Name: 組織工学のための熱応答性ナノ構造表面の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学ぶLangmuir-Schaefer法による熱応答性ナノ構造表面の調製法。温度変化で細胞接着を制御し、組織工学や細胞シート回収に応用可能なバイオマテリアル技術を解説します。

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この研究は、文部科学省の先端学際的研究プログラム「細胞シート組織工学センター（CSTEC）」のイノベーションセンター創成事業によって財政的に支援されました。

ツーステップ可逆的付加-フラグメンテーション連鎖移動（RAFT）ラジカル重合によるポリポリスチレンブロックの1の合成（N -isopropylacrylamide） <ol><li>スチレン（153.6ミリモル）を溶​​解させ、4-シアノ-4-（ethylsulfanylthiocarbonyl）sulfanylpentanoic酸（ECT; 0.2ミリモル）、及び4,4&#39;-アゾビス（4-シアノ吉草酸）（ACVA; 0.04ミリモル）を1 40ml中、 1,4-ジオキサン。反応性種を除去し、徐々に室温で解凍する15〜20分間真空下で液体窒素中で溶液をフリーズします。溶液が完全に解凍されていることを確認し、この凍結 - ポンプ - 解凍脱ガスサイクルを3回繰り返します。 </li><li>オイルバスで15時間、70℃で重合によるマクロRAFT剤として：ポリスチレン（PST）（13500 Mw）を取得します。 </li><li> 真空中でエーテルとドライの800ミリリットルと沈殿物たPStマクロRAFT剤。 </li><li> 1,4-ジオキサン4ml中IPAAmモノマー（4.32ミリモル）、たPStマクロRAFT剤（0.022ミリモル）、及びACVA（0.004ミリモル）を溶​​解させます。 </li><li>削除しますステップ1.1で述べたように凍結 - ポンプ - 融解脱気サイクルによって溶液中の酸素。 </li><li>脱気後の油浴中で15時間70℃で重合を行います。たPStマクロRAFT剤と同様の方法で：合成セントIPAAm分子（32800 Mw）を取得します。 </li></ol>シラン処理疎水性修飾ガラス基板の作製<ol><li>表面汚染物を除去するために5分間、アセトンとエタノールと超音波処理の過剰な洗浄ガラス基板（×50mmの24 mm）です。 </li><li> 30分間65℃のオーブン中に基板を乾燥させます。その後、室温で基板の表面を活性化するために酸素プラズマ（400 W、3分）を使用します。 </li><li>基板をsilanizeするRTで一晩、1％ヘキシルを含むトルエン中に基板を浸し。 </li><li>トルエン中でシラン化された基板を洗浄し、未反応物質を除去するために、30分間アセトンに浸します。 </li><li> 110℃で2時間アニール基質は完全にSを固定しますurface。 </li><li>細胞培養皿（：φ35ミリメートルディッシュサイズ）に合うように25ミリメートル×24ミリメートルにガラスカッターでシラン化基板をカットします。 </li></ol>ラングミュアフィルムおよびフィルム転写表面の調製<ol><li>埃の蓄積を防ぐために、キャビネットにラングミュア膜装置を配置します。 </li><li> （580ミリメートル×145ミリメートルサイズ）、蒸留水や汚染物質を除去するためにエタノールで障壁ラングミュアトラフを洗ってください。 </li><li>リントフリータオルで拭いてトラフや障壁を乾燥させます。その後、蒸留水約110ミリリットルでトラフを記入し、トラフの両側に障壁を設定します。蒸留水を3.5から3.13には、次の手順にこぼすことなく添加されるべきであることに注意してください。 </li><li>プレートが赤に変わるまで、ガスバーナーで表面張力を監視するために、その後、汚染物質を除去するために蒸留水で洗う：白金ウィルヘルミー板（39.24ミリメートル周囲を）加熱します。に取り付けられたワイヤ上ウィルヘルミープレートをサスペンド表面圧力測定機器。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってゼロ面圧測定器。インタフェースは、ポリマーの任意の低下なしに約50 cm 2で達するまで溝の両側に障壁によってトラフの空気-水界面を圧縮します。 </li><li>面圧まで吸引し、小さな汚染物質はほぼ0 MN / mです。 </li><li>両側の障壁を再配置し、ステップ3.6から蒸留水の減少を補うために蒸留水を追加します。 </li><li>クロロホルムの現像液の5mlに合成されたサンIPAAm分子5mgを溶解させます。 注：ジクロロメタンまたはトルエンを溶媒として使用することもできます。 </li><li>静かにマイクロシリンジまたはマイクロピペットを用いて、トラフ上にクロロホルムに溶解サンIPAAmの27μLをドロップします。 </li><li>クロロホルムを完全に蒸発を可能にするために5分間待った後、サンIPAAm molecuを圧縮するために、水平方向の両方の障壁を移動ル界面で。 cm 2で達成される50の標的領域まで0.5 mm /秒での障壁の圧縮率を維持します。 注：急速な圧縮率は、ラングミュア膜中の欠陥を引き起こします。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、圧縮中の表面圧力測定機器に接続されている白金ウィルヘルミー板と面圧（π）-A メートル等温線を測定します。 </li><li>対象領域の大きさに達した後、サンIPAAm分子がリラックスできるようにするために5分間表面を維持します。分子は、圧縮後すぐに平衡状態に達していません。 </li><li>確実にフィルムを吸着するため5分間転写装置を用いて、疎水的に改質されたガラス基板にラングミュアフィルムを転送します。デバイス上で並列に疎水性のガラス基板を固定してください。アライメントステージにデバイスを接続し、垂直に移動します。 </li><li> desiccatoでの1日の転送装置と乾燥して水平に基板を持ち上げrを。 </li></ol> 4.細胞を培養し、ラングミュアフィルム転写面上の細胞接着と剥離の最適化<ol><li> 10％の胎児を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で組織培養ポリスチレン（TCPS）上のCO 2、95％空気、5％中で37℃で三分の一コンフルエンスまで細胞懸濁液を、培養ウシ頸動脈内皮細胞（BAECs）を調製しウシ血清（FBS）および100 U / mlペニシリン。 </li><li>コンフルエンスに達した後、0.25％トリプシン-EDTAを3分間37℃、5％CO 2及び95％空気中で3mlでBAECsを扱います。 </li><li> DMEM、10％FBSを含有する10mlのを添加することによりトリプシン-EDTAを非アクティブ化し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を収集します。 </li><li> 5分間、120×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。再懸濁DMEMの10ミリリットルで細胞を。 </li><li> 5分間滅菌するためのクリーンベンチに紫外線下でサンIPAAm面を配置します。 </li><li>回収されたCEの種子サンIPAAmのLLSは、使い捨て血球計により計数し、1.0×10 4細胞/ cm 2の濃度で表面及び5％CO 2および95％で37℃のインキュベーターを備えた顕微鏡で表面上の細胞を観察します空気。 注：クリーンベンチに搭載した紫外線によりサンIPAAm表面を滅菌します。 </li><li> 10倍の倍率で位相差顕微鏡により、37℃で約24.5時間、付着BAECsのレコードタイムラプス画像。 BAEC接着、約3.5時間、20℃でのSt-IPAAm表面からBAECsのレコード剥離後。 </li></ol>ラングミュアフィルム転写表面上5.細胞シートの作製<ol><li>セクション4で説明したのと同じ方法で使用される培養BAECs。 </li><li>サンIPAAm表面に1.0×10 5細胞/ cm 2の合計に播種し、5％CO 2中、37℃で3日間インキュベートします。コンフルエントBAECsは自発的に20℃で切り離さ。</li>
</ol>

<ol><li>Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+macromolecules+from+electrical+and+chemical+stimuli-responsive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Makromol.+Chem.%2C+Macromol.+Symp%22%5BJournal%5D)">Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels.</a> Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+control+of+free+energy+and+topography+of+nanostructured+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).</li>
<li>Nykanen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+behavior+and+temperature-responsive+molecular+filters+based+on+self-assembly+of+polystyrene-block-poly%28N-isopropylacrylamide%29-block-polystyrene%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene.</a> Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+switching+between+superhydrophilicity+and+superhydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).</li>
<li>Shuler, R. L., Zisman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+behavior+of+Polyoxyethylene+at+the+air-water+interface+by+wave+damping+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods.</a> J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).</li>
<li>Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+monolayer+dynamics+at+the+air%2Fwater+interface+by+surface+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering.</a> Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).</li>
<li>Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+solvent+and+temperature+effects+on+interfacial+properties+of+Poly+%28N-isopropylacrylamide%29+films+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface.</a> Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).</li>
<li>Jheng, K. T., Hsu, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+effect+of+PMMA+on+its+miscibility+with+PS-b-PEO+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface.</a> J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).</li>
<li>Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+on+a+polymerized+peptide-amphiphile+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer.</a> Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).</li>
<li>Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsiveness+of+poly%28N%2CN-diethylacrylamide%29+polymers+at+the+air-water+interface%3A+The+effect+of+a+hydrophobic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+interface+sci%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block.</a> Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).</li>
<li>Wang, S. Q., Zhu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+method+to+prepare+smooth+and+homogeneous+polymer+brush+surfaces+of+varied+brush+thickness+and+grafting+density%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density.</a> Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).</li>
<li>Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langmuir%E2%88%92Schaefer+%28LS%29+macroinitiator+film+control+on+the+grafting+of+a+thermosensitive+polymer+brush+via+surface+initiated-ATRP%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP.</a> Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).</li>
<li>Seo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+and+mesh+conformations+of+diblock+copolymer+blends+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface.</a> Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).</li>
<li>Lu, Q., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-assisted+formation+of+nanostrand+networks+from+supramolecular+diblock+copolymer%2Fsurfactant+complexes+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface.</a> Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).</li>
<li>Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+highly+ordered+dot+array+of+surface+micelles+of+a+block+copolymer+via+liquid+crystal-hybridized+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly.</a> Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).</li>
<li>Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+order+transition+in+nanodot-forming+diblock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).</li>
<li>Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+behavior+of+polystyrene-b-poly%28acrylicacid%29+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface.</a> Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).</li>
<li>Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering.</a> Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).</li>
<li>Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+cell+culture+on+a+thermally+reversible+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer.</a> Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).</li>
<li>Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+control+through+porous+membranes+immobilized+with+thermosensitive+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer.</a> Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).</li>
<li>Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+sheet+recovery+by+co-grafting+of+PEG+with+PIPAAm+onto+porous+cell+culture+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes.</a> Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).</li>
<li>Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+designs+of+biomedical+materials%3A+applications+of+cell+sheet+engineering+to+functional+regenerative+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs.</a> J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).</li>
<li>Fukumori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ultra-thin+temperature-responsive+polymer+layer+and+its+polymer+thickness+dependency+on+cell+attachment%2Fdetachment+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties.</a> Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+chain+length+and+graft+density+of+thermoresponsive+polymer+brushes+for+optimizing+cell+sheet+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest.</a> Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29-based+block+copolymer+coating+for+optimizing+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication.</a> Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).</li>
<li>Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakuma%2C+M+%22J.+Biomater.+Sci.%2C+Polym.+Ed%22">J. Biomater. Sci., Polym. Ed</a>. 25 (5), 431-443 (2014).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+nanostructured+surfaces+generated+by+the+Langmuir-Schaefer+method+are+suitable+for+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication.</a> Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).</li>
<li>Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RAFT+polymerization%3A+the+synthesis+of+polymers+with+defined+end-groups%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups.</a> Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).</li>
<li>Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishida%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 351 (12), 1187-1196 (2004).</li>
<li>Ohki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+esophageal+stricture+after+endoscopic+submucosal+dissection+using+tissue-engineered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets.</a> Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).</li>
<li>Sawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+myoblast+sheets+improved+cardiac+function+sufficiently+to+discontinue+LVAS+in+a+patient+with+DCM%3A+report+of+a+case%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Today%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case.</a> Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).</li>
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すべての著者が原稿の執筆に平等に貢献し、最終版を承認しました。著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

温度応答性表面は、ラングミュア - シェーファー法により作製し、細胞接着/剥離および細胞シートの回収のために表面特性を最適化しました。表面を製造するためのこの方法を使用する場合、いくつかのステップは重要です。サンIPAAm分子の分子組成物は、表面構造および表面の安定性、ひいては、細胞接着および剥離に大きな影響を与えます。特に、サンIPAAm分子は、狭い分子量分布を有するべきです。本手法では、異なるPIPAAm鎖長を有する2つのセントIPAAm分子は、分子量及び分子量分布の制御を可能にする、RAFT重合により合成しました。 ステップは、ナノ構造の欠陥を回避するためにサンIPAAm表面の調製中に、空気 - 水界面の汚染を防止するために注意すべきです。インターフェイス上にポリマー分子をドロップする前に、contaminan面圧が約0 MN /メートルに達するまでのtsを吸引する必要があります。汚染は、トラフとウィルヘルミ板のエッジの周りに蓄積する傾向があります。ウィルヘルミー板はその表面に何らかの汚染があったので、それがアニールしました。紙ウィルヘルミー板を使用する場合、界面での吸引工程...

ナノ構造化表面は、最近によるパターニング、細胞培養、洗浄、表面切り替えを含め、さまざまな潜在的用途にかなりの注目を集めています。例えば、蓮の葉やその他の応答性表面のナノ構造に触発された超疎水性表面は、外部からの刺激1-4に反応することができます。 ラングミュア膜は、最も広く研究され、ポリマーコーティングの一つです。ラングミュアフィルムを空気-水界面5-8に両親媒性分子を滴下することにより形成されます。フィルムは、その後、物理的または化学的吸着によって、固体表面に転写することができ、固体表面上の分子の立体配座は、垂直および水平転送方式9-12を用いて制御することができます。ラングミュア膜の密度が正確に空気 - 水界面を圧縮することによって調節することができます。最近、この方法はまた、ナノスケール海島structurを製造するための効果的であることが証明されています両親媒性ブロックコポリマーを利用することにより、ES。ナノ構造体は、疎水性セグメントのコアと親水性セグメント13-17の殻から成っているものとします。また、表面上のナノ構造の数は、界面でのブロック共重合体の分子当たりの面積（m）を制御することによって調節されます。 我々は、温度応答性培養表面を用いて、元の、ユニークな足場フリー組織工学アプローチ、細胞シート工学に焦点を​​当てています。開発した技術は、様々な器官18のための再生治療に適用されています。温度応答性培養表面は、表面19-27上に、ポリ（N -isopropylacrylamide）（PIPAAm）、温度応答性分子をグラフトすることにより作製しました。 PIPAAmおよびそのコポリマーは、32℃付近の温度で、水性媒体中で下限臨界溶液温度（LCST）を示します。培養表面は、温度応答性alternatiを示しました<html>疎水性と親水性の間に。 37℃で、PIPAAmグラフト化表面は疎水性になり、細胞が容易に取り付けられ、表面上だけでなく、従来の組織培養ポリスチレン上で増殖しました。温度を20℃に下げたときに、表面が親水性となり、細胞が自然に表面から剥離します。従って、表面上で培養したコンフルエントな細胞は、温度を変化させることにより、完全なシートとして回収することができます。これらの細胞接着及び剥離特性はまた、研究室のデモンストレーション26、27ラングミュアフィルムコーティングによって製造面で表示した。ポリスチレン（P（ST））からなるブロック共重合体のラングミュア膜とPIPAAm（ST-IPAAm）を作製しました。特定のA mのラングミュア膜が水平に疎水的に修飾されたガラス基板に転写することができました。また、温度に応答して調製された表面からの細胞の接着および剥離を評価しました。 _content &quot;&gt;ここでは、ガラス基板上に熱応答性両親媒性ブロックコポリマーからなるナノ構造ラングミュア膜の製造のためのプロトコルを記述している。我々の方法は、表面科学の様々な分野において有機ナノフィルムのための効果的な製造技術を提供することができ、より多くのを容易にすることができます上の細胞接着を効果的に制御し、表面からの自然剥離。

<table><tbody><tr><td>N-イソプロピルアクリルアミド</td><td>高神</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>アゾビス(4-シアノ吉草酸)</td>和<td>光純薬</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>スチレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-トリオキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ジオキサン</td><td>和光純薬品</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>中雷</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA</td><td></td><td>Sigma T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>日本バイオセラム</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAECs</td><td>健康科学研究資源バンク</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>松波ガラス工業</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>東ソー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett堆積トラフ&nbsp;</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA Midium trough</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE TE2000-U</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

組織工学のための熱応答性ナノ構造表面の調製

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

細胞の接着と剥離を制御するためのThermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-固定化表面をLangmuir-Schaefer法で作製しました。ポリスチレンとPIPAAm(St-IPAAms)からなる両親媒性ブロック共重合体を可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動(RAFT)ラジカル重合により合成した。St-IPAAm分子のクロロホルム溶液をLangmuir-trough装置に穏やかに滴下し、装置の両方のバリアを水平に移動させてフィルムを圧縮し、密度を調整しました。次に、St-IPAAm Langmuirフィルムを疎水性に改質されたガラス基板上に表面固定デバイスによって水平に転写しました。原子間力顕微鏡の画像から、表面のナノスケールの海島構造がはっきりと見えました。調製した表面上の細胞接着と剥離の強度、速度、および質は、PIPAAm分子の下限臨界溶液温度範囲にわたる温度の変化によって調節されました。また、最適化された表面上に2次元の細胞構造(細胞シート)を回収することに成功しました。これらのユニークなPIPAAm表面は、細胞の接着と剥離の強度を制御するのに役立つ可能性があります。

ポリスチレン、特定の分子量を有するポリ（Nの -isopropylacrylamide）（ST-IPAAms）からなるブロックコポリマーは、RAFTラジカル重合によって合成しました。 Moad ら 28に記載されるようにECTは、連鎖移動剤として調製しました。異なるPIPAAm鎖長の二サンIPAAm分子を合成し、得られたブロックポリマーは、1 H核磁気共鳴（NMR）、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によって特徴付けました。サンIPAAmsの分子量は、狭い分子量分布（1.31および1.50）で、32,800、および67900でした。ポリスチレンマクロRAFT剤とPIPAAmのモノマー転化率が17.4％以上85.0％であることが見出されました。合成されたサンIPAAmsはそれぞれ、サンIPAAm170とサンIPAAm480と命名しました。 分子当たりの様々な分野（ <sub...

は、細胞の自発的な接着と剥離を制御するためのLangmuir-Schaefer法により、熱応答性ブロック共重合体で構成されるナノスケールの海島表面を作製しました。表面の調製と表面上の細胞の接着と剥離の両方を視覚化しました。

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

ブロック共重合体を用いたこのラングミュア・シェーファー法の全体的な目的は、細胞の接着強度と付着を制御することにより、温度応答性表面のさまざまな条件下で細胞シートを作製することです。本手法は、生体適合性材料、細胞培養表面、バイオセパレーションといったバイオマテリアル分野における重要な課題の解決に寄与します。この手法の主な利点は、温度応答性表面と細胞との相互作用を制御でき、細胞シート回収のための修飾条件を最適化できる点にあります。この手法は細胞と表面の相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、バイオセパレーションやバイオフィルムなどの他の系にも適用可能です。まず、スチレン、ECT、およびACVAを40 millilitersの1, 4-Dioxaneに溶解させます。反応性種を除去するため、この溶液を真空下で液体窒素を用いて15 to 20 minutesの間凍結させます。室温で溶液を徐々に融解させた後、この凍結、ポンプ排気、融解による脱気サイクルを3回繰り返します。オイルバスを用いて70 °Cで15時間重合させ、ポリスチレンをマクロRAFT剤として得ます。このポリスチレンマクロRAFT剤を800 mLのエーテルで沈殿させ、真空乾燥します。次に、IPAAmモノマー、ポリスチレンマクロRAFT剤、およびACVAを4 mLの1, 4-ジオキサンに溶解させます。前述と同様に、凍結・ポンプ・融解（freeze, pump, thaw）脱気サイクルを用いて溶液中の酸素を除去します。脱気後、オイルバスを用いて70 °Cで15時間重合を行います。最後に、ポリスチレンマクロRAFT剤と同様の方法で、合成したSt-IPAAm分子を得ます。ガラス基板を過剰量のアセトンとエタノールで洗浄し、5分間超音波処理して表面の汚染物質を除去します。基板をオーブンにて65 °Cで30分間乾燥させます。次に、室温で酸素プラズマを用いて基板表面を活性化させます。基板を1% hexatrimethoxysilaneを含むトルエンに室温で一晩浸漬し、基板をシラン化します。その後、シラン化された基板をトルエンで洗浄し、未反応の試薬を除去するためにアセトンに30分間浸漬します。基板を110 °Cで2時間アニールし、表面を十分に固定します。最後に、サイラン化された基板をガラスカッターで25 mm × 24 mmに切り出し、細胞培養ディッシュに適合させます。ラングミュアフィルム装置は、ほこりの蓄積を防ぐため、キャビネット内に設置してください。不純物を除去するため、ラングミュアトラフとバリアを蒸留水とエタノールで洗浄します。糸くずの出ないタオルで拭き取り、トラフとバリアを乾燥させます。その後、トラフに約110 millilitersの蒸留水を満たし、トラフの両側にバリアを設置します。次に、表面張力をモニタリングす

preparation-thermoresponsive-nanostructured-surfaces-for-tissue

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JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶLangmuir-Schaefer法による熱応答性ナノ構造表面の調製法。温度変化で細胞接着を制御し、組織工学や細胞シート回収に応用可能なバイオマテリアル技術を解説します。

組織工学のための熱応答性ナノ構造表面の調製

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