組織工学のための熱応答性ナノ構造表面の調製

ブロック共重合体を用いたこのラングミュア・シェーファー法の全体的な目的は、細胞の接着強度と付着を制御することにより、温度応答性表面のさまざまな条件下で細胞シートを作製することです。本手法は、生体適合性材料、細胞培養表面、バイオセパレーションといったバイオマテリアル分野における重要な課題の解決に寄与します。この手法の主な利点は、温度応答性表面と細胞との相互作用を制御でき、細胞シート回収のための修飾条件を最適化できる点にあります。

この手法は細胞と表面の相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、バイオセパレーションやバイオフィルムなどの他の系にも適用可能です。まず、スチレン、ECT、およびACVAを40 millilitersの1, 4-Dioxaneに溶解させます。反応性種を除去するため、この溶液を真空下で液体窒素を用いて15 to 20 minutesの間凍結させます。

室温で溶液を徐々に融解させた後、この凍結、ポンプ排気、融解による脱気サイクルを3回繰り返します。オイルバスを用いて70 °Cで15時間重合させ、ポリスチレンをマクロRAFT剤として得ます。このポリスチレンマクロRAFT剤を800 mLのエーテルで沈殿させ、真空乾燥します。

次に、IPAAmモノマー、ポリスチレンマクロRAFT剤、およびACVAを4 mLの1, 4-ジオキサンに溶解させます。前述と同様に、凍結・ポンプ・融解（freeze, pump, thaw）脱気サイクルを用いて溶液中の酸素を除去します。脱気後、オイルバスを用いて70 °Cで15時間重合を行います。

最後に、ポリスチレンマクロRAFT剤と同様の方法で、合成したSt-IPAAm分子を得ます。ガラス基板を過剰量のアセトンとエタノールで洗浄し、5分間超音波処理して表面の汚染物質を除去します。基板をオーブンにて65 °Cで30分間乾燥させます。

次に、室温で酸素プラズマを用いて基板表面を活性化させます。基板を1% hexatrimethoxysilaneを含むトルエンに室温で一晩浸漬し、基板をシラン化します。その後、シラン化された基板をトルエンで洗浄し、未反応の試薬を除去するためにアセトンに30分間浸漬します。

基板を110 °Cで2時間アニールし、表面を十分に固定します。最後に、サイラン化された基板をガラスカッターで25 mm × 24 mmに切り出し、細胞培養ディッシュに適合させます。ラングミュアフィルム装置は、ほこりの蓄積を防ぐため、キャビネット内に設置してください。

不純物を除去するため、ラングミュアトラフとバリアを蒸留水とエタノールで洗浄します。糸くずの出ないタオルで拭き取り、トラフとバリアを乾燥させます。その後、トラフに約110 millilitersの蒸留水を満たし、トラフの両側にバリアを設置します。

次に、表面張力をモニタリングするための白金ウィルヘルミープレートを、プレートが赤くなるまでガスバーナーで加熱します。その後、プレートを蒸留水で洗浄し、汚染物質を除去します。ウィルヘルミープレートを、表面圧測定装置に取り付けられたワイヤーで吊り下げます。

製造元のプロトコルに従って、表面圧測定装置のゼロ点調整を行います。トラフの両側にあるバリアを用いて、ポリマーの液滴が混入していない状態で、気液界面の面積が約50 square centimetersになるまで圧縮します。表面圧がほぼ0 millinewtons per meterになるまで、微小な汚染物質を吸引して除去します。

両側のバリアを元の位置に戻し、蒸留水の減少分を補うために蒸留水を加えます。次に、合成したSt-IPAAm分子5 mgをクロロホルムの展開溶媒5 mLに溶解させます。その後、マイクロシリンジまたはマイクロピペットを用いて、クロロホルムに溶解したSt-IPAAm 27 µLをトラフ上に静かに滴下します。

クロロホルムが完全に蒸発するまで5分間待機した後、両側のバリアを水平に移動させ、表面のSt-IPAAm分子を圧縮します。目標面積の50 square centimetersに達するまで、バリアの圧縮速度を0.5 millimeters per secondに維持します。圧縮中、製造元のプロトコルに従い、表面圧測定装置に取り付けられた白金ウィルヘルミープレートを用いて、表面圧Pi-A等温線を測定します。

目標の面積に達した後、St-IPAAm分子を弛緩させるため、5分間表面を維持します。分子は圧縮直後に平衡状態に達することはありません。その後、ラングミュア膜を疎水化処理したガラス基板へ転写装置を用いて転写し、膜を強固に吸着させるため5分間保持します。

疎水性ガラス基板をデバイス上に平行に固定します。デバイスをアライメントステージに接続し、垂直に移動させます。転送装置を用いて基板を水平に持ち上げ、デシケーター内で1日間乾燥させます。

細胞懸濁液を調製するために、ウシ頸動脈内皮細胞（BAEC）を、FBSおよびペニシリンを含むDMEMを用い、組織培養用ポリスチレン上で37°C、5%CO2および95%空気の条件下で1/3のコンフルエンスまで培養します。コンフルエンスに達した後、BAECに0.25%trypsin EDTAを3mL加え、37°C、5%CO2および95%空気の条件下で3分間処理します。10%FBSを含むDMEMを10mL加えることで、trypsin EDTAを不活化します。

そして、細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに回収します。120 ×gで5分間遠心分離した後、上清を吸引し、細胞を10 mLのDMEMで再懸濁します。使い捨てヘモサイトメーターでカウントし、回収した細胞を10,000 cells/cm²の濃度でSt-IPAAm表面に播種します。

37°C、5% CO2、95%空気の条件下に設定されたインキュベーター付き顕微鏡を用いて、表面上の細胞を観察します。次に、クリーンベンチに設置された紫外線照射装置により、St-IPAAm表面を滅菌します。接着したBAECsのタイムラプス画像を、位相差顕微鏡の10倍倍率を用い、37°Cで約24.5時間記録します。

BAECの接着後、20 °Cで約3.5時間、St-IPAAm表面からのBAECの脱離を記録します。ラングミュアフィルム転写表面における細胞の接着および脱離の最適化後、前述と同様にBAECを培養して細胞シートを作製します。St-IPAAm表面に1 cm²あたり合計100,000個の細胞を播種してください。

そして、37°C、5% CO₂条件下で3日間インキュベートします。コンフルエントになったBAECは、20°Cで自然に剥離しました。ここでは、温度応答性ラングミュア膜転写表面の作製について示します。

合成したSt-IPAAmのクロロホルム溶液を、気液界面にゆっくりと滴下した。2つのバリアを用いて、界面上のSt-IPAAm分子を目標面積である50 square centimetersに達するまで圧縮した。圧縮中に表面圧を測定し、ラングミュア膜に欠陥がないかを確認した。

圧縮後、疎水性修飾を施したカバーガラス基板を、アライメントステージを用いて界面に水平に配置しました。基板を水平に持ち上げ、1日間乾燥させました。この工程を経て、St-IPAAm表面が細胞培養実験に使用可能な状態となりました。

St-IPAAm表面の原子間力顕微鏡（AFM）トポグラフィ像の代表的な結果をここに示します。両方のSt-IPAAm表面においてナノ構造が観察されました。ナノ構造のサイズと形状は、AMおよびSt-IPAAmの組成に強く依存していました。

ここでは、St-IPAAm 480を用い、1分子あたり40 square nanometersのAMで転写されたラングミュア膜表面から回収したセルシートのマクロ画像を示します。37 degrees CelsiusでSt-IPAAm 170およびSt-IPAAm 480表面にて3日間培養した後、細胞はコンフルエンスに達しました。そして、温度を37から20 degrees Celsiusに下げた後、セルシートは速やかに回収されました。

このビデオを視聴することで、ポリマーの分子組成の設計方法、ラングミュア膜の作製および転写方法、細胞の接着と剥離の制御方法、そして細胞シートの回収方法について十分に理解することができます。本手法の開発により、バイオマテリアルおよび組織工学分野の研究者が、細胞と表面の相互作用や、再生医療に用いる細胞培養戦略を探索する道が開かれました。また、本手法は患者から提供された様々な種類の細胞で細胞シートを作製できる可能性があるため、その意義は細胞移植治療にまで及びます。