増殖しないことから、ウラシル欠如型オキシトロフィック表現型であることが示されます。このグラフは、リチウムアセテート法とエレクトロポレーション法の両方を用いた、野生型S. BoulardiiとS. Cerevisiaeの形質転換効率の比較を示しています。酢酸リチウム法による形質転換はS. cerevisiaeにおいて非常に効率的ですが、S. boulardiiにおいてはエレクトロポレーションを用いることで形質転換効率が大幅に向上します。これらの明視野および蛍光画像では、GFEをコードするURA3プラスミドで形質転換されたS. cerevisiaeが、異種タンパク質の機能的発現を示しています。この図では、動物解剖後のパイエル板から検出された生存可能なCF使用例を示しています。マウス1匹あたりに回収されるCFの典型的な収量は10未満です。これで、UV変異導入を用いてプロバイオティクス酵母のoxytrophic変異株を作製する方法について十分に理解できたはずです。また、これらの酵母が異種タンパク質を発現し、マウス小腸のパイエル板に付着する能力を試験する方法についても説明しました。これらの手順に従い、ELISAや蛍光顕微鏡法などの他の手法を用いて、発現させた異種タンパク質の適切な折りたたみ（フォールディング）および機能を評価することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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