Name: マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶモジュラーヒドロゲルシートの作製と組み立てによるマイクロパターンマクロスケール3D細胞構造の構築法。組織工学においてコスト効率よく機能的な組織を作成し、細胞ベースアッセイと生物学的研究を向上させる革新的アプローチです。

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この研究は、科学・ICT・未来計画省の資金提供を受けた韓国国立研究財団を通じた国立リーディング研究所プログラム（助成金NRF-2013R1A2A1A05006378)の支援を受けました。著者はまた、KAISTシステムヘルスケアプログラムを認めています。

マイクロパターン金型及びヒドロゲルの作製<ol><li> PDMSモールドを鋳造するための標準的な2段階のフォトリソグラフィ技術15,17を介して、シリコンウェハの表面上のSU-8フォトレジストを用いて所望のマイクロスケールのパターンを生成します。示された例は、肝小葉様メッシュパターン（ 図1）を使用します 。 </li><li> 1の比でPDMSと硬化剤溶液を秤量：5（ すなわち 、PDMS 12.5gのと硬化剤2.5 g）を得ました。 </li><li>完全に溶液の15グラムを混合し、真空チャンバ内に気泡を脱ガスし、次に均一にフォイル鋳造皿内のシリコンウェーハのマイクロパターン化表面上に混合溶液を広げます。 </li><li> PDMSを硬化させるために、平らな面に90分間65℃で加熱したプレート上にシリコンウェーハを配置します。 </li><li>鋳造皿やシリコンウエハから硬化PDMSを削除します。 </li><li> PDMSの端をカットし、100 mmの直径のペトリ皿の上に置きますマイクロパターンサイドアップ。 </li><li>主な滅菌のために70％エタノールと蒸留水を用いてシャーレに微細化硬化PDMSを洗ってください。その後、65℃のオーブンで10分間完全に乾燥します。 </li><li>コー​​ティング溶液（w / v）の3％を作成し、蒸留水100ml中で粉末化非イオン性界面活性剤のO / N 3グラムを溶解し、混合します。 </li><li>プラズマクリーナーにマイクロパターンPDMS金型を置き、1分（85 W、0.73ミリバール）水性液体の追加を容易にするために、親水性表面を作成するためにそれらをきれいにします。その後、実験室コートロッカーを使用して、少なくとも3時間（ORO / N）を100 mlの界面活性剤溶液とPDMSの表面。 </li><li> PDMS型から界面活性剤溶液を洗浄し、10分間65℃のオーブンで完全に乾燥させます。その後、30分かけて紫外線（UV）放射線に曝露することによって、各微細金型を滅菌します。 </li></ol> 2.ヒドロゲル前駆体中の細胞懸濁液を準備<ol><li>に1％（w / v）のアルギン酸塩前駆体を生成する、ヒドロゲル前駆体を調製リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10ml中のアルギン酸ナトリウム粉末を0.1gを溶解します。完全に粉末を溶解するために、O / Nそれらをインキュベートし、混合します。 </li><li> 1ml注射器に接続された0.22μmのフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 </li><li>培養10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン、従来の組織培養皿で70％までを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHepG2細胞- 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で80％コンフルエンス。 </li><li>一度PBSを用いて細胞を洗浄し、次いで37℃で5％CO 2加湿インキュベーター中で4分間、0.05％トリプシン-EDTAを1ml添加することによって、それらをトリプシン処理。遠心上清を除去した後、1mlのPBSを用いて3分間再懸濁し、250×gで培養皿から細胞を採取しました。 </li><li>自動化された細胞を用いてPBS中で単分散細胞の数を数えますカウンタ。 </li><li> 3分およびPBSを除去するために250×gで遠心分離した後、（w / v）の1％の1 mLを加え、残りの細胞ペレットのアルギン酸ナトリウム溶液を、穏やかにピペッティングを使用して混合します。 10 7細胞/ ml -細胞の最終播種密度は5×10 6でなければなりません。 37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター中で、細胞/ヒドロゲルサスペンションをインキュベートします。 </li></ol> 3.ロードとセル/ハイドロサスペンションの架橋<ol><li>塩化カルシウム1.47 gを架橋試薬を生成するためのddH 2 O 100ml中に溶解する脱水（ すなわち 、100ミリモルのCaCl 2・2H 2 O中のddH 2 O）。 </li><li> 70％エタノールを用いた超音波トランスデューサと加湿器の内部をすすぎ、および架橋試薬200mlでそれを埋めます。加湿器は、110ミリメートル幅の広い300ミリメートル、長さ170ミリメートルの深さ（ すなわち 、110ミリメートル×300ミリメートル×170ミリメートル（幅×高さ×奥行））。 </li><li>マイクロパターンPDMSを配置プラズマクリーナーで金型や親水性表面を作成するために、85 Wで1分間のためにそれらをきれいにします。 </li><li>着実に金型内の微細パターンのエッジでよく混合細胞/ヒドロゲル懸濁液の7.2μLをロードします。示された例は、肝小葉様メッシュパターン（ 図1）を使用します 。懸濁液の容量は、地形のパターンに依存します。 </li><li>細胞/ヒドロゲル懸濁液のゲル化を達成するためには、加湿器をオンにし、加湿器は、架橋試薬のミストを生成することを確認します。 5cmの範囲内のPDMSモールドの地形表面を覆う、5分間のヒドロゲル前駆体上に架橋試薬を噴霧。 距離より長く、より短い5センチメートルはそれぞれ、不完全で、不均一なゲル化が生じる可能性があります。注意して​​ください。加湿器は、5分で架橋試薬のミスト20mlのを生産、250ミリリットル/時間の噴霧速度を持っていることを確認してください。 </li><li>架橋工程の後、加湿器の電源をオフにし、PDMS MOを埋めますPBSでLDS。 </li></ol>シングルモジュラーヒドロゲルシートの4取り扱い<ol><li> 200μlのピペットチップを使用して、ハイドロゲルシートの周りに優しくPBSをピペットを介しマイクロパターンを型から各硬化ヒドロゲルシートを外します。 </li><li>エンドカット千μlのピペット先端を使用して、各浮動ハイドロゲルシートをピックアップ。各肝小葉様メッシュハイドロゲルシートを8ミリメートル×8.7ミ​​リメートルの寸法を有し、かつ100である - 厚さ200μm。 </li><li>ハイドロゲルを使用して浮いた状態でのin vitroでの細胞は5週で12ウェルプレート中のユニット部品として構成する12ウェルプレートに1mlのDMEMにハイドロゲルシートの単層を移し、文化37℃での％のCO 2の加湿インキュベーター。一日おきに培地を交換します。 </li></ol> 5の組立多層ヒドロゲルシート<ol><li>繰り返しが18ミリメートル×18ミリメートル×4mmの寸法のPDMSフレームを生成するために1.5から1.1ステップ（幅x下面には170μmの高い柱状構造を含むのHのx D）、および。ステップ1.2と同じ比率で、PDMSと硬化剤の混合物の42グラムを使用してください。 ×9ミリメートル×2ミリメートル（幅×高さ×奥行）8mmの寸法の内部フレームを作成するために、PDMSフレーム用シリコンウェーハ上に特殊なポリカーボネートの金型を置きます。 </li><li> 121℃で15分間オートクレーブに蒸留水とピンセットに沈め、PDMSフレームと180μmの細孔ナイロン濾紙を滅菌します。 </li><li> 60 mmの直径のペトリ皿中（直径5cmの）ナイロンフィルター紙片の四分の一に滅菌PDMSフレームを配置します。 </li><li>エンドカット千μlのピペットチップを使用して、PDMSフレームの内部にモジュラーハイドロゲルシートを転送します。組み立てに使用されるハイドロゲルシートは、それらが作製した後、少なくとも一日のために培養されるべきです。 </li><li>空の200μlのピペットチップを使用して、PDMSフレームと各モジュール式のハイドロゲルシートの端を合わせます。 </li><li> 6層 - 繰り返し4のスタックを形成するために、モジュール式のヒドロゲルシートを使用して、5.4と5.5を繰り返します。 </li><li> PDMSフレームの一番下にある柱構造を介して流出することにより、培養液を除去します。そして、多層構造物の隅にアルギン酸塩溶液2μL（w / vの2％）を追加します。 </li><li>別のものとそれぞれの層の端部を取り付けるために、多層構造体の上に30秒間架橋試薬のミストを噴霧します。 （250ミリリットル/時間の噴霧速度で）架橋剤のミストの2ミリリットルを使用してください。 </li><li> 400μlのDMEMで穏やかに多層構造物をすすぎ、ピンセットを使用して、PDMSのフレームを削除します。 </li><li>優しくDMEMの4ミリリットルを添加した後、細胞リフターで拭いてろ紙から多層構造体を取り外します。 </li><li>ヒドロゲルと同様に構成する、3濾紙を使用して、DMEM mlの培養浮遊様式でインビトロで細胞を含む6ウェルプレートに、多層構築物を転写37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター中で一週間以上、6ウェルプレート中のマルチスケールの細胞の足場。一日おきに培地を交換します。 </li></ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li>
<li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li>
<li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li>
<li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).</li>
<li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol%E2%88%92Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li>
<li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li>
<li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li>
<li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li>
<li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li>
<li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、モジュラーヒドロゲルシートを作製し、3次元細胞の足場を形成するためにそれらを組み立てる単純な方法を提供します。 短時間で明確なパターン化アルギン酸塩構造を構築するために、我々は金型から複雑な微細パターンを維持するだけでなく、細胞の生存率および代謝を維持するのに十分な剛性構造を作成することができ、架橋プロセスを特定する必要があります。私たちは、霧状で加湿器を使用して、架橋試薬を噴霧するために、ゾル - ゲル転移を含む、架橋プロセスを開発しました。代謝物および栄養素の高い拡散透過性を有する - （200〜100μm程度）、この架橋プロセスがなければ、マイクロスケールのパターンが限られた拡散深さで構築薄いヒドロゲルの形態で生成することができませんでした。 60分、18 - - 20架橋TIまた、30を必要とする既存の拡散ベースの方法と比較（ - 5分3）私は比較的短かったです。 さらに、それはまた、唯一の液体培地中で機械的に安定した薄膜ヒドロゲルシ...

ヒドロゲルは、特に、生体材料を約束しており、基本的な生物学、薬理学的ア ​​ッセイおよび医学において重要であることが期待される。ヒドロゲル系の細胞構築物の1 Biofabrication動物実験の使用を低減するために提案されている、2,3移植組織4を交換し、改善細胞ベースのアッセイ。5,6-含水（ハイドロ）粘弾性物質（ゲル）は、多数のセルが3D細胞の微小環境を制御するために、骨格構造中にカプセル化され、維持されることを可能にします。微小流体または微細技術のガイダンスと組み合わせて、ヒドロゲル構築物の形状は正確に細胞のスケールで制御することができます。現在までに、粒子、7を含むヒドロゲルの様々な形状、 - 9繊維、10から12とシートは、13から15 は、ボトムアップアプロに構築単位として使用されていますマクロスケール多細胞アーキテクチャの製作に痛みます。 ヒドロゲルをベースとする粒子および繊維の両方は、マイクロ流体デバイスを用いて流体を制御して、マイクロスケール細胞環境のような用途のために容易にかつ迅速に製造されています。しかし、操作された組織の基本単位として、それはそれらを再配置し、マクロスケール構造物としての容積を拡大するために複雑になる。16マイクロメートルサイズの基本モジュールを製造することよりも、これは、マクロスケールの構造体を達成することはより困難です。ヒドロゲルに基づく構築物のシート状のユニットは、簡単な組立工程を介して足場の容積を増加させることができます。結果的に、ヒドロゲルシートの積層は、体積の増加だけでなく、3D空間の幾何学的な拡張だけでなく、を提供します。 マルチレイにそのアセンブリと一緒に15 -我々は以前、13マイクロパターンハイドロゲルシートを製造する方法を報告していますセルラーアーキテクチャをered。技術は、多層構造の積層工程を経て、複雑な微細と細胞構造物のモジュラー設計を可能にします。微細化されている積層型モジュラーヒドロゲルシートの製造を介して、制御マクロスケールの細胞微小環境と3D細胞培養系を実現することができます。このビデオプロトコルは、ヒト肝癌細胞株（HepG2細胞）に基づくモジュラーヒドロゲルシートを構築するために使用することができるシンプルで強力な製造方法について説明します。我々は、多層構造の中に、本明細書にこれらの単純なパターニングモジュラーヒドロゲルシートの操作、及びそれらの組み立てを実証します。

<table><tbody><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF-127</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P2443</td><td>粉末非イオン性界面活性剤&nbsp;</td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム塩、低粘度</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>超音波加湿器</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>改造装置、最大噴霧速度:250 ml / hr</td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルター親水性、180 &mu;m</td><td>EMDミリポア</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート金型</td><td></td><td></td><td>PDMSフレームパターンの製造用にカスタマイズされた金型</td></tr></tbody></table>

マイクロパターンマクロスケール3d細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

ヒドロゲルは 、インビボ様の三次元（3D）組織形状を提供するために、マイクロ流体や微細化技術を使用してマイクロスケールでパターン化することができます。結果の3Dハイドロゲルベースの​​細胞構築物は、高度な生物学的研究、薬理学的アッセイおよび臓器移植アプリケーションのための動物実験の代替として導入されています。ヒドロゲルをベースとする粒子および繊維は、容易に製造することができるが、組織の再構築のためにそれらを操作することは困難です。この動画では、制御された細胞の微小環境とマクロスケール3D細胞培養系を形成するために、それらのアセンブリと共に、微細アルギネートヒドロゲルシートの製造方法を説明します。 200μmで、かつ正確な微細パターンを有する - カルシウムゲル化剤のミストの形を用いて、薄いハイドロゲルシートは容易に100の範囲の厚さで生成されます。次いで、細胞をヒドロゲルシートの幾何学的な指導を培養することができます自立型条件。また、ヒドロゲルシートは、容易にエンドカットチップでマイクロピペットを使用して操作することができ、パターン化ポリジメチルシロキサン（PDMS）フレームを使用してそれらを積層した多層構造に組み立てることができます。容易なプロセスを用いて製造することができ、これらのモジュラーヒドロゲルシートは、ミクロおよびマクロ構造および組織再構築の機能試験を含むインビトロ薬物アッセイおよび生物学的研究の潜在的な用途を有します。

我々は、製造や携帯ヒドロゲルシートを自立の操作を説明しています。 図1に示すように 、我々は、マイクロパターンPDMS金型を製作し、細胞を含むヒドロゲルは、ゲル化剤のエアロゾル化ミストを生成するための加湿器を使用して、これらの型の親水性表面上にロードされ、架橋されました。金型からの放出後に、HepG2細胞を様々なパターン（ 図2）でヒドロゲルシートを自立で培養しました。したがって、薄いヒドロゲルシートは、3D培養環境を提供しました。さらに、モジュラーヒドロゲルシートは、3Dマクロスケールの細胞培養（ 図3）を可能にする、末端切断先端を有するマイクロピペットを用いて、PDMSのフレームを使用してシートを積層して組み立てることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /...

私たちは、マイクロパターン化されたハイドロゲルシートの簡単なプロセスでの製造について説明しています。これは、自立した形で組み立てて操作することができます。これらのモジュール式ハイドロゲルシートを使用すると、制御された細胞微小環境でシンプルなマクロスケールの3D細胞培養システムを生成できます。

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

本手順の全体的な目的は、3D細胞培養システムのためのモジュール式ハイドロゲルシートの簡便な作製、操作、および組み立てを実証することです。この手法は、培養マイクロ環境を用いて、いかにしてより生体内に近い機能的な工学組織を構築するかという、組織工学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、コストを増やすことなく、細胞を含むハイドロゲル構造体を生成できることです。3D細胞培養条件は、各モジュラーハイドロゲルシートによって異なります。この手法は、3D細胞のマイクロおよびマクロ環境において多様な形状と組成を提供できるため、細胞ベースのアッセイや生物学的研究の向上に寄与します。本手法はin vitroの細胞ベースのアッセイに知見を提供できるだけでなく、3D組織モデルの移植可能なスキャフォールドなどの他のシステムにも応用可能です。まず、標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて、目的のマイクロスケールパターンを作製します。このビデオで示す例では、ここに示されているような肝小葉に類似したメッシュパターンを使用します。次に、2.5 gramsのPDMSと2.5 gramsの硬化剤溶液を量り取り、これらの成分を十分に混合します。真空チャンバー内で溶液を脱気した後、フォイル製キャスティングディッシュを用いて、混合溶液をシリコンウェハーのマイクロパターン表面に均一に広げます。次に、ディッシュを65°Cに加熱したホットプレートの平らな面に90分間置いて、PDMSを硬化させます。硬化後、キャスティングディッシュからPDMSを取り出し、シリコンウェハーから慎重に剥がします。PDMSの端を切り取り、マイクロパターンの面を上にして、直径100mmのペトリ皿に配置します。次に、一次滅菌のため、マイクロパターンを形成したPDMSを70%エタノールで洗浄し、続いて蒸留水で洗浄します。その後、65°Cのオーブン内で10分間、完全に乾燥させます。次に、親水性表面を作るために、マイクロパターニングされたPDMSモールドをプラズマクリーナーに入れ、1分間洗浄します。これにより、水性液体の充填が容易になります。その後、材料表に記載されている界面活性剤溶液100 millilitersでPDMSの表面をコーティングします。サンプルをラボ用ロッカーで少なくとも3時間インキュベートします。次に、滅菌水を用いてPDMSモールドから界面活性剤溶液を洗浄し、65°Cのオーブンで10分間完全に乾燥させます。その後、各マイクロパターンモールドを紫外線に30分間曝露させて滅菌します。まず、標準的な手法を用いてhepg2細胞を培養します。細胞のコンフルエンスが70%から80%に達したら、PBSで細胞を1回洗浄します。次に、0.5%tripsin edtaを1 mL加え、37 °Cで4分間インキュベートして細胞を回収します。細胞を剥離させた後、遠心チューブに回収し、250 gで3分間遠心分離してペレット化します。上清を除去し、1 mLのPBSで細胞を再懸濁します。自動細胞カウンターを用いて、PBS中に分散している単一細胞数をカウントします。次に、250 gで3分間、再び細胞をペレット化します。PBS上清を除去し、最終的な播種密度が1 mLあたり500万から1,000万個になるように、1%アルギン酸ナトリウム溶液を細胞に加えます。ピペットを用いて細胞溶液を穏やかに混ぜ合わせ、その後、細胞ハイドロゲル懸濁液を5% CO2加湿インキュベーターにて37 °Cでインキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、マイクロパターン形成済みPDMSモールドをプラズマクリーナーに入れ、85 Wで1分間処理して親水性表面を作成します。細胞ハイドロゲル懸濁液をピペッティングで穏やかに混合し、モールド内のマイクロパターンの端に懸濁液を7.2 µL慎重に注入します。次に、加湿器を用いて架橋剤を250 mL/hの速度で霧状に発生させ、ハイドロゲル前駆体に5分間噴霧して、細胞ハイドロゲル懸濁液をゲル化させます。この手順により、PDMSモールドの表面地形が5 cmの範囲内でカバーされていることを確認してください。架橋プロセス後、加湿器の電源を切り、PDMSモールドにPBSを満たします。200 µLピペットを使用して、硬化したハイドロゲルシートの端に沿ってPBSを静かに分注し、各ハイドロゲルを剥離させます。次に、先端をカットした1,000 µLピペットチップを用いて、浮遊しているハイドロゲルシートをそれぞれ回収します。各ハイドロゲルシートを、1 mLの予熱済みDMEMが入った12ウェルプレートの個々のウェルに移し、培地表面に浮かかせます。この状態で1週間細胞を培養し、2日ごとに培地を交換します。次に、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、下面に高さ170 µmのピラー構造を持つPDMSフレームを作製します。作製時、PDMSフレーム用のシリコンウェハー上に特殊なポリカーボネート製モールドを配置し、幅8 mm、高さ9 mm、深さ2 mmの内枠を作成します。滅菌後、60 mmペトリ皿にセットしたナイロンフィルターペーパー1/4枚の上にPDMSフレームを配置します。ハイドロゲルシートをインキュベーターから取り出し、エンドカットした1,000 µLピペットチップを用いて、1枚目のモジュラーハイドロゲルシートをPDMSフレームの内部に移動させます。空の200 µLピペットチップを使用して、モジュラーハイドロゲルシートの端をPDMSフレームに合わせます。この工程を他のハイドロゲルシートでも繰り返し、4層から6層のスタックを作成します。次に、PDMSフレーム底部のピラー構造を通して培地を流し、除去します。その後、多層構造体の隅に2%アルギン酸溶液を2 µL添加します。加湿器を用いて、架橋剤のミストを250 mL/hの速度で多層構造体に30秒間噴霧し、各層の端を互いに接着させます。次に、多層構造体を400 µLのDMEMで穏やかに洗浄し、ピンセットを使用してPDMSフレームを取り除きます。その後、さらに4 mLのDMEMを添加します。セルリフターで穏やかに拭い、フィルターペーパーを用いて多層構造体を剥離させ、3 mLのDMEMを含む6ウェルプレートにフィルターペーパーで転送します。6ウェルプレートを用いて、マルチスケール細胞足場としてハイドロゲル構造体を配置し、細胞を浮遊状態で少なくとも1週間培養します。培養液は1日おきに交換してください。ここでは、肝小葉様のマイクロパターン化ハイドロゲルシートを積層して構築した結果を示しています。緑色に蛍光するヒト肝癌細胞と赤色に蛍光するNIH-3T3線維芽細胞が、複合メッシュ上で共培養され、共に増殖しています。本手法を用いることで、六角柱、薄いメッシュ、全面的なアレイ、および100〜200 µmオーダーの薄いハイドロゲル構造体としての複数のマイクロコーム状マイクロファイバーなど、多くのパターンバリエーションを作成することが可能です。これらの構造は、多くの異なる細胞種に対して豊かな3D培養環境を提供します。このビデオを視聴することで、ボトムアップ方式で生体内模倣3D培養システムを構築するための細胞含有ハイドロゲルシートの作製方法について、十分に理解できるはずです。

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学ぶモジュラーヒドロゲルシートの作製と組み立てによるマイクロパターンマクロスケール3D細胞構造の構築法。組織工学においてコスト効率よく機能的な組織を作成し、細胞ベースアッセイと生物学的研究を向上させる革新的アプローチです。

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

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