マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築
2016年1月11日
私たちは、マイクロパターン化されたハイドロゲルシートの簡単なプロセスでの製造について説明しています。これは、自立した形で組み立てて操作することができます。これらのモジュール式ハイドロゲルシートを使用すると、制御された細胞微小環境でシンプルなマクロスケールの3D細胞培養システムを生成できます。
この手順の全体的な目標は、3D細胞培養システム用のモジュール式ヒドロゲルシートの簡単な製造、操作、および組み立てを実証することです。この方法は、培養された微小環境でin vivoのような機能改変組織をより作製する方法など、組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞性ハイドロゲルコンストラクトをコストのかかる増加なしに生成できることです。
3D細胞培養条件は、各モジュール式ハイドロゲルシートによって異なります。この手法は、3D細胞のミクロおよびマクロ環境のさまざまな形状と組成を提供できるため、この手法の影響は、細胞ベースのアッセイや生物学的研究の改善にまで及びます。この方法は、in vitro細胞ベースのアッセイに関する洞察を提供しますが、3D組織モデルの移植可能な足場などの別のシステムにも適用できます。
まず、標準的なフォトリソグラフィー技術を使用して、目的のマイクロスケールパターンを作成します。このビデオで示されている例では、ここに示すような肝小葉のようなメッシュパターンを使用します。次に、2.5グラムのPDMSと2.5グラムの硬化剤溶液を計量し、成分を完全に混合します。
真空チャンバー内で溶液を脱気し、混合溶液を箔鋳造皿内のシリコンウェーハのマイクロパターン表面に均一に広げます。次に、摂氏65度の加熱プレートの平らな面に皿を90分間置いて、PDMSを硬化させます。硬化したら、PDMSをキャスティングディッシュから取り出し、シリコンウェーハから慎重に剥がします。
PDMSの端を切り取り、パターン化された部分を直径100mmのシャーレに置き、マイクロパターンの面を上に向けます。次に、マイクロパターン化されたPDMSを70%エタノールで洗浄し、続いて蒸留水で洗浄して一次滅菌します。その後、セットアップを摂氏65度のオーブンで10分間完全に乾かします。
次に、マイクロパターン化されたPDMSモールドをプラズマクリーナーに入れ、1分間洗浄して親水性の表面を作成します。これにより、水性液体の装填が容易になります。次に、PDMSの表面を、材料表に記載されている界面活性剤溶液100ミリリットルでコーティングします。
サンプルを実験室のロッカーで少なくとも3時間インキュベートします。次に、PDMS型に付着した界面活性剤溶液を滅菌水で洗い流し、65°Cのオーブンで10分間完全に乾燥させます。次に、マイクロパターン化された各型を紫外線に30分間さらして滅菌します。
まず、標準的な技術を用いてhepg2細胞を培養します。細胞が70%から80%コンフルエントになったら、PBSを使用して細胞を一度洗浄します。次に、1ミリリットルの05%tripsin edtaを加え、摂氏37度で4分間インキュベートして細胞を収穫します。
分離したら、細胞を遠心チューブに集め、250 gで3分間ペレット化します。上清を取り除き、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。自動セルカウンターを使用して、PBS内の単一の分布セルの数をカウントします。
次に、細胞を再び250 gで3分間ペレット化します。PBS上清を取り除き、1パーセントのアルギン酸ナトリウム溶液を細胞に十分に追加して、最終的な播種密度がミリレータあたり500万から1,000万個の細胞になるようにします。ピペットを使用して細胞溶液を穏やかに混合し、細胞ヒドロゲル懸濁液を摂氏37度の5%CO2加湿インキュベーターでインキュベー
トします。細胞がインキュベートしている間に、マイクロパターン化されたPDMSモールドをプラズマクリーナーに入れ、85ワットで1分間洗浄して親水性の表面を作ります。細胞ハイドロゲル懸濁液を静かにピペッティングして混合し、次いで7.2マイクロリットルの懸濁液を金型内のマイクロパターンの端に着実にロードします。次いで、架橋試薬のミストを加湿器で毎時250ミリリットルの割合で生成し、それをヒドロゲル前駆体に5分間噴霧することにより、細胞ハイドロゲル懸濁液をゲル化する。
この手順がPDMS金型のトポグラフィー面を5センチメートルの範囲で覆うことを確認します。架橋プロセスに従って、加湿器の電源を切り、PDMS型にPBSを充填します。200マイクロリットルのピペットを使用して、硬化したハイドロゲルシートの端にPBSを穏やかに分注し、各ハイドロゲルを取り外してください。
次に、エンドカットの1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、各フローティングヒドロゲルシートをピックアップします。ハイドロゲルの各シートを、1ミリリットルの予熱済みDMEMを含む12ウェルプレートの個々のウェルに移し、培地の表面に浮かべます。このように細胞を1週間培養し、1日おきに培地を交換します。
次に、付属のテキストプロトコルで説明されているように、下面に高さ170ミクロンのピラー構造を含むPDMSフレームを作成します。製作時には、PDMSフレーム用のシリコンウェーハに専用のポリカーボネートモールドを装着し、幅8mm、高さ9mm、奥行き2mmの内部フレームを作成します。滅菌したら、PDMSフレームを60mmのペトリ皿にセットされたナイロン濾紙の4分の1に置きます。
インキュベーターからヒドロゲルシートを取り外し、エンドカットの1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、モジュラーヒドロゲルシートの最初のシートをPDMSフレームの内部に移します。空の200マイクロリットルピペットチップを使用して、モジュラーヒドロゲルシートの端をPDMSフレームに合わせます。4〜6層のスタックが達成されるまで、追加のヒドロゲルシートでこのプロセスを繰り返します。
次に、PDMSフレームの下部にある柱構造に培養液を流して、培地を取り出します。次に、多層構造の1つのコーナーに2マイクロリットルの2パーセントアルギン酸溶液を追加します。加湿器を使用して、架橋試薬のミストを毎時250ミリリットルの速度で多層構造に30秒間噴霧し、各層の端を一緒に取り付けます。
次に、多層構造を400マイクロリットルのDMEMでやさしくすすぎ、ピンセットを使用してPDMSフレームを取り外します。次に、さらに4ミリリットルのDMEMを追加します。多層構造の構造体をセルリフターでやさしく拭くことにより、濾紙で剥離し、濾紙を使用して3ミリリットルのDMEMを含む6ウェルプレートに移します。
細胞をハイドロゲルコンストラクトをマルチスケール細胞足場として、6ウェルプレート内で少なくとも1週間浮遊的に培養します。培地は一日おきに交換してください。ここには、緑色に蛍光を発するヒト肝がん細胞と赤色に蛍光を発するNIH-3T3線維芽細胞を、結合メッシュ上で共培養して増殖させた、肝小葉様のマイクロパターン化ヒドロゲルシートを層ごとに組み立てた結果が示されています。
ここで紹介する手法を使用すると、六角形の柱、細いメッシュ、全体の配列、および100〜200マイクロメートルのオーダーの薄いヒドロゲル構造を形成する複数のマイクロコーム状のマイクロファイバーなど、多くのパターンバリエーションを作成できます。これらの構造は、多くの異なる細胞タイプに豊かな3D培養環境を提供します。このビデオを見れば、in vivoのような3D培養システムをエンジニアリングするための細胞性ハイドロゲルシートをボトムアップで作成する方法について十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、操作および組み立てによって3D細胞培養システムを構築できる、モジュール式ハイドロゲルシートの作製方法について説明します。この技術により、制御された細胞微小環境の構築が可能となり、組織工学の進展が促進されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織工学
- 細胞培養
- ハイドロゲル技術
背景
- ハイドロゲルシートはin vivoの条件を模倣できる。
- 3D細胞培養システムは生物学的研究に不可欠である。
- モジュール設計により、細胞環境のカスタマイズが可能になる。
- 組織工学において、費用対効果の高い手法が求められている。
研究目的
- ハイドロゲルシートの作製方法を実演すること。
- 機能的な工学組織の構築におけるハイドロゲルシートの応用について検討すること。
- 細胞ベースのアッセイおよび生物学的研究を向上させること。
使用した手法
- マイクロパターン化されたハイドロゲルシートの作製。
- ハイドロゲル構造体の構築および操作。
- マクロスケールの3D細胞培養システムの構築。
- 特定の細胞微小環境に合わせたハイドロゲルシートのカスタマイズ。
主な結果
- モジュール式ハイドロゲルシートの作製に成功した。
- 多様な3D細胞環境を構築できる能力を実証した。
- 生物学的アッセイの改善における応用の可能性。
- in vitro 細胞ベースのアッセイおよび移植可能なスキャフォールドに関する知見。
結論
- 本手法は、組織工学に対する費用対効果の高いアプローチを提供します。
- モジュール式ハイドロゲルシートにより、細胞挙動の研究を促進できます。
- この技術は、工学的に作製された組織の機能性の向上につながる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
モジュール式ハイドロゲルシートの作製により、3D培養システムにおける細胞微小環境の精密な制御が可能となり、薬剤スクリーニングやメカニズム研究において、より生理学的に妥当なモデルの構築が支援されます。このアプローチは、組織レベルの機能評価のための、スケーラブルで再現性の高いin vitroプラットフォームを提供することで、動物実験への依存を低減します。また、組織構造が細胞挙動に及ぼす影響を系統的に解析できるため、初期探索段階における予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：制御された微小環境において、組織レベルの幾何学的構造が細胞機能やパスウェイ活性にどのように影響するかを解析することを可能にする。
- 運用の価値：in vivoの条件をより適切に反映した複雑な3Dコンテクスト内で、ターゲットを検証するための再現可能なシステムを提供する。
- 予測的価値：疾患関連モデルにおける微視的および巨視的な構造的特徴を表現型のアウトカムに結びつけることで、メカニズムに基づくリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 厚さが一定（100–200 µm）で標準化されたマイクロパターン化ハイドロゲルシートを作製し、3Dにおける信頼性の高い化合物スクリーニングを可能にする。
- 運用的価値： PDMSフレームを用いたモジュール式アセンブリによりアッセイの準備を効率化し、ハイスループット・コンテンツスクリーニングに向けた拡張可能な多層構造体の構築を可能にする。
- トランスレーショナル価値： 肝小葉様構造における表現型スクリーニングを支援し、肝毒性および代謝性疾患モデルにおける関連性を向上させる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 異種細胞（例：肝細胞と線維芽細胞）を空間的に定義された3D配置で共培養することを可能にし、細胞間シグナリングの研究を実現します。
- 運用的価値： ハイドロゲル構造体を剥離してマルチウェルプレートへ移して縦断的な培養や培地交換を行うことができるため、前臨床試験に近いワークフローをサポートします。
- 予測的価値： ヒトに関連するシステムにおいて組織レベルの構成と機能をモデル化することで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットバリデーションからリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、3D微小環境の制御によって細胞表現型のトランスレータビリティ（臨床への変換可能性）が向上します。
- 探索生物学：組織構造が構築された微小環境における薬物反応や細胞表現型をどのように調節するかという仮説検証を支援します。
- スクリーニング：標準化されたハイドロゲルシートの作製と組み立てにより、3D培養における再現性のある定量的なリードアウトを可能にします。
- 分析：層特異的な細胞分布や蛍光シグナルなどの測定可能な出力を生成し、条件間の比較分析に利用します。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒトの病態生理に関連する組織スケールの組織化をモデル化することで、探索研究から前臨床研究への継続性を促進します。
- エンタープライズ再利用：ハイドロゲルシートプラットフォームを、複数のプロジェクトや細胞種にわたって再利用・適応可能なシステムとして位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：組織コンテキストが薬物反応に及ぼす影響をメカニズム的にリスク軽減することで、ターゲットバリデーションを強化する。
- 運用的価値：マイクロパターンシートとミストベースの架橋を用いることで、均一な厚さと形状を確保し、標準化と再現性を保証する。
- 戦略的価値：より予測精度の高い3Dモデルを通じて生物学的な偽陽性を減少させ、go/no-go判断の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：複雑な組織様微小環境におけるパフォーマンスに基づいた、リスク調整済みのリード化合物の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- フォトリソグラフィ、PDMSモールド成形、およびハイドロゲル架橋技術の専門知識が必要です。
- プラズマクリーナー、加湿器、およびミストベースのゲル化のための精密液体ハンドリングへのアクセスに依存します。
- 再現性を確保するため、ハイドロゲルの組成、パターニング、およびアセンブリプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 本システムを非肝細胞系や代替的なマイクロパターンに拡張する際は、適応に関する検討が必要です。
- 構造的な損傷を防ぐため、シートの操作およびアセンブリの際に慎重な取り扱いが求められる点に制限があります。
