リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

このイメージング法の全体的な目標は、in vivo で脊椎動物の細胞内小器官を研究することです。この方法は、ミトコンドリアのダイナミクスや生体内環境における中心体など、神経細胞生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、外科的処置を必要とせずに、実験全体を無傷の脊椎動物で実施できることです。

この手法は、生理学的条件下での細胞内ダイナミクスに関する洞察を提供するだけでなく、アルツハイマー病などの論文モデルの研究にも適用できます。マイクロインジェクションによって一過性発現胚を生成した後、またはテキストプロトコルに従って安定したトランスジェニック系統から胚を取得した後、1日目の終わりに、死んだ卵子または未受精卵をスクリーニングします。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、生存可能な胚を1x PTUを含むDanieauの溶液に移して色素形成を防ぎ、導入遺伝子発現のスクリーニングまで1x PTUを含むDanieauの溶液で胚を維持します。

イメージング実験の当日は、蛍光解剖顕微鏡を使用して、麻酔をかけた胚の導入遺伝子発現をスクリーニングします。次に、選択した胚を、1x PTUおよび1x トリカインを含むDanieauの緩衝液を含む別のシャーレに移します。胚に麻酔をかけたら、1x PTUと1x トリカインを含む低融点アガロースに数個を静かにピペットで入れ、アガロースが希釈されないようにできるだけ液体を移さないようにします。

少量のアガロースを含む胚をガラス底のペトリ皿に移します。次に、比較的高速に作業し、鉗子を使用して、画像化する構造に応じて胚を目的の向きに配置します。胚は、例えば、網膜またはRohon-Beardニューロンをイメージングするために、側面が平らになるように、適切に向きを合わせる必要があります。

正確な向きは、最高のイメージング品質を確保し、取得速度を最適化します。アガロースを少なくとも15分間固化させた後、1x PTUと1x トリカインを含むDanieauのバッファーを添加して胚を覆います。広視野顕微鏡検査を行うには、広視野顕微鏡のステージ上で、摂氏28.5度の加熱チャンバーにマウントされた魚の皿を平衡化し、関心のある領域を選択した後、顕微鏡ソフトウェアを開きます。

[Illumination] で [Configuration settings] をクリックし、対象の波長に適したフィルターセットを定義します。[カメラ設定]で、適切な画像を取得するために必要な露出時間を入力します。次に、40倍から100倍の倍率の範囲の長作動距離水浸漬コーン対物レンズを選択し、開口数が最も高く、色彩的に補正されています。

「ライブ」をクリックして、視野を選択します。R-Bニューロンの場合、細胞体または末梢アーバーで発せられる幹軸索でのミトコンドリア輸送を画像化します。次に、ImageJメニューで長方形の選択ボタンをクリックし、関心領域(ROI)を定義します。

そして、micromanagerウィンドウでROIをクリックします。イメージングのROIを選択したら、[Stop and Save]をクリックして、YFPチャネルのニューロンの形態を記録します。ミトコンドリア輸送を画像化するには、Multi-D Acquisitionをクリックします。

次に、Multi-dimensional Acquisitionというウィンドウで、タイムポイントの数とタイムポイント間の間隔を選択します。「Multi-dimensional Acquisition」ウィンドウで、「Channels」をクリックし、イメージングの波長と露光時間を追加および定義します。「画像を保存」をクリックすると、ディレクトリルートで概説されている特定のフォルダにファイルが自動的に保存されます。

次に、右上隅にある[取得]をクリックして、タイムラプスイメージングを開始します。共焦点顕微鏡法では、マウントされた胚を共焦点ステージ上の摂氏28.5度の加熱チャンバーに置いた後、顕微鏡ソフトウェアを開き、Trans LampまたはEpi Lampをクリックします。次に、顕微鏡の接眼レンズを介して、透過光または蛍光光をそれぞれ使用して、関心領域を特定します。

[Acquisition setting] ウィンドウで、イメージング用に選択した対物レンズが、使用可能な対物レンズのドロップダウンメニューに表示される対物レンズと一致することを確認します。次に、Image Acquisition Controlウィンドウで、色素リストボタンをクリックし、適切な蛍光色素を選択します。または、[Light Path and Dyes] ボタンをクリックして、パラメーターを手動で設定します。

[Acquisition Setting]ウィンドウで、スキャンした画像のズーム係数とサイズのアスペクト比を調整して、イメージングする構造を最適に解決するために必要なピクセルサイズを取得します。ピクセル サイズを対物レンズの理論分解能の約半分に設定し、ナイキストのサンプリング基準に従います。集録した画像のピクセルサイズを決定するには、Image Acquisition ControlウィンドウでIボタンをクリックします。

次に、スキャン速度を可能な限り速く設定します。次に、[Image Acquisition Control] ウィンドウで [Kalman line averaging] をクリックし、ノイズを減らすために係数を 2 または 3 に設定します。スペクトルが重なり合う蛍光色素のイメージングにシーケンシャルスキャンモードを選択するには、[Sequential and Line]をクリックします。

次に、関連するレーザーラインの出力を調整します。各チャンネルの検出器設定を調整しながら、選択した領域を連続的にスキャンするには、XYリピートまたはフォーカスx2またはフォーカスx4をクリックします。次に、各チャンネルのHV、ゲイン、オフセットを調整して、グレー値のダイナミックレンジが最も高い画像を取得します。

次に、ControlキーとHキーを押して、取得した画像をルックアップテーブルで視覚化し、青の彩度の低いピクセルと赤の彩度の高いピクセルを識別しますが、どちらも避ける必要があります。関連するレーザーラインの出力と検出器の設定を再評価します。画像化するボリュームの上限と下限を定義するには、[Acquisition Setting]で上限の[End Set]ボタンをクリックし、下限にフォーカスして[Start Set]を押します。

対物レンズのZ解像度を確認するには、Image Acquisition ControlでI記号をクリックします。次に、特定の対物レンズのZ解像度の半分のステップサイズを選択します。TimeScanサブウィンドウで、Zスタックを取得する頻度と画像を取得する回数を入力して、イメージングする細胞内構造のダイナミクスに適した時系列を設定します。

[Depth] ボタンと [Time] ボタンをクリックして、Z スタックと時系列が取得されることを確認します。最後に、XY Ztボタンをクリックして、タイムラプス画像の取得を開始します。画像取得後、ソフトウェアインターフェースで[Series Done]をクリックします。

また、画像をOIB形式で保存して、画像と関連するメタデータを記録します。この図は、広視野と共焦点顕微鏡を使用して、胚の表面に位置する細胞小器官とR-Bニューロンを示しています。ここでは、広視野顕微鏡でのタイムラプスイメージングを使用して、R-Bニューロンの末梢アーバー内の個々のミトコンドリウムの動きを追跡しました。

共焦点イメージングは大幅に遅く、特定の細胞内イベントのダイナミクスを過小評価する可能性があります。広視野顕微鏡で取得した網膜細胞の画像は、大量の組織からの蛍光シグナルが焦点面の細部を覆い隠すため、コントラストが悪くなります。ここでは、共焦点顕微鏡の光学セクショニング機能により、コントラストが著しく向上します。

挿入図は、細胞膜とミトコンドリアの標識とともに、内核層の領域の詳細を示しています。UAS-mito-CFPおよびUAS MAY-FPの注射によるモザイク発現は、感覚ニューロンの特異的なGau-4ドライバーによって駆動され、受精後2日および3日のこのR-B感覚ニューロンに見られるように、個々の細胞を数日にわたって追跡することを可能にします。ミトコンドリアに加えて、中心体などの他の細胞内小器官を蛍光標識することができます。

この例では、1つの連続したコンストラクト上の2つのUASカセットが、網膜細胞における中心体標的YFPおよび膜標的セルリアンの発現を促進しました。挿入図は、M期のセルを示しています。この手順全体は、交配、採卵、注射、そして受精後3〜4日で最終的にイメージングするまでに数日かかります。

顕微鏡での実際のイメージング実験は、数分から丸一日かかる場合があります。この手順に続いて、微小管やペルオキシソームなどの他のオルガネラを標識および画像化して、それらの生体内ダイナミクスを理解することができます。PTUは発がん性があり、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。