Name: 幹細胞様アフリカツメガエル胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するためにインビトロとインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶXenopus laevis胚外植片を用いた神経発達の分子メカニズムと細胞プロセスの解析法。インビトロとインビボの両方で、細胞運動や運命決定を研究する効率的なツールを提供します。

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著者は、Hugo Juraver-Geslin、Marion Wassef、Anne Hélène Monsoro-Burqの助けとアドバイス、そしてキュリー研究所の動物施設に感謝します。著者は、原稿の編集作業に対してポール・ジョンソンに感謝しています。この研究は、Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) と "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 および ARC 5115;FRC DOC20120605233およびLABEX Memolife)、ピエール・ジル・ド・ジェンヌ財団(FPGG0039)。

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<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
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<li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Building+a+bridal+chamber%3A+development+of+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li>
<li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xotch%2C+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li>
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<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+old+problem%2C+new+findings%2C+yet+more+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li>
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<li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems%3A+a+single+origin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?</a> Evodevo. 4, 27(2013).</li>
<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy%3A+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

神経発生は（3,31,32に投稿）周囲の組織からの細胞の発生プログラムと信号間の複雑な相互作用によって編成されます。ここでは、Xで使用することができるプロトコルのセットを記述し外因性およびin vitroおよびin vivoでの神経運命の決意と神経形態形成に関与する内因性の要因を探るために胚をアフリカツメガエル 。これらのプロトコルは、Xでそのまま使用することができしかしトロピカ胚 、X.トロピカ胚は、Xの後、4倍小さく、胚をアフリカツメガエル 。鉗子やタングステン針の両方が微細化する必要性を使用していました。可能な場合は、Xを使用しますアフリカツメガエル 。 Xの正確な可視化ツメガエルとX.トロピカ神経組織原のフィールドは、WM-ISHから解剖し、神経管の組織学的フラットマウントを使用して達成することができま...

脊椎動物の神経系は神経上皮細胞の均質層として神経板から出てきます。発生プログラムは、神経板の地域化の際に、誘導された符号化され、確立されている方法を理解することは、現時点では、発生生物学の主要な目標です。他のシステムと比較して、実験的に影響を受けやすいアフリカツメガエル胚は神経発達1,2の初期段階を分析するための選択のモデルです。これは、胚を大量に得ることが容易であり、外部の開発は神経胚形成3の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にアフリカツメガエル （ アフリカツメガエル）胚発生を操作するために利用可能です。一緒に生化学的および薬理学的ツールで誘導MOを含めたmRNAまたはモルフォリノ（MO）のマイクロインジェクション、関数（GOF）および機能喪失（LOF）および経路4,5シグナリングの特定の改変の制御ゲインができます。 BLA胞胚の動物極の周りに配置stocoel屋根外胚葉、または非常に初期原腸胚、および「アニマルキャップ」（AC）とも呼ばれる前に遺伝子発現を操作することによってプログラムすることができる多能性細胞の供給源であります準備を外植片。この原稿ではXを使用するための詳細なプロトコルは、 ツメガエル交流植片は、in vitroおよびin vivo分子機構および細胞プロセス基盤となる神経の発達にテストします。 技術は、 アフリカツメガエルのオタマジャクシの神経管における遺伝子発現パターンの微細な観察 ​​を可能にする、運命の決意キューの同定における予備段階を提示しています。フラットマウント組織の観察は、一般にニワトリ胚6の研究で使用されるが、それは適切にアフリカツメガエルに記載されていません。 2または4細胞期胚の割球に合成mRNAまたはMOを注入することにより、遺伝子発現の操作は、ACのプログラミングを可能にします外植4。抗BMP要因ノギンの発現による骨形成タンパク質（BMP）経路の例を阻害するために、AC細胞3に神経アイデンティティを与えます。プロトコルは、陰イオン交換樹脂ビーズとの直接接触を介して、外因性の合図にAC外植片の局所及び露光時間制御を行うために詳述されています。最後に、技術は、解離および再会合プログラムの異なる細胞から調製した混合植片の移植により、インビボで神経前駆細胞の発達の機能をテストするために記載されています。 カエルの胚は、初期の脊椎動物の神経発達を研究するための強力なモデルです。 体外培養で外植片に遺伝子発現の操作を組み合わせることにより、神経上皮の地域化、増殖、および形態形成7-12の研究に重要な情報を提供しています。交流外植片のプログラミングは 、ex vivo 13,14の機能の心臓の開発を可能にしました。使用15を移植植片の神経堤分化プログラム16を誘導する最小の転写スイッチの同定につながりました。 透明帯境界のintrathalamica（ZLI）は尾側前脳の成長と地域化を制御するために、ソニックヘッジホッグ（Shhのを）分泌シグナルセンターです。連続のShhにさらされると、3転写因子の遺伝子を共発現神経上皮細胞- BARH様ホメオボックス2（barhl2）、orthodenticle-2（OTX2）とイロコイ-3（irx3 は） - ZLI室の二つの特徴を取得する：能力へSHH発現し、前方神経板の細胞から分離する能力。モデル系として、神経上皮細胞へのZLIの運命の誘導は8に提示されます。 これらのプロトコルは、基本的なMECを探索するために発達生物学者や他の研究者のための単純な、安く、効率的なツールを提供することを目指してキー神経細胞の挙動のhanisms。これらのプロトコルは、非常に汎用性であり、外因性および内因性神経決意合図の大規模な範囲の調査を可能にします。これは、神経系統のコミットメント、誘導性相互作用および細胞行動の生体分析に長期を可能にします。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>VWR</td><td>&nbsp;20909.290</td><td>有毒な</td></tr><tr><td>陰イオン交換樹脂ビーズ</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>動物キャップの培養用pH 7.6</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp;ビーズ調製用</td></tr></tbody></table>

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

神経発生の根底にある遺伝的プログラムを理解することは、発生および幹細胞生物学の重要な目標です。両生類の胞胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性です。これらの細胞は単離することができ、遺伝子発現の操作やモルフォゲンによる誘導を通じてさまざまな組織を生成するようにプログラムできます。この原稿では、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin vitroの特徴を調査するためのアッセイシステムとして、Xenopus laevis blastocoel roof外植片の使用に関するプロトコルについて説明します。これらのプロトコルにより、運命獲得、細胞移動挙動、細胞の自律的および非自律的な特性を調査することができます。胚盤胞の屋根の外植片は、無血清の定義された培地で培養し、宿主胚に移植することができます。この胚への移植により、移植された細胞の長期的な系統コミットメント、誘導特性、およびin vivoでの挙動を調べることができます。これらのアッセイは、神経発生の根底にある分子メカニズム、細胞プロセス、および遺伝子制御ネットワークを調査するために利用できます。再生医療の文脈では、これらのアッセイは、薬物スクリーニングに使用できる神経由来の細胞タイプをin vitroで生成する手段を提供します。

異なる種、発生学的操作、および調節遺伝子の発現パターンの形態学的考察に基づいて、概念モデルは、神経板が別個の組織原のフィールドを生成発達グリッドを定義し、横方向と縦方向のセグメントに分割されていることを保持しています。神経板では、前脳、中脳、後脳と脊髄の原基はすべて、すでに（23-25 ​​で検討）原腸陥入時に前後（AP）軸に沿って確立されています。神経胚形成の間に、組織原のフィールドは、遺伝子発現の空間的に制限された領域として検出することができます。調節遺伝子の発現パターンに基づいて、前脳の原基はprosomeres（P）と呼ばれる別個の組織原のフィールドを生成し6の横方向のセグメントに分割されます。各prosomereは腹側（基礎）及び（26,27に投稿）背側（鼻翼）の部分に分割されています。両生類では、prosomere 2（P2）は、視床上部と視床へとそのオーガナイザー（28,29に概説されている）、Z ONA L imitans</em...

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin vitroの特徴を調査します。

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

このプロトコルの目的は、x laevisの胞胚腔屋根（blastocoel roof）または動物極キャップ（animal cap）の外植え組織を用いて、in vitroおよびin vivoにおける神経発達の根底にある分子メカニズムと細胞プロセスを検証することです。これらの手法は、運命決定、細胞移動、および神経細胞の細胞自律的および非自律的な特性に関する、発生生物学および幹細胞生物学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。提示された技術は、主要な神経細胞の挙動の基本的メカニズムを探索するための、簡便かつ安価で、汎用性の高い効率的なツールを提供します。これらのアッセイにより、誘導多能性幹細胞（iPSC）のリプログラミングにおける神経運命決定因子の試験、および神経由来細胞の成熟化に関するさらなるスクリーニングが可能になります。一般的に、この手法に不慣れな方は、手先の器用さが要求されるため苦労すると思われます。私がこれらの手法を考案したのは、細胞の分離挙動の解析について検討していた時でした。アフリカツメガエル（xenopus laevis）の前方神経管をフラットマウントするには、プラスチック製転送ピペットを使用して、固定、脱水、および再水和させた胚を、PBTを満たした60 mmのペトリ皿に移します。次に、視索の高さで眼と神経管の間に精密ピンセットを挿入し、眼を取り除きます。その後、頭部の後方にある神経管上の外胚葉の下に慎重にピンセットを差し込み、外胚葉を丁寧に剥離します。適切なNC2ハイブリダイゼーション標識を行った後、胚をPBTを満たした新しい60 milliliterペトリ皿に移し、精細ピンセットを用いて、胚から前脳神経管を大まかに単離します。次に、神経管の下にある緩く付着した脊索を慎重に除去します。必要に応じて、耳胞および中胚葉の残存部分も除去してください。神経管の付属器官をすべて切断した後、前方の神経管を胚から分離します。次に、単離した神経管を50% glycerolとPBSを満たした1.5 milliliterコニカルチューブに移し、4 °Cで一晩処理します。さらに90% glycerolで二回目のオーバーナイト処理を行った後、神経管を少量のglycerolとともに顕微鏡スライドガラス上に移し、タングステン針を用いて神経管の背側および腹側正中線に沿って解剖します。次に、ガラスカバースリップで覆った補強リングを用いて、神経管の両側を90% glycerolおよびPBS中でマウントします。動物C-cap外植片の誘導用ビーズを準備するために、P200マイクロピペットを使用して、BSA処理済みレジンビーズの分注量の半分を新しい1.5 milliliterチューブに移します。その後、新しいチューブ内の滅菌蒸留水を、目的の実験分子を含む200 microlitersの培地に置き換え、4 °Cで2時間静置します。インキュベーションの終了後、胚盤胞またはごく初期の原腸陥入期の胚を、0.2% BSAを添加したカルシウムおよびマグネシウム含有PBSに移します。次に、実体顕微鏡下で、片方のピンセットの側面で卵黄膜をつまみ、もう一方のピンセットを用いて、動物極側に損傷を与えないよう注意しながら、胚の植物極側からゆっくりと膜を剥がします。その後、精巧なピンセットを使用して、各胚の動物極から小さな正方形の組織を切り出します。BSAコーティングされたピペットチップを用いて、キャップを0.5X modified Barth's salineが入ったTerasakiマルチウェルプレートの各ウェルに転送し、色素を持つ動物側がウェルの丸底に接するように配置します。P20マイクロピペットを用いて、処理済みチューブから最も濃いピンク色のビーズを選択し、各キャップの上にビーズを1つずつ配置します。その際、ピンセットを使用してビーズをキャップの中央に合わせます。最後のビーズを配置したら、プレートを水に浸したペーパーの上に置き、インキュベーション前にプラスチック容器でプレートを覆います。解離および再凝集させた動物極外植片を調製するには、先ほど示した方法で動物極を15〜30個分離します。微小ピンセットを使用して、動物極から小さな正方形の組織を切り出します。その後、動物極を色素沈着側が上になるようにして、カルシウムフリーのHoltfreter生理食塩水を満たしたアガロースコーティング済みのウェルに転移させます。数分後、組織の解離が観察されます。精細鑷子を用いて、色素層を組織の残りの部分から分離します。その後、P20マイクロピペットを用いて色素を除去します。色素層の大部分が除去され、細胞が完全に分散したら、プレートを旋回させて細胞を中央に集め、P1000マイクロピペットを用いて、細胞に触れないように注意しながら、培地をできるだけ多く除去します。次に、ウェルにカルシウム含有Holtfreter生理食塩水を1 mL加えます。分散させた動物キャップを1.5 mLチューブに移します。細胞を遠心分離した後、P1000マイクロピペットを使用して上清を慎重に取り除き、ペレットをカルシウム含有Holtfreter's saline 20 µLで再懸濁します。室温で3〜6時間、細胞を再凝集させます。その後、3/4 NAMを1 mLゆっくりと加え、チューブの底から外植え組織を慎重に切り離し、プラスチック製移送ピペットを用いて、個別の非コーティングプレートに外植え組織を分配します。動物キャップ外植片をアフリカツメガエル（xenopus laevis）の神経板上に移植するには、まず60mmペトリ皿に3%アガロースをコーティングし、小さな穴を開けた3/4 NAMを満たします。次に、卵黄膜を除去するため、初期神経胚をカルシウムおよびマグネシウム含有PBSに0.2%BSAを添加した溶液に移します。その後、アガロースコーティングした解剖皿に新鮮な3/4 NAMを満たし、胚を背面が上になるように解剖皿へ移します。次に、再凝集させた動物極キャップ外植え物を解剖プレートに移し、ピペットチップがNAM表面を突破した後、外植え物が重力によってゆっくりと皿の中に沈むようにします。その後、実体顕微鏡下で、丸いピンセットで胚を固定しながら、タングステン針を用いて神経板に外植え物用の切開を入れます。丸いピンセットとアイブロウナイフを使用して、再凝集させた動物極キャップ外植え物を少量切り出します。組織断片を使用して、移植用の外植え片のサイズを決定します。この図は、ホールマウント二重NC2ハイブリダイゼーション後、ステージ30、32、および35におけるX laevisおよびX tropicalisの前脳神経管を、先ほど示した方法でフラットマウントしたものです。これらの画像で観察されるように、sonic hedgehog遺伝子のC末端を添加した調整培地を浸透させたビーズに接している細胞ではxenopus sonic hedgehogの発現が検出されますが、コントロール培地で処理したビーズに接している細胞では検出されません。先ほど実演したように、解離および再凝集を行った後、前方化された動物極キャップ細胞を含むこれらの外植片を、Otx2を発現している前方化された動物極キャップ細胞と混合しました。観察された通り、これらのOtx2発現細胞は、非Otx2発現細胞から分離することはありませんでした。両方のタイプの細胞は、外植片全体にわたって自由に混ざり合いました。対照的に、Otx2発現細胞をBAR HL-2、Otx2およびIRX3発現細胞と混合した外植片では、マルチ遺伝子発現細胞が凝集したパッチを形成し、再凝集した外植片内で均一に分散しませんでした。前述のようにこれらをx laevis胚の前方神経板に移植したところ、BAR HL-2、Otx2、およびIRX3を共発現する細胞とN末端sonic hedgehog発現細胞からなる混合外植片は、内因性のsonic hedgehog発現を示し、前方神経上皮細胞から分離しました。一方、Otx2およびN末端sonic hedgehog発現細胞からなる混合外植片をx laevis神経板に移植した場合、移植細胞はsonic hedgehogを発現せず、隣接細胞からも分離しませんでした。一度習得すれば、動物極外植片の胚神経板への移植は、移植する胚の数に応じて2〜3時間で完了させることができます。これは非常に堅牢で、得られる結果も非常に充実した手法です。この操作を行う際は、細菌や真菌による汚染に細心の注意を払うことが重要です。移植処置の後、移植細胞の運命や挙動を追跡するために、ホールマウントin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することができます。神経管の器官形成の根底にある発生プログラムは、特に脊椎動物において高度に保存されています。したがって、両生類で得られた知見は、脊椎動物の発生を支える細胞および分子レベルのプロセスの理解を深めることに寄与してきました。

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Research

JoVE Journal

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幹細胞様

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