Name: 外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ細胞外フラックス解析による解糖速度の正確な測定法。呼吸と解糖のプロトン産生速度を定量的に補正し、細胞代謝の曖昧性を解決します。標準酸注入とpH変化測定で緩衝能を評価し、正確なデータ解釈を実現します。

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プロジェクトの構想とプレゼンテーションに貢献してくださったDavid A. Ferrick氏とDavid G. Nicholls氏、ここに示されていないデータや有益な議論を提供してくださったRenata L.S. Goncalves氏とAkos A. Gerencser氏、XF24消耗品のBarbara Liepe氏、そして式の開発にご協力いただいたAndy Neilson氏に感謝します。(5)。

1.細胞外フラックス計測器でバッファリングパワー測定：2つのバリエーションを注：ここで説明した計算及び方法は、細胞外フラックスアナライザーを使用して開発されました。他の楽器のために、測定体積は適切にスケーリングされなければなりません。 <ol><li>製造者の指示に従って（材料および機器を参照）塩酸濃縮物を用いて水に0.1 M塩酸標準を準備します。 注：すべての4つの注入ポートにおいて使用するためのHClの注射を調製するための計算例を表1に示します。 </li></ol><img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> 細胞外フラックスアッセイに表1連続塩酸注射も。 <ol start="2"><li>培地中のHCl標準の希釈液は、カールされる技術的反復の数については、表1のようにアッセイする準備一方のプレートの中でIED、プラスワンは、ピペッティング誤差を許容するために、 例えば 、ポートの4技術的反復注射のために、（48.9μL×5）アッセイ培地（1.1μL×5）、0.1MのHClの株式を準備します。 </li><li> 50μLを測定プローブカートリッジの各ポートAに配布します。残りのポートA、B、C、およびDに、この手順を繰り返し</li><li> 4ポートの追加のそれぞれについて、[2分ミックス、1分待ち、5分の測定]の2つのサイクルが続く標準較正サイクルを有する細胞外フラックスアッセイ10を実行します（ 図2を参照）。 <ol><li>ソフトウェアの指示に従って機器のソフトウェアで上記実験をプログラム。マシンに準備されたカートリッジをロードして、ソフトウェアの指示に従ってキャリブレーションを行います。 </li><li>プログラムによってプロンプトが表示されたら、較正物質含有プレートを取り外し、よく機器に各アッセイ培地を含むプレートを挿入します。プログラムを続行します。 </li></ol></li><li> U<html>以前から定常状態で得られた8-10データポイント（通常は最後の8-10点）の平均値を歌い、各ポートを添加した後、標準的な酸の各注入によるpH値（ΔPH）中（累計）の差を計算します。 </li><li>測定プローブに捕捉された7μlのボリュームに含まれるナノモルの H +に対してプロットΔPH。線形勾配はMPH /ピコモルのの H +でバッファリングパワー（BP）です。 </li><li>あるいはステップ1.2〜1.3に、ポートA、B、及びCは、表2のようにポートD.中のHClの注入に続いて実験を行うために使用される4つの技術的反復であるれるアッセイ以下ΔPHの測定を行います細胞外フラックスアッセイプレート（4背景温度補正ウェルを除く）20実験ウェル中の5点標準曲線の各点を生成するために使用されます。 </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; よく細胞外フラックスアッセイに表2.シングル塩酸注入。 2.外部のpHメーターを使用してバッファリングパワーを測定注：外部pHプローブを用いて、培地の緩衝能​​力を測定する、37℃でプローブを校正し、実験の間、すべての試薬について、この温度を維持します。 <ol><li>製造者の指示に従って、塩酸濃縮物を用いて水に0.1 M塩酸標準を準備します。 </li><li>暖かいpHプローブ、pHが基準、そのバッファリング電力測定するアッセイ培地、及び水浴中で37℃に0.1 MのHCl。 </li><li>製造者の指示に従って、37℃でのpHプローブを校正。熱板や水浴を使用してアッセイを通して37℃ですべての試薬を維持します。 </li><li>小さなビーカー又は円錐チューブに小分けし、アッセイ培地10mlを。連続浸漬pHプローブを用いてpHを監視します。 </li><li> 0.1 M HClをように追加10〜20μlのアリコート中の培地を言います。 <ol><li>攪拌棒を使って、または手動で各酸を添加した後、容器を旋回による混合を確認してください。 </li><li> pH測定のための数秒間は、各添加後のpHを記録した後、安定化させます。 </li><li> 表3に示されているように、正確な傾きの計算を確実にするために、実験中に予想されるpH範囲をカバーするのに十分な数の加算を行います。 </li></ol></li></ol><img alt="表3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> 表3. pHメーターを使用して、緩衝力を測定した。データを、0.1 M HClを620μlの添加との典型的な実験を表します。 <ol start="6"><li>ナノモルH +に対してプロットΔPHは、緩衝力（ 図1）を表し 、線形勾配を与え、7μlのあたりに追加されました。 </li></ol> 図1.バッファリングパワーを決定します 。 HClの標準曲線は 、表3のように、表1、表2または（ここでは）のように測定した。線形曲線適合の傾斜は、緩衝力液（pH /ナノモルのH + 7μlの）を与えます。各点は、n = 9の技術的反復の平均±SEMを表します。 <ol start="7"><li>緩衝力は、上記の方法1または2を介して知られると、電源（BP）（MPH /ピコモルのH +）をバッファリングすることによってECARを割ることによってPPR（ピコモルのH + /分/μgタンパク質）にECAR信号（MPH /分）に変換各ウェルのタンパク質含量にスケーリング。 PPRのTOT（ピコモルのH + /分/μgタンパク質）= ECAR（MPH /分）/ BP（MPH /ピコモルのH + 7μLで）ウェル（μgの）あたり/タンパク質式6 </li><li>あるいは、この方法で同じ実験を使用自動データ収集中にPPRを計算するために機器のソフトウェアによって使用される緩衝能力（BC）の値を計算するための1又は2。 注：機器のユーザーマニュアル12（107ページ）BCは次のように記述されている緩衝能力を計算し、使用方法についての詳細な情報を提供 BC（モル/ L）=モルのH + /（ΔPHXバッファ容量（L）） 式7 注：式7で定義された緩衝能力は、機器又は上記の外部pHプローブアッセイで算出することができます。バッファリングパワーと緩衝能の間の変換を簡単に（添付のスプレッドシートを参照してください）​​行われます。 BC = 1×10 -9 / BP（（MPH /ピコモルのH + 7μLで）/ 7μl）を式（8） 注：アッセイを行う前に知られている場合は、緩衝能力が実験中の機器のソフトウェアに直接入力することができます。 </li><li>以前の刊行物6に記載のように 、この手順とほとんどの従来の緩衝系を使用する上記の計算を適用します。 注： 表4の緩衝力といくつかの従来の媒体の緩衝能力。 </li></ol><img alt="表4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> 表4.バッファリングパワーと選択したメディアの緩衝能力。 3. C2C12筋芽細胞を用いた細胞外フラックスアッセイを行います注： - + Hステップ3.4.3において、CO 2には観察された差はなかったその存在がHCO 3にCO 2の完全な変換に必要とされないことを示唆し、C2C12培養での炭酸脱水酵素の存在に依存酸生産を由来+。しかし、経験的に異なる実験系でこれをテストする前にOMをお勧めしますitting炭酸脱水酵素。 <ol><li>培養マウスC2C12 11.1 mMグルコース、2mMのグルタミン、10％v / vのウシ胎児血清（FBS）、100 Uを有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、95％空気/ 5％CO 2下、37℃で13筋芽細胞/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン。 </li><li> 24時間アッセイの前に、20,000細胞で同じ培養培地100μlでプレート/シード細胞/ウェルでなし追加のコーティングを含む24ウェルポリスチレン細胞外フラックスアッセイプレート（材料及び方法を参照）。 </li><li>クレブスリンガーリン酸、HEPES（KRPH）アッセイ培地（2 mMのHEPES、136mMの塩化ナトリウム、2mMののNaH 2 PO 4、3.7 mMのKClを、1で10倍の最終濃度になるように、FCCPをオリゴ希釈し、ロテノンプラスmyxothiazol、およびHCl（オプション） mMのMgCl 2を、37℃で1.5ミリモルのCaCl 2、0.1％w / vの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、pH7.4中）。 </li><li>細胞調製<ol><li>アッセイの前に30分、GEに吸引することにより、接着細胞を3回洗浄ntlyウェルから培地を除去した後、ゆっくりと500μlのKRPHを追加。 </li><li> （この重炭酸塩を含まない培地のpHを変えるわけではない、5％CO 2下で、）、37℃空気中での3回目の洗浄工程の後、細胞をインキュベートします。 </li><li>アッセイ開始時には、追加の基板を、500 U / mlの炭酸脱水酵素とグルコース（10 mM）のまたは中のいずれかのみを含む500μlの新鮮なKRPHでウェルにKRPHを交換してください。 </li></ol></li><li>センサカートリッジのロード<ol><li>ポートA：2 / mlのオリゴマイシン、ポートB：0.5μMFCCP、ポートC（アッセイにおける最終濃度が十分に与えられた）、次のように細胞外フラックスセンサカートリッジのカートリッジポートにステップ3.3で調製した各10倍化合物のピペットで50μlのアリコート：1μMロテノン、1μMのmyxothiazol、ポートD：塩酸（上記および表2に記載されているようでアッセイ酸キャリブレーションを行う場合）。 注：ここで説明する完全な呼吸鎖阻害の目的のために、1μMの私xothiazol 1μMのアンチマイシンAと交換可能に使用することができます</li></ol></li><li>細胞外フラックスアッセイ： <ol><li> 10に記載の呼吸制御を決定するための標準的な細胞外フラックスアッセイを行います。 </li></ol></li></ol>注：実験の各セグメントについては、ミックスを決定し、待って、測定時間が必要なだけでなく、セグメント当たりのサイクル数。 注： 表5のデータは、3アッセイサイクルはバッファリングのキャリブレーションのためのHCl（量の異なるポートDを添加した後に発生すると、2分ミックス、1分待ち、および各セグメントの5分の2つの測定アッセイサイクルにわたって収集しました表2のようにパワー）。 <img alt="表5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> 表5.細胞外フラックスアッセイ構成。 4. MeasuriNGエンドポイント乳酸濃度注：の減少（2分かけて）初期速度を測定することにより、従来の96ウェルプレート中で直接決定することができる細胞外フラックス実験の終わりにいくつかの異なるシステム、エンドポイントの乳酸濃度でここに記載の間接アッセイを検証しますNAD +→NADHは、事前の出版物6に詳細に記載さ乳酸脱水素酵素によって触媒。代表的な結果に示されたデータは、グルコース含有アッセイウェル内のエンドポイントの乳酸濃度は〜40μmでした。 <ol><li> 2倍ヒドラジン媒体を準備し、1Mのトリス、20mMのEDTA、400mMのヒドラジン、22℃でのpHは9.8）。すぐにアッセイ開始前に、40 U / mlに4ミリ、乳酸脱水素酵素（LDH）にNAD + を追加します 。最終的なアッセイ培地組成物（1×）：500 mMトリス、10mMのEDTA、200mMのヒドラジン、2 mMのNAD +、20 U / mLのLDH。 </li><li>すぐに細胞外フラックスアッセイ以下、100を削除します細胞外フラックスアッセイプレートの各ウェルからアッセイ培地μlの不透明（黒色）を、96ウェルプレートのウェルに移します。 </li><li>各サンプルウェルに、100μlの2倍ヒドラジン媒体を追加します。 </li><li>直ちにマイクロプレートリーダーにプレートをロードし、340 nm励起/ 460 nm発光でNADH蛍光の監視を開始。 </li><li>約2分間の初期速度を記録します。 </li><li> 0〜50μMの追加乳酸濃度についての乳酸濃度に対する初期速度をプロットすることにより標準曲線を構築するために同様の実験を実行します。 </li><li>標準曲線を用いて、各ウェルの実験中の乳酸濃度を計算します。 </li></ol> 5.タンパク質含有量を測定します<ol><li>アッセイプレートの各ウェルから残りのアッセイ培地を除去します。 </li><li>底のウェル表面から細胞の脱落を最小限に抑えるように注意しながら、BSAフリーKRPHμlの250でウェルを3回洗浄します。 </li><li> 25μlのRIPA溶解を追加培地（150mMのNaCl、50mMのトリス、1mMのEGTA、1mMのEDTA、1％v / vのトリトンX-100、0.5％w / vのデオキシコール酸ナトリウム、0.1％v / vのSDS、22℃でpH7.4）中アッセイプレートの各ウェルに。 </li><li>氷上で30分間、プレートをインキュベートします。 </li><li> 5分間1200 rpmでプレートシェーカー上でプレートを撹拌します。 </li><li>溶解緩衝液組成物は、測定方法に対応していることを確認して、BCAアッセイにより、例えば 、標準的な方法によりタンパク質濃度を測定します。 図2の実験中のタンパク質含量/ウェル〜4μgのでした。 </li></ol>

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</ol>

博士ショナムケルジーは、彼女は何の競合する金融利害関係がないことを宣言します。ドクターマーチンブランドは、この記事で使用される機器および試薬を生成シーホース・バイオサイエンスのためのコンサルティングを行ってきました。この記事のオープンアクセス料はタツノオトシゴバイオサイエンス社のために支払われました。

細胞外酸性化は、細胞の代謝速度の容易に測定指標です。適切セルラ解糖の速度を決定するために、（乳酸産生によって定義される）には、アッセイ培地の緩衝能​​力を知ることが、生産速度をプロトン酸素消費および酸性の細胞外フラックス測定値を変換することが重要です。この計算を行うことにより、クエン酸サイクル中に放出されたCO 2から生じた酸性化は乳酸産生に起因する酸性化を残して、減算することができます。 この補正のための緩衝力を測定するためにここに与えられた複数の異なる方法は、異なる長所と短所を有します。 pHプローブを使用して、外部の測定は非常に正確で再現性があるが、小さなアッセイプレート内に含まれる蛍光団によって導入されたpH検出の違いは、アッセイ中の化合物の添加、またはTの存在を反映していない可能性が彼は細胞自体を。中板pH測定は、これらの問題に対処するだけでなく、実験的なノイズの様々な程度をご紹介します。 ECARへのCO 2の補正は初めて解糖率の明確なおよび定量的計算を可能にし、実験の過程で総ECARの呼吸器および解糖系の寄与の変化を明らかにする。式5及びOCR、ECAR、及び緩衝力の測定値を用いて、解糖速度は、簡単なスプレッドシートに設けられた （表6）を用いて算出することができます。 6必要に応じて、この速度は、事後乳酸測定により確認することができます。ペントースリン酸経路は非常に活性である細胞では、例えば、6-アミノニコチンアミドのような経路阻害剤の使用は、解糖速度を単離するために有用であり得ます。細胞外酸性化速度と酸素Consumptを測定し、総からと乳酸由来の H + - CO 2の両方の寄与の計算イオンレートは、代謝活性についての強力かつ定量的な文を作るために、細胞外フラックスデータを使用のための貴重なツールです。 緩衝力を測定し、調査し、所望のデータを下の細胞のための細胞外フラックス実験を最適化するための様々な変形例を含むここに記載した手順を使用して、無傷の細胞における解糖の速度は、実験条件の広い範囲の下で定量化することができます。この方法は、ポリスチレン表面（に付着され得るか、または細胞または細胞小器官）で接着培養で増殖することができる細胞に限定されています。これは、有用なデータが依然としてこれらの条件の範囲に亘って得ることができるものの、培養細胞は、均質でコンフルエントにあるときに、最も信頼性が高くなります。計算はK細胞である場合は、異なる基板と部分酸化6のためのより多くの完全な酸化のための0.65から1.0への最大のH + / Oなどの2レンジ 、細胞の代謝のいくつかの知識を必要としますノウングルコースを酸化するために、1.0の値を想定することができます。 すべての代謝的特徴付けに関連しているがシステムで使用される場合、この方法は、細胞のATPの供給を維持するために呼吸及び解糖代謝の間にずれが幹細胞および腫瘍由来の癌細胞の特徴付けを含む、重要な表現型である、特に有用であり得ます。これらおよび他の文脈での代謝制御の変化を理解することは、これらの細胞型の実験計画と解析で洗練された精度の高い程度をできるようになります。

この方法の全体的な目的は、正確に、細胞外フラックス分析を用いた細胞の解糖速度を測定することです。細胞外酸性化を使用して解糖速度の定量的測定は、多くの実験の所望の終点です。形で、解糖酸性化- （+ H + HCO 3に解離後、H 2 CO 3に水和物）、CO 2の形で呼吸酸性化、：しかし、細胞外酸性化の合計割合は、2つのコンポーネントの合計であります+ の H + -乳酸。 総細胞外酸性化へのCO 2の寄与は最近まで、ここで使用する測定プラットフォーム、XF24アナライザ7で無視できると考えられてきました。しかし、CO 2が外酸性化4-5に大きく貢献することができ、複数の他のシステムでは明らかです。複数の論文は、この詐欺を認めますtributionは、しかし酸3,8,9を由来のCO 2の直接定量を行わないでください。我々は最近、CO 2産生がこのシステム6における細胞外酸性化の大きな原因であることを定量的に明らかにしました。グルコース異化からのCO 2生成複数の代謝経路がありますがまた、クエン酸サイクルで行列デヒドロゲナーゼによって行わものが圧倒的な貢献者であり、すべての他の情報源は、実験誤差6の範囲内であるCO 2の量を生成します。 CO 2産生のために修正することなく、細胞外酸性化は、したがって、解糖速度の曖昧な指標であり、定量的に使用することはできません。私たちの以前の出版物は、呼吸CO 2があっても、一般的に、主に解糖系6を使用すると考えられる細胞では、総酸性化信号の大部分を含み、複数のインスタンスを強調表示します。さらに、総酸性化に呼 ​​吸CO 2の寄与は、実験の異なる部分の間に解糖率の正確な比較は、CO 2の補正が必要であることを実証し、一般的な代謝プロファイリング実験の過程で大きく異なります。 細胞外酸性化の速度を使用して、細胞の解糖速度を測定するためには、生成された合計のH +の変化に対するpHの変化に変換すること、およびクエン酸回路の動作中に放出されたCO 2により引き起こされる細胞外酸性化を減算する必要があります。ここでは、（O 2濃度の細胞外変化から）とCO 2生産（pHの外の変更やキャリブレーションアッセイ培地のバッファリングパワーから）細胞外のプロトン生成速度を測定するための簡単な方法を説明し、解糖速度を計算する方法を示しこれらの測定値を使用して。 この方法の強さ<html>乳酸産生によって定義されるように適切に解糖速度を計算するためにそれを使用することにより、細胞外酸性化の測定の有用性をens内。呼吸CO 2（または乳酸の直接測定）の補正がなければ、それはどうかを判断することは不可能であり、どの程度の総酸性化速度は、乳酸産生の直接測定された全細胞外酸性化を使用した実験の解釈を混乱させる、解糖率を反映します。 計算 CO 2および乳酸は、実験誤差の範囲内で、筋芽細胞6を用いた実験に基づいて、細胞外の酸産生に2つだけの貢献者です。したがって、総細胞外酸性化（PPR、プロトン生産率）の割合は、以下のように定義することができます。 PPRのTOT = PPR RESP + PPR glyc 式（1） _content &quot;&gt; TOT =合計; RESP =呼吸;解糖= glyc解糖PPRは、このようになります。： PPR glyc = PPR TOT - PPR RESP 式2 ここに、 PPR TOT = ECARのTOT / BP 式3 ここECAR =細胞外酸性化速度（MPH /分）、およびBP =バッファリングパワー（MPH /ピコモルのH + 7μLで）、一方、 PPR RESP =（10 のpHのpK a 1 /（1 + 10 のpHのpK a 1））（最大H + / O 2）（OCR TOT - OCR 腐敗/ MYX） 式4 ここで、K 1 = CO 2水和およびHCO 3への解離を組み合わせた平衡定数- + H +;最大H + / O 2 =番目例えば、グルコース6の完全な酸化のような特定の代謝変換の電子のCO 2由来の酸性化。 OCR =酸素消費速度（ピコモルO 2 /分）、及びOCRの腐敗/ MYX =非ミトコンドリアOCR。 式4は、任意の非ミトコンドリアOCRを減算することによりミトコンドリアのOCRを分離する（ミトコンドリア呼吸毒のロテノン及びmyxothiazolに耐性であるOCRのように定義される）と、各基板（最大H + / O 2に消費O 2当たり発生する最大のH +を占め）、（6）、ならびにCO 2の割合は、実験温度およびpH（10 のpHのpK a 1 /（1 + 10 のpHのpK 1でのH +を生じる参照）。グルコースの完全な酸化は、ミトコンドリアの酸素消費率（OCR）は、CO 2生成の速度と正確に同じである。細胞外フラックス測定の閉じ込められたアッセイ容量において、CO 2の農産物呼吸によってdは、アッセイ培地中に閉じ込められたままです。 + H + -閉じ込められたCO 2の大部分は、次いでHCO 3を解離H 2 CO 3に水和されます。ごく一部は溶解のままであるが、水和されておらず、HCO 3にCO 2水和および解離の組み合わせ平衡定数によって熱力学的に決定されるように別の小さな画分は、水和したが解離していない- + H +実験温度（37℃）およびpHで（〜7.4）。 このように、PPRのTOTからPPRのRESPを差し引くことにより、PPR gを計算するための完全な式は次のとおりです。 PPR glyc = ECARのTOT / BP - （10 のpH-PK 1 /（1 + 10 のpH-PK 1））（最大H + / O 2）（OCR TOT - OCR 腐敗/ MYX） 式5 私nは、この方法は、呼吸及び解糖、ならびにそれらに関連するATPの生産速度の速度は、定量的に直接的な測定値（酸素消費、細胞外の酸性化、緩衝能）、およびその他の必要な値をインポートまたは計算（H + / O 2から決定することができます、P / O、及び平衡定数K 1）6。ここに記載した実験は、タツノオトシゴXF24 10,11のような細胞外フラックスアナライザーを使用するための標準的な技術を拡張しました。他の細胞外フラックス測定フォーマット （例えば、XF 電子 96、またはXFP）のために、以下のすべてのボリュームが適切にスケーリングする必要があります。 アッセイ培地の緩衝能​​力を較正pHプローブを用いて直接的に外フラックスプラットフォームにまたは別々に、標準曲線を構築することによって測定することができます。ここでは、細胞外フラックスアッセイ培地によりバッファリングを測定するための3つのオプションは、すべてのinjectiの使用を含む、与えられています無細胞サンプルウェルを有する細胞外フラックスアナライザーのポート上で、または細胞含有ウェル（セクション1）または外付けのpH測定（セクション2）を使用して、最後の注入口を使用して。例データの完全な計算のために添付のスプレッドシートを参照してください。 細胞外フラックス機器のpH検出機能を用いて、緩衝力を測定するために、信号の変化を最小限に抑えるために、無細胞ウェルを使用するのが最も安全です。しかし、誤差の範囲内で、統計的な差は、無細胞および細胞含有この測定を行う際にウェル（データは示していない）との間に存在しません。注：ステップ1.7で説明した変化は、ノイズの多い信号の欠点で、添加した化合物によって、あるいは細胞の存在によって付与されるバッファへの電位変化を占めるの利点を運びます。しかし、上述のように、有意な差は、表1に示した無細胞設計の間の計算された緩衝能力に見出されなかったとここで説明した実験条件下で、表2のポスト実験デザイン。 さらに、小さなΔPH範囲（&lt;0.4単位、実験的に最高の0.2単位に制限）の上に、ΔのMPH / pmolのH + をプロットした直線状の傾斜が十分にΔPHと、[H +]との間に対数関係を近似します。この標準曲線の傾きは、したがって、7μlの中のpH /ナノモルの H +、または7μlのMPH /ピコモルのの H +でテスト中のアッセイ培地の緩衝力を表しています。我々は、培地の緩衝能​​力を増大させるか、測定時間の間に0.2 pH単位の変化を超えたサンプルについての細胞密度を低下させるお勧めします。測定時間も減少させることができるが、これは、定常状態の酸性化速度を短縮し、速度計算に誤差を導入し得ます。

<table><tbody><tr><td>Pherastar FS</td><td>BMG</td><td>n/a</td><td>マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF-24</td><td>タツノオトシゴ バイオサイエンス</td><td>n/a</td><td>細胞外フラックス装置</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF アッセイプレート</td><td>タツノオトシゴ バイオサイエンス</td><td>V7-PS</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>XF キャリブラント</td><td>タツノオトシゴバイオサイエンス</td><td>100840-000</td><td>溶液</td></tr><tr><td>HCl 標準</td><td>シグマ</td><td>38280</td><td>化学</td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>化学</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>化学</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Σ</td><td>R8875</td><td>化学</td></tr><tr><td>ミキソチアゾール</td><td>Σ</td><td>T5580</td><td>化学</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング</td><td>10-013-CV</td><td>中型 部品</td></tr><tr><td>FBS</td><td>コーニング</td><td>35-010-CV</td><td>中成分</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td>中成分</td></tr><tr><td>炭酸脱水酵素</td><td>シグマ</td><td>C2624</td><td>化学</td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3991</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Sigma</td><td>N7004</td><td>化学</td></tr><tr><td>LDH</td><td></td><td>ΣL1254</td><td>化学</td></tr></tbody></table>

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

酸素消費量と酸生成の細胞外測定は、呼吸と解糖1の速度を監視するためのシンプルで強力な方法です。ミトコンドリア反応(呼吸)と非ミトコンドリア反応(他の酸化還元反応)はどちらも酸素を消費しますが、これらの反応はミトコンドリア呼吸の化学的阻害によって容易に区別できます。しかし、ミトコンドリアの酸素消費量は、呼吸数2の明確かつ直接的な測定である一方で、細胞外酸の生成や解糖速度3-6との関係については、同じことが当てはまりません。細胞によって産生される細胞外酸は、嫌気性解糖によって産生される乳酸と、呼吸中のクエン酸サイクルで産生されるCO2の両方に由来します。解糖では、グルコースの乳酸への変換-+ H +およびアッセイ媒体への製品の輸出が解糖酸性化の原因です。呼吸については、CO2の輸出、H2CO3への水分補給、およびHCO3- + H +への解離が呼吸器酸性化の原因です。解糖系および呼吸器系の酸性化の割合は、提供される細胞の種類や基質などの実験条件によって異なり、ほぼ100%の解糖系の酸性化からほぼ100%の呼吸器系の酸性化までさまざまです6。ここでは、C2C12筋芽細胞をモデルとして、培養中の全細胞による全細胞外酸性化に対する呼吸器および解糖の寄与を決定するために必要なデータ収集および計算方法を示します。

<html> 図2は典型的な実験の生データを示しています。 OCRおよびpH（縦棒を影付き）の両方のポイント・ツー・ポイントの記録からの最後の10の測定点は、計算に使用しました。最初の懸念は、各アッセイサイクルの平均値（中間点測定）が、裏づけされていないポートの追加と定常状態の酸性化速度の間のわずかなずれがあるように見えた特にとして、正確な計算のための率の十分な解像度を提供しないことこのよう計算誤差（図示せず）に大きく寄与して表示されません。適切な緩衝能力を実験中に入力された場合あるいは、PPRは、機器のソフトウェア又はデータの出力設定の一つとして利用可能なPC互換形式でPPR出力を表示することにより機器のデータ収集読み出しから直接読み取ることができます。 ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; O 2とH + 1の図2.代表的細胞外フラックストレース 。 OCRおよびpHは、アッセイ開始時に10 mMグルコースを含む、 表5の実験例のトレース。ポートDは、（これらの平均のトレースに示されていない）バッファリング電力の較正のための種々のHClの濃度を有していました。以前の出版物6からのデータ。各点は、n = 8の生物学的反復の平均±SEMを表している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 代表的な結果のデータ解析 スプレッドシート表6に示され、添付ファイルとして提供さを使用して、個々のウェルからのデータ値は、黄色のヘッダーに示す列に入力することができます。すべての6つの列に<html>右は、これらのエントリから計算されています。 表6の例では、前のポートに追加グルコース、オリゴマイシンの追加の有無にかかわらず、ネイティブの条件について個々のウェルからECARとOCRデータを使用してPPRのRESPとPPRのglycの計算を示しています。各生物学的製剤の技術的反復は、通常、最後の4列に出力の単一の値を与えるために平均化され、その後、別の生物学的製剤からのデータは、エラーBP内の統計と、これらの4つの値の適切な伝播に平均化されます。 <img alt="表6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> 呼吸器および解糖の酸性化の表6計算。黄色に向かって列（例えば、BP、最大H + / O 2）の値が計算から入力する指示、またはデータ収集（例えば、ECARのTOT、OCR）から。<html> PS：//www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;このテーブルの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">|。Excelのスプレッドシートとしてこの表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 補正後のPPRの解糖および呼吸の貢献 図3は、FCCPの添加（ポートB）次のネイティブ解糖および呼吸酸性化の速度、さらに（ポートA）オリゴ以下の料金、および料金については、表6のように算出されたデータのグラフィカルな出力を示しています。これらのデータは、基板の選択と呼吸と解糖の酸性化の変化の割合（なしでコントロール（CTL対グルコース）を添加）方法を実証し、ミトコンドリアの状態（ネイティブ関数対の薬理学的に変更された機能）を持ちます。 &quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> 解糖系や呼吸器のソースから図3プロトン生成速度（PPR）。呼吸からPPR（開口部）、コメントを追加しましたグルコース（3左のバー）または追加グルコース（3右バー）せずに式5を用いて計算したC2C12細胞の解糖（塗りつぶされた部分）。 6からのデータ。すべてのデータは、n = 8の生物学的複製の平均値±SEMを表します。

解糖系は、複数の生物学的システムにおける代謝マーカーを特徴づけるものです。H+の細胞外フラックスを測定することで解糖系をモニタリングすることは一般的ですが、定量的かつ明確にするためには補正が必要です。ここでは、細胞外酸性化の呼吸器系と解糖系のソースを区別するために、細胞外フラックスデータを収集して補正する方法を示します。

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

この手順の全体的な目的は、細胞外フラックス解析を用いて細胞の糖分解速度を正確に測定することです。この手法は、細胞外フラックス解析の分野における曖昧さ、特に糖分解速度を算出するために全細胞外酸性化を用いる際の問題を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、全細胞外酸性化速度を定量的に補正することで、呼吸および糖分解の両方によるプロトン産生速度を算出できることです。次に、細胞外フラックス測定装置を用いて緩衝能を測定するには、まず希釈した酸50 µLを測定プローブカートリッジのA、B、C、Dの4つのポートそれぞれに分注します。次に、標準的なキャリブレーションサイクルの後に、4つのポートへの添加をそれぞれ2サイクルずつ行う細胞外フラックスアッセイを実行するように、細胞外フラックス測定装置をプログラミングします。その後、準備したカートリッジを装置にセットし、ソフトウェアの指示に従って装置のキャリブレーションを行います。プログラムの指示に従い、Ca含有プレートを取り出し、アッセイ培地を含むプレートを挿入します。その後、各ポート添加前後の定常状態で得られた8〜10個のデータポイントの平均値を用いて、プログラムを継続します。これにより、標準酸の各注入によって生じたpHの累積差を算出します。測定プローブによって捕捉された7 µLの容量に含まれるプロトンのMに対するpHの変化をプロットします。線形勾配が、milli pH単位で表される緩衝能となります。次に、アッセイ培地をポートA、B、Cに交互にロードし、続いて表に示されている適切な濃度の塩酸をポートDに添加します。次に、細胞外フラックスアッセイプレートの20個の実験ウェルにおいて、5点の標準曲線を作成するための各ポイントを生成するため、4つのテクニカルレプリケートを用いてpHを測定します。外部pHメーターで緩衝能を測定するには、pH標準アッセイ培地と0.1 molar 塩酸をウォーターバスで37 degrees Celsiusまで温め、他の材料を温めている間に、校正バッファーに入れたpHプローブを37 degrees Celsiusまで温めます。製造元の指示に従って、37 degrees Celsiusでプローブを校正し、10 millilitersのアッセイ培地を小型容器に分注します。pHプローブを培地に浸し、連続的にモニタリングします。次に、培地を攪拌しながら、0.1 molar 塩酸を一度に10〜20 microliterずつアッセイ培地に加えます。酸を加えるたびに、pHが安定するまで数秒間待ち、表に示す通りにpH測定値を記録します。アッセイの30分前に、正確な勾配計算を可能にし、かつ実験中に予想されるpH範囲をカバーできるよう、十分な回数の添加を行ってください。適切な接着細胞集団を、培地を緩やかに吸引することで3回洗浄し、3回目の洗浄後に各ウェルに500 microlitersのKRPHをゆっくりと添加します。アッセイを開始するため、細胞を37 degrees Celsiusの空気下で30分間インキュベートします。各ウェルの培地を、500 units/mLの炭酸脱水酵素を含む500 µLの新鮮なKRPH（グルコース添加または非添加）に交換します。各実験化合物を適切な濃度で50 µLずつ細胞外フラックスセンサーカートリッジのポートに分注し、標準的な細胞外フラックスアッセイを実施して、本図の呼吸制御比を決定します。典型的な実験のデータとして、ここでの計算には、酸素消費速度およびpHの両方の連続測定における最後の10個の測定点を用いて示しています。個々の細胞外酸性化速度および酸素消費速度を用いて算出された呼吸性プロトン産生速度および糖分解性プロトン産生速度により、ポート導入前の定常状態を決定した。オリゴマイシン添加後の呼吸性および糖分解性酸性化の定常速度を示す。表から算出されたオリゴマイシン添加後の速度およびFCCP添加後の速度をグラフに表示しており、基質の変化に応じて呼吸性酸性化と糖分解性酸性化の割合がどのように変化するかが明確に示されている。この手順では、酸の校正を計画している実験と同じ温度（本手順では通常 37 °C）で行うことが重要です。算出された糖分解速度を検証するために、乳酸測定などの他のアッセイを利用することも可能です。このビデオを視聴することで、内部または外部の酸校正を用いて、呼吸による細胞外酸性化と糖分解による細胞外酸性化を区別するために、細胞外フラックスデータをどのように収集し補正するかについて十分な理解が得られるはずです。ミトコンドリア毒性物質の取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、手袋の着用や化学薬品用ドラフトチャンバー内での乾燥試薬の計量など、常に適切な予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

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細胞外フラックスアッセイを用いた一次ミクログリアにおける解糖系の研究

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