Name: リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング手法。遺伝子標識と共焦点顕微鏡を用いてミトコンドリアや中心体の動態を可視化し、神経細胞生物学や疾患モデル研究に応用する非侵襲的アプローチを解説する。

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P.E. は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 と Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS) の支援を受けています。G.P. は TUM-GS の支援を受けています。L.T. は EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013) の支援を受けています。D.P.のゼブラフィッシュに関する研究は、Sonderforschungsbereichの「Molecular Mechanisms of Neurodegeneration」(SFB 596)を通じてDFGの支援を受けました。Center for Integrated Protein Sciences(ミュンヘン)および欧州共同体の第7次フレームワークプログラム(FP7/2007-2013)の助成金契約第200611号(MEMOSAD)に基づく。彼は現在、ニューヨーク幹細胞財団-ドラッケンミラーフェローであり、ドイツ科学アカデミーレオポルディナからのフェローシップの支援を受けています。L.G.は、SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11を通じてDFGからの資金提供を受けています。
私たちは、魚の施設を維持してくださったKristina Wullimannさん、技術サポートをいただいたYvonne Hufnagelさん、原稿についてのコメントをいただいたThomas Misgeldさんに感謝しています。Centrin-YFPをクローンアウトしたM1 Medusaベクトル(pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP)を提供してくださったR.Köster氏(ブラウンシュヴァイク工科大学)と、CentrinFishを作成するためのレポーターコンストラクトを生成するために使用した14xUAS:MA-ceruleanカセットを提供してくれたS.C.鈴木氏とT.Yoshimatsu氏(ワシントン大学)に感謝します.さらに、Otx2:Gal4トランスジェニック系統についてS.C. Suzuki氏とT. Yoshimatsu氏(University of Washington)、Sensory:Gal4-VP16コンストラクトについてA. Sagasti氏(UCLA)、pCold Heart Tol2ベクターについてM. Nonet氏(ワシントン大学セントルイス校)に感謝します。Bettina Schmid氏、Alexander Hruscha氏、Christian Haass氏(ドイツ神経変性疾患センターミュンヘン - DZNE)に対し、MitoFishの開発に貢献していただいたことをご評価いたします。

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、蛍光タグミトコンドリア、中心体とゼブラフィッシュ胚のin vivoで特定の細胞型の細胞膜へのGal4-UAS発現系の汎用性を実証します。他の細胞小器官または細胞内構造を標識する多数の蛍光融合タンパク質は、公表された文献に見出すことができ、それぞれの実験室、商業的供給源または非商業的なプラスミド寄託（ 例えば、Addgene）から得ることができます。新しい蛍光融合タンパク質を設計するために、いくつかのパラメータは、FPを使用すると、目的のタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端にFPを融合させるかどうかを含めて、考慮される必要があります。蛍光融合タンパク質を生成についてより徹底した議論について、読者は、被験者49-51についての詳細な記事と呼ばれています。 私たちは、UAS-駆動導入遺伝子を用いた融合タンパク質の共発現を達成するための3つの戦略を強調表示します。複数、separat電子UASレポーター構築物は異なる既存のレポーターを組み合わせることを可能にするには、追加のクローニングを必要とせずに構築...

in vivoイメージングでは 、ほとんどの生理的な文脈における細胞の挙動の直接可視化を提供します。ゼブラフィッシュの胚の透明性、その迅速かつ外部の開発と蛍光標識を可能にする遺伝子ツールの豊富なアレイは、すべてのキーの発達のイベントのダイナミクスを解明するためにin vivoでの顕微鏡の利用拡大に貢献しています。ゼブラフィッシュにおける神経系の発達のイメージング研究では、例えば大幅に神経前駆細胞の挙動とそれに続く遊走、分化および回路の集積1-8を含むそれらの子孫の運命の我々の知識を拡大しています。 ステージは、現在、これらの細胞の挙動の基礎となる細胞内動態を調査するために設定されています。確かに、ゼブラフィッシュは、既にin vivoでの細胞生物学のためのツールとして利用されています。ミトコンドリア9-11を可視化できるようになりました2,8,12-14を中心体、ゴルジ15、微小管4およびアクチン細胞骨格16は、17エンドソームおよびin vivoでのゼブラフィッシュ胚における他の細胞内構造の中で、1,18頂端膜の構成成分の複雑な。これまでのところ、これらの細胞小器官の機能について知られていることの多くは、培養細胞中で彼らの行動を研究から来ています。 in vitro試験は、細胞生物学に多大な洞察が得られているが、培養中の細胞は、完全にin vivoでの状況の複雑さを表すものではありませんので、必ずしも生体内での細胞内小器官の機能とダイナミクスを反映するものではありません。ゼブラフィッシュの胚は、細胞内ダイナミクスを調べるためにインビボ代替中の生存を提供しています。 脊椎動物としては、ゼブラフィッシュは、哺乳動物種に見られるものと相同であり、多くの器官系（ 例えば、神経網膜）を有します。さらに、ゼブラフィッシュの胚はますます人間の病気19,20をモデル化するために使用されています</sアップ&gt;、中心体の機能（ 例えば、小頭21およびレーバー先天性黒内障22）とのミトコンドリア機能（ 例えば、パーキンソン病23は 、10,24およびバルト症候群25タウオパチー）に関連するものを含む。細胞および細胞下レベルでのin vivoイメージングこれらの例では、これらの病理学的状態の根底にある細胞生物学のより良い理解を可能にします。 ここに記載された方法の全体的な目標は、 インビボでの光学顕微鏡に用いゼブラフィッシュ胚における器官及び他の細胞内構造を調査するために総合的なガイドを提供することです。 in vivoでの細胞内構造を可視化し、追跡に関わる全体の作業の流れを説明する-遺伝的標識アプローチから、一時的に生成し発現させ、安定したトランスジェニック魚、そして最終的に広視野と共焦点顕微鏡を使用して画像化することに。これらのprocの各一方、eduresは、多数のゼブラフィッシュの研究室で使用されて、記載されているプロトコルは、最適化され、細胞内構造のダイナミクスを調査するための合理化されています。ここで説明する作業の2つの特定の側面は言及に値する：まず、遺伝的に複数の構成でのGal4-UAS発現系の使用は、特定の細胞型における細胞小器官にラベルを付けます。第二に、in vivoでの画像細胞内構造に広視野と共焦点顕微鏡の直接比較。 ゼブラフィッシュにおける遺伝的にラベル細胞小器官および他の細胞内構造への現在の戦略のいずれかにするプロモーター要素が直接融合タンパク質9,14,15。 インビトロ転写キャッピングされたRNAの結果での発現を駆動するキャップされたmRNA 1,4,8またはDNAに基づく構築物の使用しかし、組織特異的ではありません迅速かつ広範な表現、。キャップされたRNAは希釈または分解されるようにさらに、発現レベルは経時的に減少します。 RNAのこのように使用するベース開発の後の段階でオルガネラダイナミクスを調べるために構築する（通常は最大3日後に受精）制限されます。 これらの制限は、発現の空間的および時間的制御は、特定のプロモーターエレメントにより決定されるDNA構築物を使用することによって克服することができます。 DNAベースの構築物のGal4-UASシステムの文脈で使用される場合、導入遺伝子発現レベルに有意な改善が26,27を観察しています。レポーター遺伝子は、Gal4の結合性上流活性化配列（UAS）の下流にクローニングされている間、この二部式システムでは、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子GAL4の発現を駆動します。適切なGal4のドライバとUASレポーターを組み合わせることによって、発現が異なるプロモーターの後ろに特異的な発現パターンが所望されるたびに、レポーター遺伝子をクローニングする必要性を回避し、特定の細胞型に限定することができます。また、複数のUASレポーター遺伝子の発現をすることができ単一のGal4活性化因子によって駆動されます。 Gal4-UASシステムは、このように細胞内標識化のための汎用性と柔軟な遺伝的なアプローチを提供します。 広い視野と共焦点顕微鏡は、ほとんどの研究室の主力です。広視野システムは、典型的には、光源として、アークランプを使用して、光路の端部に配置されている敏感なカメラで放射された光を検出します。アウトオブフォーカスライトは、厚い試料での合焦情報を覆い隠すように、このイメージングモダリティは、典型的には、薄いサンプルに制限されています。共焦点顕微鏡は、彼らが焦点（ すなわち 、「光学切片」）28のうち、発信するものの上に焦点面からの発信信号を優先するように構築されているという点で、広視野システムとは異なります。光学セクショニングを達成するために、ピンホールは、点光源に共役な位置に排出経路に配置されます。レーザーが光源として使用され、信号は、光電子増倍管（PMT）で検出されます。具体的には、レーザービームは、試料によってポイントツーポイント及び各スポット（ピクセル）での蛍光発光は、PMTによって検出さにわたって通されます。 ここでは画像の両方顕微鏡モダリティの直接比較を提供するために、広視野および共焦点顕微鏡法の両方を使用してゼブラフィッシュ胚生体において全く同じ細胞内構造。このような比較を提供する基礎となる目的は、手元の特定の質問に最も適切な顕微鏡技術を選択するためのガイドラインを提供することです。 ここで説明する手法を用いて、我々は、ミトコンドリアと中心体ののGal4 UASベースの遺伝的標識化を実証します。これらの細胞小器官は、各撮像モダリティの適合性を実証するために広視野共焦点顕微鏡を用いて、神経系の異なる細胞型内および筋肉細胞内に結像されます。ここで説明する方法は、容易に生きたゼブラフィッシュ胚における他の細胞小器官および細胞内構造を調査するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>アガロース(2-ヒドロキシエチルアガロース)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>低ゲル化温度 Type VII</td></tr><tr><td>ブロックヒーター</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>サーモミキサー コンパクト</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 硝酸カルシウム水和物、99.996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>30x Danieauの</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td>を準備するには <td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>セラミックコーティング デュモン #5 鉗子</td><td>デュモン - ファインサイエンスツール</td><td>11252-50</td><td>#5 鉗子</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>培養皿ヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツコーポレーション</td><td>DH-35</td><td>加熱リング</td></tr><tr><td>エチル 3-アミノ安息香酸 メタン硫酸塩</td><td>PharmaQ</td><td>トリカイン PharmaQ-25g</td><td>トリカイン(麻酔薬)</td></tr><tr><td>蛍光解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底 培養皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>35 mm シャーレ、14 mm マイクロウェル、No. 0 カバーガラス</td></tr><tr><td>ガラス針</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社&nbsp;</td><td>TW100F-4</td>マイクロ<td>インジェクション用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375-250g30x</td><td>ダニオー</td></tr><tr><td>の高真空グリース</td>ダ<td>ウコーニング&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>二酸化ケイ素グリース</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>30x Danieau</td></tr><tr><td>の MgSO4.7H2O &nbsp;&nbsp;硫酸マグネシウム七水和物98 +%A.C.S試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>30x Danieauの</td></tr><tr><td>マイクロインジェクターを準備するには&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>PCS-Transposase</td> 転写</tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>30倍を準備するには ダニオー</td></tr><tr><td>のナノフォトメーター</td><td></td><td></td><td>DNA / RNA濃度を測定するには</td></tr><tr><td>ニードルプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td>フレーミング/ブラウン</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td>ウォーターディッピングコーン対物レンズ</td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素 グレード I、約 98%</td><td>シグマ</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (色素沈着防止)</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>プラスチック金型&nbsp;</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td>マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>プレキシガラスカバー-穴付き</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>プレキシガラスカバーの穴は、水浸コーンの直径よりも3mm大きくする必要があります 対物</td></tr>レンズ <tr><td>ティーストレーナー(プラスチック)</td><td></td><td></td><td>ゼブラフィッシュの卵を収集するには</td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>ワーナーインスツルメンツコーポレーション</td><td>TC-344B</td><td>デュアル自動温度コントローラー</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>3.5mLプラスチックトランスファーピペット</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>ウォーターディッピングコーン対物レンズ</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>オリンパスの</td><td></td><td>水浸コーン対物レンズ</td></tr><tr><td>広視野顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU(50倍ストック)</td><td></td><td></td><td>76 mg PTUを50 ml蒸留水に溶解 室温で激しく攪拌します&nbsp; -20 oC で 1 ml アリコート で保存 1x 作業溶液</td></tr><tr><td>Tricaine (20x Stock)</td><td></td><td></td> <td>200 mg Tricaine を 48 ml 蒸留水に溶解 2 ml 1M Tris base (pH9) 追加 pH 7&nbsp; -20 oC で 1 ml アリコート 1x 作業溶液で使用</td></tr><tr><td>ダニオー溶液 (30x ストック)</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&nbsp;NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;KCl&nbsp; 12 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;MgSO<サブ>4</サブ>.7H<サブ>2</サブ>O&nbsp; 18 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Ca(NO3)2 150 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;HEPESバッファー&nbsp; 蒸留水 1リットルまで&nbsp; 4 oC&nbsp; 0.3x の作業溶液で使用</td></tr></tbody></table>

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivoイメージングは、自然な文脈での細胞および細胞内構造の動的挙動への前例のないアクセスを提供します。哺乳類などの高等脊椎動物でこのようなイメージング実験を行うには、一般に、研究対象のシステムへの外科的アクセスが必要です。ゼブラフィッシュの胚および幼生の光学的アクセス性により、このような侵襲的な手順を回避し、無傷の生物でのイメージングが可能になります。実際、ゼブラフィッシュは、増殖から移動、分化まで、幅広い発生状況でin vivo顕微鏡を使用して動的な細胞挙動を視覚化するための確立されたモデルとなっています。より最近の進展は、ミトコンドリアの輸送や中心体のダイナミクスなどの細胞内イベントを研究するためにゼブラフィッシュの使用が増加していることです。これらの細胞内構造を蛍光タンパク質によって遺伝的に標識することが比較的容易であること、およびそれらを画像化するための光学顕微鏡技術の使用により、ゼブラフィッシュは細胞生物学のin vivoモデルに変貌しています。ここでは、オルガネラを蛍光標識する遺伝的構築物を生成する方法について説明し、ミトコンドリアとセントロソームを具体例として強調します。私たちは、二者構成のGal4-UASシステムを複数の構成で使用して、発現を特定の細胞タイプに制限し、一過性に発現する安定したトランスジェニックフィッシュを生成するためのプロトコルを提供します。最後に、細胞内ダイナミクスのイメージングに最も適した光学顕微鏡法を選択するためのガイドラインを提供します。

ここでは、広い視野と画像ミトコンドリアおよびゼブラフィッシュの胚を生きている中で中心体への共焦点顕微鏡の使用は、直接比較と対照的です。オルガネラダイナミクスが検討されるべき細胞の位置および特定の細胞内イベントの固有振動数に応じて、一般的に広視野または共焦点顕微鏡のいずれかがより良い選択です。我々は、胚の表面上に配置さRBニューロンに深く位置する網膜細胞内小器官を画像化しました。一緒に彼らの2次元形状を有するRBニューロンの表面的な場所は、それら広視野と共焦点顕微鏡（ 図 2）の両方で撮像されるための良い候補となります。共焦点顕微鏡を用いて取得した画像は、しかし、かなり遅く、特定の細胞内イベント（ミトコンドリアの例えば、運動、 図2C、Dのダイナミクスの過小評価につながることができます</stronグラム&gt;）。組織の大量の蛍光信号を焦点面に詳細を不明瞭として広視野顕微鏡によって取得された網膜細胞の画像が悪いコントラス...

>jove_content<細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin vivoでイメージングすることで、生理学的および疾患的条件におけるそれらの機能を明らかにすることができます。ここでは、2つの細胞小器官(中心体とミトコンドリア)を遺伝的にタグ付けし、広視野顕微鏡と共焦点顕微鏡を使用して、生きたゼブラフィッシュの胚におけるそれらのダイナミクスをイメージングする方法を紹介します。

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

このイメージング法の全体的な目的は、脊椎動物の生体内で細胞小器官を研究することです。この手法は、生体内環境におけるミトコンドリアや中心体のダイナミクスなど、神経細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、外科的な処置を必要とせず、完全な状態の脊椎動物を用いて実験のすべてを行うことができる点にあります。この手法は、生理的条件下での細胞内ダイナミクスへの洞察を与えるだけでなく、アルツハイマー病などの疾患モデルの研究にも適用可能です。テキストプロトコルに従って、マイクロインジェクションにより一過性発現胚を作製するか、あるいは安定形質転換系統から胚を得た後、1日目の終わりに、死卵または未受精卵をスクリーニングします。プラスチック製転送ピペットを用いて、生存している胚を色素形成を防ぐための1x PTUを含むDanieau溶液に移し、導入遺伝子の発現をスクリーニングするまで、1x PTUを含むDanieau溶液中で胚を維持します。イメージング実験の当日、蛍光解剖顕微鏡を用いて、麻酔した胚のトランスジェーン発現を確認し、スクリーニングを行います。次に、選別した胚を、1x PTUおよび1xトリカインを含むDanieau緩衝液を入れた別のペトリ皿に移します。胚の麻酔が完了したら、1x PTUおよび1xトリカインを含む低融点アガロースの中に、ピペットで数個の胚を静かに移します。この際、アガロースが希釈されないよう、液体の持ち込み量を最小限に抑えてください。少量のアガロースとともに胚をガラスボトムペトリ皿に移します。次に、比較的迅速に、イメージングする構造に応じてピンセットを用いて胚を目的の向きに配置します。例えば、網膜やRohon-Beardニューロンをイメージングする場合は、胚を側面に平らに置くなど、適切に方向付けする必要があります。正確に配置することで、最高のイメージング品質を確保し、取得速度を最適化できます。アガロースを少なくとも15分間凝固させた後、1x PTUおよび1x トリカインを含むDanieau緩衝液を加え、胚を覆います。ワイドフィールド顕微鏡観察を行うには、固定した魚を入れたディッシュを28.5 °Cの加熱チャンバー内で平衡化させた後、ワイドフィールド顕微鏡のステージに設置し、関心領域を選択して、顕微鏡ソフトウェアを開きます。「照明（Illumination）」で「設定（Configuration settings）」をクリックし、目的の波長に適したフィルターセットを定義します。「カメラ設定（Camera settings）」で、適切な画像を取得するために必要な露光時間を入力します。次に、40倍から100倍の倍率で、数値開口数（NA）が最も高く、色収差補正がなされた長作動距離の水浸コーン対物レンズを選択します。Liveをクリックして視野を選択します。R-Bニューロンの場合、細胞体から伸びる軸索幹または末梢樹状突起におけるミトコンドリア輸送を撮影します。次に、ImageJメニューで長方形選択ボタンをクリックし、関心領域（ROI）を指定します。次に、MicroManagerウィンドウのROIをクリックします。イメージング用のROIを選択した後、[Stop and Save]をクリックしてYFPチャンネルでの神経細胞形態を記録します。ミトコンドリア輸送のイメージングを行うには、[Multi-D Acquisition]をクリックしてください。次に、「Multi-dimensional Acquisition」ウィンドウで、タイムポイントの数とタイムポイント間の間隔を選択します。「Multi-dimensional Acquisition」ウィンドウで「Channels」をクリックし、イメージングに使用する波長と露光時間を追加して定義します。「Save images」をクリックすると、ディレクトリパスで指定された特定のフォルダにファイルが自動的に保存されます。次に、右上隅のAcquireをクリックしてタイムラプス撮像を開始します。共焦点顕微鏡の場合、共焦点ステージ上の28.5 °Cに設定された加熱チャンバーにマウントした胚を配置した後、顕微鏡ソフトウェアを開き、Trans LampまたはEpi Lampをクリックします。その後、顕微鏡の接眼レンズを通して、透過光または蛍光光のいずれかを用いて関心領域を特定します。Acquisition（取得）設定ウィンドウで、イメージング用に選択した対物レンズが、利用可能な対物レンズのドロップダウンメニューに表示されているものと一致していることを確認します。次に、Image Acquisition Control（画像取得コントロール）ウィンドウで、色素リストボタンをクリックし、適切な蛍光色素を選択します。または、Light Path and Dyes（光路および色素）ボタンをクリックして、パラメータを手動で設定します。「Acquisition Setting」ウィンドウで、スキャン画像のズーム倍率とサイズアスペクト比を調整し、イメージングする構造を最適に分解するために必要なピクセルサイズに設定します。ナイキストのサンプリング定理に従い、ピクセルサイズは対物レンズの理論分解能の約半分に設定してください。取得した画像のピクセルサイズを確認するには、「Image Acquisition Control」ウィンドウの I ボタンをクリックします。次に、スキャン速度を可能な限り最速に設定します。その後、「Image Acquisition Control」ウィンドウで「Kalman line averaging」をクリックし、ノイズを低減するために係数を2または3に設定します。スペクトルが重複する蛍光色素をイメージングするためのシーケンシャルスキャンモードを選択するには、「Sequential」および「Line」をクリックします。次に、該当するレーザーラインの出力電力を調整します。検出器の各チャンネルの設定を調整しながら、選択した領域を連続的にスキャンするには、XY RepeatまたはFocus x2、Focus x4をクリックしてください。その後、各チャンネルのHV、Gain、Offsetを調整し、グレー値のダイナミックレンジが最大となる画像を取得します。次に、Control + H キーを押し、ルックアップテーブルを用いて取得した画像を可視化します。これにより、避けるべき低飽和ピクセルが青色で、過飽和ピクセルが赤色で表示されます。該当するレーザーラインの出力および検出器の設定を再評価してください。撮像するボリュームの上限と下限を定義するには、「Acquisition Setting」で上限位置に移動して「End Set」ボタンをクリックし、次に下限位置にフォーカスを合わせて「Start Set」を押してください。対物レンズのZ分解能を確認するには、「Image Acquisition Control」にあるIシンボルをクリックします。次に、使用する対物レンズのZ分解能の半分にあたるステップサイズを選択します。「TimeScan」サブウィンドウで、Zスタックを取得する頻度と画像取得回数を入力し、イメージングする細胞内構造のダイナミクスに適したタイムシリーズを設定します。DepthボタンとTimeボタンをクリックし、Zスタックおよびタイムシリーズが取得されることを確認します。最後に、XY Ztボタンをクリックしてタイムラプス画像の取得を開始します。画像取得後、ソフトウェアインターフェース上のSeries Doneをクリックします。そして、画像と関連するメタデータを記録するために、画像をOIB形式で保存します。この図は、広視野顕微鏡および共焦点顕微鏡を用いて、胚の表面に位置するオルガネラとR-Bニューロンを示しています。ここでは、広視野顕微鏡によるタイムラプスイメージングを使用して、R-Bニューロンの末梢樹状突起における個々のミトコンドリアの移動を追跡しました。共焦点イメージングは著しく速度が遅く、特定の細胞内イベントのダイナミクスを過小評価することにつながる可能性があります。広視野顕微鏡で取得した網膜細胞の画像は、広範囲の組織からの蛍光信号が焦点面の詳細を遮るため、コントラストが低くなる傾向があります。ここでは、共焦点顕微鏡の光学切片作成能力によって、コントラストが顕著に向上します。挿入図は内核層の一部の詳細を示しており、細胞膜とミトコンドリアが標識されています。感覚ニューロン特異的なGau-4ドライバーにより、UAS-mito-CFPおよびUAS MAY-FPの注入によるモザイク発現が可能となり、受精後2日目および3日目のこのR-B感覚ニューロンに見られるように、個々の細胞を数日間にわたって追跡できます。ミトコンドリアに加えて、中心体などの他の細胞内オルガネラも蛍光標識することが可能です。この例では、単一の連続したコンストラクト上の2つのUASカセットにより、網膜細胞において中心体標的YFPおよび膜標的ceruleanの発現を誘導しました。挿入図はM期の細胞を示しています。この一連の手順は、交配、卵の採取、注入、そして最終的に受精後3〜4日目のイメージングまで、数日間を要します。顕微鏡を用いた実際のイメージング実験には、数分から丸一日かかる場合があります。本手順に従い、微小管やペルオキシソームなどの他のオルガネラを標識してイメージングすることで、それらのin-vivoでのダイナミクスを理解させることができます。PTUは発がん性があるため、本手順の実施中は常に手袋を着用するなどの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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