コンピュータ断層撮影法と頭蓋骨自家移植と同種移植片の統合を評価するために、骨形成、血管新生のカップリングの光イメージング

この手順の全体的な目標は、マルチモーダルイメージングアプローチを使用して、骨の再生と血管新生の観点から頭蓋骨移植片の統合を監視することです。この方法は、骨形成血管新生カップリングなど、再生医療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが血管の3つの高解像度3D決定を提供し、それは手順を示す完全な器官の研究を可能にすることです doron Vic、私の研究室の博士課程の学生 7〜8週齢のバブシーマウスを安楽死させた後。

テキストプロトコルに従って、バリカンを使用して、毛の成長方向に対して頭蓋骨領域を剃ります。死体に70%イソプロパノールを塗布し、頭を消毒します。次に、11番のメスを使って頭皮の皮膚を切り、デンタルドリルと内径4.5mmのタインで骨膜を切除します。

頭蓋骨の円形の断片を切り離します。滅菌生理食塩水が入った100ミリメートルのプラスチック皿に骨片を移します。この時点で、骨片に付着した血液と軟組織を湾曲したピンセットで観察します。

骨片を1つずつ持ち、先端が綿のアプリケーターを使用して完全に綿で拭きます。脳組織、軟部組織、血液を切除します。細いハサミを使って、グラフトに付着したままの骨片をやさしく切り取り、グラフトが完璧な丸みを帯びた形状になるようにします。

各グラフトを70%エタノールを含む15ミリリットルのチューブに1回、PBSを含む15ミリリットルのチューブに2回浸してエタノールを洗い流します。同種移植片をマイナス80°Cの冷凍庫で凍結後少なくとも1週間、クライオチューブで凍結します。オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するレシピエントトランスジェニックマウスを使用して、同種移植片が透明に見えることを確認します。

注射可能な麻酔薬を使用して7〜8週齢の雌マウスに麻酔をかけ、鎮静を確認した後。毛の成長方向に対してバリカンを使用して、頭蓋骨領域を剃ります。脱毛剤を塗って毛皮の残りを取り除き、乾いたガーゼを使用して2分以内に拭き取ります。

次に、生理食塩水に浸したガーゼを使用して、その領域を拭きます。5%クロルヘキシジンを皮下投与して頭皮を消毒します。.200マイクロリットルの生理食塩水で希釈したカルプロフェンのキログラムあたり5ミリグラムを注入します。

乾燥を防ぐために目の軟膏を塗り、動物を常にサーマルパッドの上に置いてください。次に、動物を操作用双眼鏡の下に置きます。次に、細いハサミとピンセットを使って、ピンセットで頭皮に長さ1センチの楕円形の切り込み

骨膜を保持し、細かいハサミを使用して歯科用ドリルで切り取り、外径5ミリメートルのtrリファインドリルでラムドイド縫合糸の2ミリメートル前方の頭蓋欠損をドリルして、硬膜の浸透を防ぎます。骨の4分の3をドリルで穴を開け、へらを使って骨片を切り離します。プロトコルの重要なステップの 1 つは、欠陥位置の終了です。

ラボ縫合糸の損傷は大量の出血につながります。したがって、下にあるデュロメーターと上矢状を乱さないように注意する必要があります。オートグラフトを移植する。

10ミリメートルのプラスチックプレートに10ミリリットルの滅菌生理食塩水を使用して、骨片を洗浄します。軟部組織を除去せずに血栓を除去し、事前に同種移植片の融解を移植し、サンプルを室温に正常化します。次に、湾曲したピンセットで骨片を洗います。

骨移植片を欠損部に配置して、欠損部の縁に触れないようにします。次に、フィブリンゲルを使用して、移植片を宿主の骨に接着します。4つのoh Vicryl縫合糸で皮膚を縫合し、外科的切り傷にポビドンヨードを塗布します。

マウスの耳に印を付け、1キログラムあたり0.25ミリグラムのアンチセダンを注入します。ミートの麻酔効果を逆転させるため。テキストプロトコルに従って術後ケアを実施します。

2000単位のヘパリンナトリウムを秤量し、50ミリリットルのチューブに移すことにより、ヘパリン化生理食塩水を調製します。20ミリリットルの滅菌生理食塩水をチューブに加え、振とうします。20ミリリットルのルアーロックシリンジに15ミリリットルの温めたヘパリン食塩水を十分に充填し、シリンジを23ゲージの頭皮静脈セットに接続します。

シリンジをシリンジポンプに取り付け、10ミリリットルのポンプを1分間に1ミリリットルに設定します。テキストプロトコルに従ってマウスに麻酔をかけた後、つま先をつまんで鎮静を確認し、マウスを固定します。吸収性の表面ライナーで包まれた固定ボードに戻ります。

次に、腹部から首にかけて皮膚をカットします。剣状突起まで腹壁を切断します。次に、胸郭をその側面に沿って切断し、心臓が完全に露出し、心臓と肺が損傷を受けていないことを確認します。

止血器を使用して胸骨を引っ込めます。蝶の針を左心室に3ミリメートル挿入します。次に、3秒の接着剤で、針を心臓と胸壁に接着します 蝶の針を左心室に挿入するのは繊細な手順です。

右心室への挿入や左心室への深すぎる挿入は、心臓後壁を貫通するため、避けてください。次に、すぐにポンプを作動させます。1分後、血管系を減圧するために下大静脈を解剖します。

液体がヘッドから離れるようにボードを傾けます。灌流が成功すると、肝臓と血管がきれいになります。今4%ホルムアルデヒドの10ミリリットルを灌流した。

気泡が血管系に浸透するのを防ぎます。尾の硬化によって示されるように灌流が完了したら、10ミリリットルのヘパリン化生理食塩水を使用してホルムアルデヒドを洗い流します。製造元の指示に従って、放射線不透過性造影剤を準備します。

プラスチックチューブ内で化合物希釈剤と硬化剤を混合することにより、造影剤を1分間に1ミリリットルの割合で動物に灌流します。灌流が完了すると、冠状動脈、腸動脈、肝動脈が黄色に変わります。チューブをバタフライニードルにカットし、枝肉を紙で包んで、溶液が頭蓋骨領域に漏れないようにします。

動物を摂氏4度に一晩置いて、翌日に重合させます。頭蓋領域を解剖するには、メスを使用して皮膚をできるだけ外側に切り、関心のある頭蓋領域を損傷しないようにします。骨移植片の位置を特定し、細いハサミを使用して、移植片から10ミリメートル離れた頭蓋骨を切断します。

マイクロCTスキャナーを使用する。視野を20.5ミリメートル、X線エネルギーを55KVP、強度を145マイクロアンペア、360度あたり1000回の投影、積分時間を200ミリ秒に設定します。分離された頭蓋骨サンプルをスキャンします。

マイクロCTソフトウェアによって生成された2D再構成スライスを観察します。関心のある領域を適切にスキャンしてから、頭蓋骨の欠陥を見つけてください。灌流した容器が容易に識別できる場合は、二重蒸留水で希釈した6%トリクロロ酢酸を使用してください。

サンプルを脱灰するには、先ほど説明したのと同じパラメータを使用してサンプルを再スキャンします。再構築された 2D スライスでラムドイド縫合糸を見つけます。対象とする円筒状のボリュームまたは VOI を、高さ 2 mm で、縫合糸に接する直径 8 mm で定義します。

これが欠陥の解剖学的部位です。次に、軟部組織から骨をセグメント化します。下限しきい値を 130 に設定し、制約付き 3D ガウス フィルターを適用して、ボリュームのノイズを部分的に抑制します。

3D 再構築を生成します。IPL ソフトウェアと DT オブジェクトを使用して、VOI が適切に配置されていることを確認します。Peram 関数は、厚さマップを生成します。

この機能は、各血管直径の血管容積を記述し、イメージングとマイクロコンピュータ断層撮影を行います。テキストプロトコルによれば、ここに示すように、手術の7日後、CTスキャンでは、サインを受けたマウスでは、血管が外部から貫通しているように見える同種移植片を受けたマウスとは対照的に、移植片領域全体に栄養を与える小径および中径の血管が有意に多いことが示されました。さらに、蛍光イメージングは、サイン処理動物において有意に高い血液灌流を示した。

14日目までに、同種移植片の維管束樹はすべての接ぎ木の近接性に達します。しかし、船舶の容積はAutographtグループに比べて大幅に減少しました。この差は、手術の28日後に見られるように直径0.08〜0.1ミリメートルの血管を比較すると最も顕著になり、手術の7日後に血管系の体積がベースラインに戻りました。

自家移植群は、ハイドロキシアパタイト指向プローブを用いた蛍光イメージングによって見られるように、有意に高い骨石灰化を示しました。このグループでは、移植片の近接性全体で形成された骨は、手術の56日後にリング形状でマークされるように、同種移植片グループの欠損縁でのみ形成されましたが、骨量は有意に高く、移植片の厚さは、自筆を受けた動物と同種移植片に対して有意に大きかった。この手順に続いて、破骨細胞の活動や免疫応答の関与などの追加の疑問に答えるために、他の問題を用いた蛍光イメージングを行うことができます。

このビデオを見た後、基礎となる血管新生における骨再生を画像化する方法についてよく理解しているはずです。