アテローム性動脈硬化症の高速検出のための酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波駆動型の合成

このプロトコルの全体的な目標は、マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化症のMRIによる迅速な検出のためのビスフォスフォネート部分を持つ酸化鉄ナノ粒子の迅速な合成および機能化のためのマイクロ波技術の使用です。酸化鉄ナノ粒子の合成および機能化におけるマイクロ波技術の使用は、まだ限られています。しかし、私たちは、高品質のナノ粒子と非常に高速なプロトコルをどのように開発できるかを示しています。

この技術の主な利点は、非常に短時間で、高品質の官能基化ナノ粒子を製造し、微小石灰化を標的とするアテローム性動脈硬化症プラークのカテーテル挿入に使用できることです。この手順を開始するには、0.5グラムの鉄3-アセチルアセテン酸、1.4ミリリットルのオレイン酸、0.6ミリリットルのオレイラミン、および1.19グラムの1,2-ヘキサドデカンジオールをマイクロ波適応フラスコに加えます。目盛り付きのピペットを使用して、フラスコの壁に10ミリリットルのフェニルエーテルを慎重に加えます。

これに続いて、フラスコをマイクロ波リアクターに置き、マイクロ波に動的スタディをロードしてマイクロ波プロトコルを開始します。反応が完了し、フラスコが室温まで冷却されたら、ガラスピペットを使用して反応混合物を三角フラスコに移し、10ミリリットルの98パーセントエタノールを加えます。ネオジムニオブホウ素磁石の上にフラスコを置き、5分後にガラスピペットで上清を取り除きます。

次に、フラスコに10ミリリットルのエタノールを追加します。サンプルを40キロヘルツで室温で2分間超音波処理します。終了したら、サンプルを磁石に置き、上清を取り除きます。

オレイン酸被覆ナノ粒子を30ミリリットルのクロロホルムに分散させ、室温で40キロヘルツで5分間超音波処理します。超音波処理後、ガラスキュベット中の0.5ミリリットルのナノ粒子を移し、0.5ミリリットルのクロロホルムを加える。ゼータサイザーの流体力学的サイズを製造元の指示に従って確認してください。

この時点で、44.3ミリグラムの過マンガン酸カリウムと150.4ミリグラムの塩化ベンゾイルトリメチルアンモニウムを水とクロロホルムの3〜2の混合物に溶かします。得られた溶液を、マイクロ波適応フラスコ内のオレイン酸被覆ナノ粒子の5ミリリットルのアリコートに加えます。温度を摂氏105度、時間を9分、圧力を250psi、電力を300ワットに設定して、アゼライン酸ナノ粒子のマイクロ波プロトコルを開始します。

これに続いて、フラスコに10ミリリットルのpH 2.9リン酸緩衝液を追加します。マイクロ波プロトコルを繰り返し、上清を取り除いた後、フラスコに10ミリリットルの水を加え、混合物を三角フラスコに移します。最も重要なステップは、アゼライン酸ナノ粒子の精製です。

次に、5ミリリットルの10%重硫酸ナトリウムを三角フラスコに加え、摂氏25度で40キロヘルツで2分間超音波処理します。粒子を収集し、上清を除去した後、ナノ粒子を1パーセントの水酸化ナトリウムでさらに3回洗浄します。粒子を5ミリリットルのpH 7.2リン酸緩衝液に再分散させます。

流体力学的サイズとゼータ電位を確認するには、0.7ミリリットルのアゼライン酸ナノ粒子を使い捨ての折り畳まれた毛細血管セルに移し、それをゼータサイザーに入れて分析します。12ミリグラムのEDCと15ミリグラムのスルホNHSを、2ミリリットルのアリコートのアゼライン酸ナノ粒子を入れた遠心分離チューブに加えます。混合物を室温で35分間ボルテックスします。

遠心分離管の下に磁石を配置してナノ粒子を不安定化させた後、上清を吸引し、粒子を1.5ミリリットルの1ミリモルHEPES緩衝液で洗浄します。次に、5ミリグラムのネリドロネートを加え、混合物を2時間ボルテックスします。ナノ粒子を磁石で分離し、1ミリモルのHEPES緩衝液で洗浄します。

最後に、ネリドロネートナノ粒子を2ミリリットルの1ミリモルヘペス緩衝液に分散させます。流体力学的サイズとゼータ電位を確認するには、0.7ミリリットルのネリドロネートナノ粒子を使い捨ての折り畳み毛細血管セルに加え、ゼッツァーに入れて分析します。すべてのナノ粒子は、非常に狭いサイズ分布で小さな流体力学的サイズを示しました。

粒子は、TEM画像に示すように優れた結晶化度を示します。さらに、合成を4回繰り返した後も、流体力学的なサイズと分布について同じ結果が得られ、マイクロ波アプローチの最も重要な側面の1つであるその再現性が実証されました。ネリドロネートナノ粒子中に存在するビスフォスホネート類によるカルシウムイオン結合特性をリラクソメトリーにより確認し、ナノ粒子クラスターの形成によりT2の緩和時間がカルシウムイオン量とインキュベーション時間に比例して増加するのに対し、カルシウムイオンを含まないナノ粒子は安定していることを実証した。

in vivo MRI実験は、48週齢のapoeノックアウトマウスで行われ、注射後1時間で、プラークからの信号は基礎画像と比較して低信号でした。さらに、プラークと筋肉の比率は、基礎画像と注射後1時間画像で有意に異なっていました。肝臓のシグナルは、20分後に循環から完全に除去されたネリドロネートナノ粒子の注入後にも監視され、これらのナノ粒子がアテローム性動脈硬化プラークに向かって選択的に蓄積することを確認しました。

ex vivoイメージングと組織学を行い、ナノ粒子の有無にかかわらず、aortasのイメージングはin vivo実験と一致するシグナル強度の違いを示しました。マイクロ波技術を習得すると、適切に実行すれば、合成特性評価とプラーク検出を合計3時間で行うことができます。この方法の別の利点は、アテローム性動脈硬化症の定量化などの追加の質問に答えるために、サーモグラフィーなどの他のイメージング技術を少し変更するだけで実行できることです。

その開発後、この技術は、心血管イメージングの分野の研究者が、臨床ニーズに容易に適応できる実験設定を使用してアテローム性動脈硬化症の早期診断を探求する道を開きました。このビデオを見れば、マイクロ波で親水性酸化鉄ナノ粒子を作製する方法と、その心血管イメージングへの応用について十分に理解できるはずです。電子レンジでの作業は、使用するオーブンによっては危険な場合があり、この手順を実行するときは常に貯水槽の圧力制御などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。