幹細胞様

このプロトコルの目的は、x laevisの胞胚腔屋根（blastocoel roof）または動物極キャップ（animal cap）の外植え組織を用いて、in vitroおよびin vivoにおける神経発達の根底にある分子メカニズムと細胞プロセスを検証することです。これらの手法は、運命決定、細胞移動、および神経細胞の細胞自律的および非自律的な特性に関する、発生生物学および幹細胞生物学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。提示された技術は、主要な神経細胞の挙動の基本的メカニズムを探索するための、簡便かつ安価で、汎用性の高い効率的なツールを提供します。

これらのアッセイにより、誘導多能性幹細胞（iPSC）のリプログラミングにおける神経運命決定因子の試験、および神経由来細胞の成熟化に関するさらなるスクリーニングが可能になります。一般的に、この手法に不慣れな方は、手先の器用さが要求されるため苦労すると思われます。私がこれらの手法を考案したのは、細胞の分離挙動の解析について検討していた時でした。

アフリカツメガエル（xenopus laevis）の前方神経管をフラットマウントするには、プラスチック製転送ピペットを使用して、固定、脱水、および再水和させた胚を、PBTを満たした60 mmのペトリ皿に移します。次に、視索の高さで眼と神経管の間に精密ピンセットを挿入し、眼を取り除きます。その後、頭部の後方にある神経管上の外胚葉の下に慎重にピンセットを差し込み、外胚葉を丁寧に剥離します。

適切なNC2ハイブリダイゼーション標識を行った後、胚をPBTを満たした新しい60 milliliterペトリ皿に移し、精細ピンセットを用いて、胚から前脳神経管を大まかに単離します。次に、神経管の下にある緩く付着した脊索を慎重に除去します。必要に応じて、耳胞および中胚葉の残存部分も除去してください。

神経管の付属器官をすべて切断した後、前方の神経管を胚から分離します。次に、単離した神経管を50% glycerolとPBSを満たした1.5 milliliterコニカルチューブに移し、4 °Cで一晩処理します。さらに90% glycerolで二回目のオーバーナイト処理を行った後、神経管を少量のglycerolとともに顕微鏡スライドガラス上に移し、タングステン針を用いて神経管の背側および腹側正中線に沿って解剖します。

次に、ガラスカバースリップで覆った補強リングを用いて、神経管の両側を90% glycerolおよびPBS中でマウントします。動物C-cap外植片の誘導用ビーズを準備するために、P200マイクロピペットを使用して、BSA処理済みレジンビーズの分注量の半分を新しい1.5 milliliterチューブに移します。その後、新しいチューブ内の滅菌蒸留水を、目的の実験分子を含む200 microlitersの培地に置き換え、4 °Cで2時間静置します。

インキュベーションの終了後、胚盤胞またはごく初期の原腸陥入期の胚を、0.2% BSAを添加したカルシウムおよびマグネシウム含有PBSに移します。次に、実体顕微鏡下で、片方のピンセットの側面で卵黄膜をつまみ、もう一方のピンセットを用いて、動物極側に損傷を与えないよう注意しながら、胚の植物極側からゆっくりと膜を剥がします。その後、精巧なピンセットを使用して、各胚の動物極から小さな正方形の組織を切り出します。

BSAコーティングされたピペットチップを用いて、キャップを0.5X modified Barth's salineが入ったTerasakiマルチウェルプレートの各ウェルに転送し、色素を持つ動物側がウェルの丸底に接するように配置します。P20マイクロピペットを用いて、処理済みチューブから最も濃いピンク色のビーズを選択し、各キャップの上にビーズを1つずつ配置します。その際、ピンセットを使用してビーズをキャップの中央に合わせます。最後のビーズを配置したら、プレートを水に浸したペーパーの上に置き、インキュベーション前にプラスチック容器でプレートを覆います。

解離および再凝集させた動物極外植片を調製するには、先ほど示した方法で動物極を15〜30個分離します。微小ピンセットを使用して、動物極から小さな正方形の組織を切り出します。その後、動物極を色素沈着側が上になるようにして、カルシウムフリーのHoltfreter生理食塩水を満たしたアガロースコーティング済みのウェルに転移させます。

数分後、組織の解離が観察されます。精細鑷子を用いて、色素層を組織の残りの部分から分離します。その後、P20マイクロピペットを用いて色素を除去します。

色素層の大部分が除去され、細胞が完全に分散したら、プレートを旋回させて細胞を中央に集め、P1000マイクロピペットを用いて、細胞に触れないように注意しながら、培地をできるだけ多く除去します。次に、ウェルにカルシウム含有Holtfreter生理食塩水を1 mL加えます。分散させた動物キャップを1.5 mLチューブに移します。

細胞を遠心分離した後、P1000マイクロピペットを使用して上清を慎重に取り除き、ペレットをカルシウム含有Holtfreter's saline 20 µLで再懸濁します。室温で3〜6時間、細胞を再凝集させます。その後、3/4 NAMを1 mLゆっくりと加え、チューブの底から外植え組織を慎重に切り離し、プラスチック製移送ピペットを用いて、個別の非コーティングプレートに外植え組織を分配します。

動物キャップ外植片をアフリカツメガエル（xenopus laevis）の神経板上に移植するには、まず60mmペトリ皿に3%アガロースをコーティングし、小さな穴を開けた3/4 NAMを満たします。次に、卵黄膜を除去するため、初期神経胚をカルシウムおよびマグネシウム含有PBSに0.2%BSAを添加した溶液に移します。その後、アガロースコーティングした解剖皿に新鮮な3/4 NAMを満たし、胚を背面が上になるように解剖皿へ移します。

次に、再凝集させた動物極キャップ外植え物を解剖プレートに移し、ピペットチップがNAM表面を突破した後、外植え物が重力によってゆっくりと皿の中に沈むようにします。その後、実体顕微鏡下で、丸いピンセットで胚を固定しながら、タングステン針を用いて神経板に外植え物用の切開を入れます。丸いピンセットとアイブロウナイフを使用して、再凝集させた動物極キャップ外植え物を少量切り出します。

組織断片を使用して、移植用の外植え片のサイズを決定します。この図は、ホールマウント二重NC2ハイブリダイゼーション後、ステージ30、32、および35におけるX laevisおよびX tropicalisの前脳神経管を、先ほど示した方法でフラットマウントしたものです。これらの画像で観察されるように、sonic hedgehog遺伝子のC末端を添加した調整培地を浸透させたビーズに接している細胞ではxenopus sonic hedgehogの発現が検出されますが、コントロール培地で処理したビーズに接している細胞では検出されません。

先ほど実演したように、解離および再凝集を行った後、前方化された動物極キャップ細胞を含むこれらの外植片を、Otx2を発現している前方化された動物極キャップ細胞と混合しました。観察された通り、これらのOtx2発現細胞は、非Otx2発現細胞から分離することはありませんでした。両方のタイプの細胞は、外植片全体にわたって自由に混ざり合いました。

対照的に、Otx2発現細胞をBAR HL-2、Otx2およびIRX3発現細胞と混合した外植片では、マルチ遺伝子発現細胞が凝集したパッチを形成し、再凝集した外植片内で均一に分散しませんでした。前述のようにこれらをx laevis胚の前方神経板に移植したところ、BAR HL-2、Otx2、およびIRX3を共発現する細胞とN末端sonic hedgehog発現細胞からなる混合外植片は、内因性のsonic hedgehog発現を示し、前方神経上皮細胞から分離しました。一方、Otx2およびN末端sonic hedgehog発現細胞からなる混合外植片をx laevis神経板に移植した場合、移植細胞はsonic hedgehogを発現せず、隣接細胞からも分離しませんでした。

一度習得すれば、動物極外植片の胚神経板への移植は、移植する胚の数に応じて2〜3時間で完了させることができます。これは非常に堅牢で、得られる結果も非常に充実した手法です。この操作を行う際は、細菌や真菌による汚染に細心の注意を払うことが重要です。

移植処置の後、移植細胞の運命や挙動を追跡するために、ホールマウントin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することができます。神経管の器官形成の根底にある発生プログラムは、特に脊椎動物において高度に保存されています。したがって、両生類で得られた知見は、脊椎動物の発生を支える細胞および分子レベルのプロセスの理解を深めることに寄与してきました。