コンピュータ断層撮影法と頭蓋骨自家移植と同種移植片の統合を評価するために、骨形成、血管新生のカップリングの光イメージング

本手順の総合的な目的は、マルチモーダルイメージングアプローチを用いて、骨再生と新生血管形成の観点から頭蓋骨移植片の生着をモニタリングすることです。この手法は、骨形成と血管新生のカップリングなど、再生医療分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、血管系の高精細な3D決定が可能であること、および臓器全体を解析できることです。本手順は、7〜8週齢のBALB/cマウスを安楽死させた後、当研究室の博士課程学生であるdoron Vicにより実施されます。

テキストプロトコルに従い、バリカンを使用して頭蓋領域を毛の流れに逆らって剃毛します。死骸の頭部に70% isopropanolを塗布して消毒します。その後、11番メスで頭皮を切開し、歯科用ドリルと内径4.5 millimeterのバーを使用して骨膜を除去します。

頭蓋骨から円形の骨片を切り出します。この骨片を、滅菌生理食塩水が入った100 mmのプラスチックディッシュに移します。この時点で、カーブピンセットを用いて、骨片に付着している血液および軟組織を確認します。

骨片を1つずつ保持し、綿棒を使用して十分に拭き取ります。これにより、脳組織、軟部組織、および血液を除去します。細かいハサミを使用して、移植片に付着している骨片を慎重に切り取り、移植片が完全な円形になるように整えます。

各移植片を70%エタノールを含む15 milliliterチューブに1回浸し、続いてPBSを含む15 milliliterチューブに2回浸してエタノールを洗浄します。同種移植片をクライオチューブに入れ、minus 80 degrees Celsiusフリーザーで少なくとも1週間凍結保存します。オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するレシピエント用トランスジェニックマウスを用いる場合は、同種移植片が透明であることを確認してください。

投与用麻酔薬を用いて生後7〜8週の雌マウスを麻酔し、鎮静状態を確認します。バリカンを用い、毛の流れに逆らって頭蓋領域を剃毛します。除毛剤を塗布して残った被毛を除去し、2分以内に乾いたガーゼで拭き取ります。

次に、生理食塩水に浸したガーゼで患部を拭き取ります。5%クロルヘキシジンを皮下投与し、頭皮を消毒します。生理食塩水200 µLで希釈したカルプロフェンを5 mg/kg投与します。

乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布し、動物を常にサーマルパッドの上に置いておきます。次に、動物を手術用双眼鏡の下に配置します。続いて、細い鋏とピンセットを用い、ピンセットで頭皮に1 cmの楕円形の切開を加えます。

骨膜を保持し、精密鋏を用いてそれを取り除きます。歯科用ドリルおよび外径5 mmの精密切削ドリルを使用し、硬膜への穿通を避けるため、ラムダ縫合から前方2 mmの位置に頭蓋欠損部を作成します。骨の4分の3まで穿孔し、スパチュラを用いて骨片を取り出します。本プロトコルにおける重要なステップの一つは、欠損部位の決定です。

labo縫合を損傷すると大量出血につながります。したがって、下層の硬膜および上矢状静脈洞を損傷しないよう注意する必要があります。オートグラフトを移植します。

10 mmプラスチックプレートに10 mLの滅菌生理食塩水を入れ、骨片を洗浄します。あらかじめ解凍した同種移植片を植え込み、サンプルを室温に戻すため、軟組織を除去せずに血栓を除去します。その後、曲げピンセットで骨片を洗浄します。

骨移植材を、欠損部の縁に触れないように欠損部に配置します。次に、フィブリンゲルを用いて、移植材を宿主骨に接着させます。4-0 Vicryl縫合糸で皮膚を縫合し、手術切開部位にポビドンヨードを塗布します。

マウスの耳にマーキングを行い、メデトミジンの麻酔効果を解除するため、アンチセダンを0.25 mg/kg投与します。術後ケアは、規定のプロトコルに従って実施してください。

2000 unitのヘパリンナトリウムを計量し、50 mLチューブに移してヘパリン生理食塩水を調製します。チューブに20 mLの滅菌生理食塩水を加え、振盪します。加温したヘパリン生理食塩水15 mLを20 mLルアーロックシリンジに十分に充填し、シリンジを23ゲージの静脈留置針に接続します。

シリンジをシリンジポンプに取り付け、10 mLを1 mL/minの速度で注入するようにポンプを設定します。本文のプロトコルに従ってマウスを麻酔し、足先をつねって鎮静状態にあることを確認した後、吸収性ライナーで巻いた固定ボードの上にマウスを仰向けに固定します。

次に、腹部から頸部にかけて皮膚を切開します。腹壁を剣状突起まで切開してください。その後、心臓を完全に露出させ、かつ心臓と肺に損傷を与えないように注意しながら、肋骨を外側から切開します。

止血鉗子を使用して胸骨を牽引します。バタフライ針を左心室に3 mm挿入します。次に、3秒速乾接着剤を用いて、針を心臓と胸壁に固定します。左心室へのバタフライ針の挿入は非常に繊細な操作です。

右心室への挿入や、左心室への深すぎる挿入は、心臓後壁を貫通させる可能性があるため避けてください。次に、直ちにポンプを作動させます。1分後、血管系の圧力を下げるために下大静脈を解剖します。

液体が頭部から離れる方向に流れるよう、ボードを傾けます。灌流が成功すると、肝臓と血管が洗浄され、透明になります。次に、4% formaldehydeを10 milliliters灌流させました。

血管系への気泡の混入を防ぎます。尾が硬くなることで灌流の完了が示されたら、10 millilitersのヘパリン加生理食塩水を用いてホルムアルデヒドを洗い流してください。造影剤は製造元の指示に従って調製します。

プラスチックチューブ内で化合物希釈剤と硬化剤を混合し、造影剤を1 mL/minの速度で動物に灌流させます。灌流が完了すると、冠状腸動脈および肝動脈が黄色に変化します。バタフライ針のチューブを切断し、溶液が頭蓋領域に漏れるのを防ぐために、死体を紙で包みます。

翌日の重合処理に備え、動物を4 °Cで一晩保管します。頭蓋骨領域を解剖するために、関心のある頭蓋領域を損傷しないよう注意しながら、メスを用いて皮膚を可能な限り外側で切開します。骨移植部位を確認し、細い鋏を用いて移植部位から10 mm離れた位置で頭蓋骨を切断します。

マイクロCTスキャナーを使用します。視野（FOV）を20.5 mm、X線電圧を55 kVp、管電流を145 µA、360度あたり1,000投影、積算時間を200 msに設定します。単離した頭蓋骨サンプルをスキャンします。

マイクロCTソフトウェアによって生成された2D再構成スライスを観察します。関心領域が適切にスキャンされていることを確認し、頭蓋骨欠損部を特定します。灌流血管が容易に識別できる場合は、二回蒸留水で希釈した6%トリクロロ酢酸を使用してください。

試料を脱灰するために、先ほど説明したものと同じパラメータを用いて試料を再スキャンします。再構成された2Dスライス内でラムダ縫合を確認します。縫合線に接するように、高さ2 mm、直径8 mmの円筒形の関心領域（VOI）を設定します。

ここが欠損部位の解剖学的部位です。次に、骨を軟組織からセグメントします。下限しきい値を130に設定し、拘束付き3Dガウスフィルタを適用して、ボリューム内のノイズを部分的に抑制します。

3D再構成を行います。IPLソフトウェアとDTオブジェクトを使用して、VOIが適切に配置されていることを確認してください。Peram機能を用いて厚みマップを生成します。

この関数は、イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（micro CT）を実施した各血管径における血管容積を示しています。ここに示すテキストプロトコルに従い、手術から7日後にCTスキャンを行ったところ、同種移植（allograft）を受けたマウスでは血管が外部から浸潤しているように見えたのに対し、自家移植（autograft）を受けたマウスでは、移植領域全体を養う小・中径血管の容積が有意に高いことが示されました。さらに、蛍光イメージングにより、自家移植治療を施した動物において血流灌流が有意に高いことが確認されました。

14日目までに、同種移植片内の血管系は移植片の全域に到達しました。しかし、血管容積は自家移植群と比較して有意に低い値を示しました。この差は、直径0.08から0.1 millimeterの血管を比較した際に最も顕著に現れました。ここで示されているように、術後28日目には、血管容積は術後7日目のベースラインまで回復しました。

ヒドロキシアパタイト標的プローブを用いた蛍光イメージングにより、自家移植群では骨石灰化が有意に促進されていることが示されました。この群では移植片の周辺全体にわたって骨が形成されたのに対し、同種移植群では術後56日目にリング状の形成が認められたように、欠損部の縁のみで骨形成が起こりました。同種移植を受けた動物と比較して、自家移植を受けた動物では骨量および移植片の厚みが有意に増加していました。この手術手技を習得すれば、約25分で完了させることができます。本手順の後、他のプローブを用いた蛍光イメージングを行うことで、破骨細胞の活性や免疫応答の関与など、さらなる疑問を解明することが可能です。

このビデオを視聴することで、骨再生およびその基盤となる血管新生をイメージングする方法について十分に理解することができます。