植物におけるFISHのための適切な高速空気乾燥滴下染色体製造方法

この方法の全体的な目標は、単一および高コピーDNAプローブを使用したC twoハイブリダイゼーション技術の蛍光に適した植物染色体を調製することです。この方法は、染色体再配列の検出、染色体上の遺伝マーカーの順序付け、異なる種間の比較分析など、細胞遺伝学およびゲノム研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順の主な利点は、染色体スプレッドの調製が迅速、簡単、効率的になることです。

細胞懸濁液はマイナス20度で最大2か月保存でき、必要に応じて染色体調製に使用できます。この方法のアイデアが最初に浮かんだのは、適切な染色体の品質と数が劇的に増加したことを観察したとき、人間の日は、2日後に摂氏22度から24度の暗い条件下で、湿った濾紙の2層に10〜20個のオオムギの種子を発芽させます。かみそりの刃を使用して、種子から1〜2センチメートルの長さの活発な根を切り取ります。

次に、砕いた氷水に冷たい水道水が入った500ミリリットルのガラス瓶を入れて、氷冷水を準備します。氷冷水を通気し、根の先端を20時間浸して、中期細胞の頻度を増やします。根を水から50ミリリットルのエタノール酢酸固定液に移し、固定後2日間室温で固定します。

50ミリリットルのガラススピーカーで30ミリリットルの氷冷水道水で10〜20本の根を5分間2回洗います。鉗子を使用して、根を1つずつ30ミリリットルのクエン酸緩衝液に移します。ガラススピーカーを5分間2回振って根を洗います。

次に、根を濾紙に置き、顕微鏡で液体を完全に取り除きます。望ましくない非粘弾性組織をかみそりの刃で切り取ります。この手順の最も重要なステップは、種によって異なる可能性のある適切な消化時間を決定することです。

ここでは、最大20個の根の先端を1ミリリットルの酵素混合物に摂氏37度で約50分間インキュベートします。ウォッチグラス内の植物組織を顕微鏡下で軟化させるには、ピペッティングで酵素を除去し、根の先端を氷上で5ミリリットルの0.01モルクエン酸緩衝液で洗浄して、残留酵素を置き換えます。根の先端を1ミリリットルの96%エタノールで同じ時計のガラスで2回注意深く洗い続けます。

次に、エタノールを根の先端ごとに10〜15マイクロリットルの新しく準備した固定液と交換します。根の先端を固定剤と一緒に2ミリリットルのチューブに移し、解剖針または鉗子で根の茎を崩壊させます。チューブを20回タップして細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を取得します。

次に、水に浸したティッシュペーパーを2〜3層重ねて、摂氏50度のホットプレートに置きます。顕微鏡のスライドを氷に浸し、冷たい水道水を冷蔵庫で30分間浸します。次に、スライドを湿ったティッシュペーパーの上に置き、7〜10マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで取り出し、ホットプレート上に置いた冷却スライドに20センチメートルの距離から落下させます。

これに続いて、スライド上の細胞懸濁液と同じ場所に10マイクロリットルの酢酸エタノール混合物を投入し、スライドをホットプレート上に保ちます。2分後、スライドをウェットティッシュなしでホットプレートに置き、さらに1分間乾かします。フェイスコントラスト顕微鏡を使用してスライドをチェックし、染色体スプレッドの品質を制御します。

スライドを同じ日に使用するか、マイナス20°Cのコプリンジャーに96%エタノールを浸して保存し、魚の前にスライドを前処理します。鉗子を使用して、50ミリリットルの2つのXSSCを含むコピンジャーにスライドを5分間置きます。スライドを50ミリリットルの45%酢酸を含むコプランジャーに3〜10分間移します。

次に、スライドを50ミリリットルの2つのXSSCを含むコプランジャーに10分間移します。次に、スライドを50ミリリットルの4%ホルムアルデヒドを含むコプリンジャーに移し、スライドを10分間浸して染色体を固定します。ホルムアルデヒドを除去するには、50ミリリットルの2つのXSSCが入ったコプリンジャーでスライドを3回、それぞれ4分間すすぎます。

次に、スライドを70%90%と100%エタノールのシリーズで2分間脱水し、スライドを垂直位置で乾燥させます。各スライドについて、10マイクロリットルの脱イオン形態アミド、5マイクロリットルの4つのXハイブリダイゼーションバッファー、3マイクロリットルのプローブ、および2マイクロリットルのDNS自由水を使用して、20マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液を調製します。スライドごとに20マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液を追加し、24 x 32ミリメートルのカバースリップで覆います。

ホットプレート上で80°Cで2分間同時にプローブを備えたゴムセメント変性スライドでカバースリップをシールした後、スライドを湿ったチャンバーに移し、37°Cで一晩インキュベートします。光を避けて、2つのXSSCを備えたカップリングジャーでスライドをすすぎ、カバースリップを取り外します。次に、スライドを摂氏55〜60度、2つのXSSCを含むコプランジャーに入れ、20分間インキュベートします。

次に、スライドを2つのXSSCに入れ、室温で2分間コプランジャーに入れます。もちろん。スライドをコプランジャーで70%90%と100%エタノールのシリーズで2分間脱水します。空気。スライドを乾かし、強い光を避けて、Antifa封入剤でダッピーで対抗染色します。

落射蛍光顕微鏡を使用してスライドを分析します。フィルターの選択は、必要に応じてプローブのラベリングに使用される蛍光色素によって異なります。スライドは、暗い条件下で摂氏4度で最大1年間保管します。

ここでは、高速エアドライドロップ染色体調製法によって調製された有糸分裂中期スプレッドを示します。魚類分析は、反復配列と単一コピー配列の両方を使用して実施しました。画像は、対応するフルオロ4の励起を可能にする一連のフィルターを備えた落射蛍光顕微鏡によって取得され、高感度CCDモノクロカメラで撮影されました。

魚類の実験では、1つのコピープローブと5つのS-R-D-N-Aを使用して、hoardとvulgariの有糸分裂中期染色体について、明確で高品質なシグナルが明らかになりました。hordyとBULBUSの染色体上のCT CTT 10マイクロサテライトのハイブリダイゼーションは、特異的で明確なパターンをもたらしました。PSC 119 2プローブを用いたサラシリアルの有糸分裂中期染色体に対する魚類実験では、特異的で高品質なシグナルが得られました。

このアプローチの明らかな利点は、十分に広がり、損傷を受けず、多数の中期染色体が魚類分析を成功させるための完璧な前提条件として機能することです。一度マスターすると、この手順は適切に実行されれば2時間未満で完了します。このビデオを見た後、あなたは魚のIDEと前者のための高品質の有糸分裂メタフェイス染色体空間撮影を準備する方法についてよく理解しているはずです、高さは非常に危険であり、常にこれらの手順を実行するときにグラフとフィルムフードを使用するために。