コンピュータ支援ビデオとデジタル画像解析を用いた銅水溶液の急性暴露に応答して、魚の遊泳行動を定量化

この手順の全体的な目標は、シロチョウザメの亜致死性銅への曝露に対する行動反応を定量化する方法を示すことです。この方法は、汚染物質への亜致死的な曝露が魚の遊泳行動にどのように影響するかなど、生態毒性学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、シロチョウザメの保護に重要な情報を提供できます。

また、他の魚種、両生類、無脊椎動物にも容易に適用できます。この手法の主な利点は、応答が非常に感度が高く、毒性の早期兆候を提供し、生物の生存に関連していることです。最初は、個人が行動測定を行うことに慣れていない場合、この方法は難しいかもしれません。

プロトコルのデモンストレーションは、私の共著者であるHolly Puglisです。まず、2リットルの水性試薬グレードの銅2硫酸塩五水和物を準備します。次に、希釈器システムと露光タンクを平衡化します。

自動シリンジディスペンサーからのインテークチューブをストック溶液フラスコに入れます。.次に、自動ポンプのスパイク容量を1ミリリットルに設定し、希釈器をオンにします。このシステムは、5つの濃度とコントロールの50%希釈シリーズを作成します。

これらの溶液は、4方向スプリッターを介して、4つの複製露光チャンバーに供給されます。次に、ウォーターバスを摂氏15度に維持するように設定されたチラーのポンプをオンにします。次に、希釈器の自動タイマーを使用して、30分ごとにサイクルするように設定します。

タンク内の水位は、スタンドパイプの排水管によって維持されます。側面に4cmの穴を開け、その穴を30ミクロンのステンレスメッシュで覆って露光室を準備します。魚10グラムあたり少なくとも1リットルの水を保持する露光チャンバーを必ず選択してください。

例えば、生後89日のシロチョウザメの体重は約373ミリグラムで、28センチ×13ポイント、5センチ×25センチ四方のチャンバーで試験することができます。実験の開始時、中間点、および終了時に、化学分析のために24ミリリットルの試験液サブサンプルを収集します。プラスチック製の注射器に取り付けられたシッパーストローを使用してください。

シッパーストローをゼロポイント4 5ミクロンポリエーテルスルホンフィルターと交換し、フィルターを通して4ミリリットルのテスト水を分配します。この水は捨ててください。次に、残りの20ミリリットルの水を酸で洗浄したポリエチレンボトルにろ過します。

サンプルを16モルの硝酸で1体積%に酸性化します。これらのサンプルは、その後、最大3ヶ月間保存することができます。試験暴露が確認されたら、各複製試験チャンバーに3匹のチョウザメをストックし、チャンバーリットルあたり約172ミリグラムの魚をストックします。

チョウザメを非研磨性の網で集め、小さなバケツに移します。6つの試験溶液からデータを収集するには、合計で144匹の魚が必要です。96時間の暴露中は、魚に餌を与えないでください。

死亡率と異常な行動をスコアリングするために、一貫した毎日の観察を行う必要があります。これを行うには、午前中が最適な時間であり、観察者がテスト条件を知らないのが理想的です。平衡の喪失は、魚が水柱内で直立した位置を維持できないことと定義されます。

不動とは、突き動かされない限り、魚が動いたり泳いだりできないことと定義されています。また、嗜眠、多動性、呼吸の増減、色の変化、振戦、けいれん、腹部の肥大化、水柱の位置、その他の異常な遊泳パターンなどの他の異常も記録します。死んだ魚は必ずすぐに取り除く必要があります。

毎日、2つの水サンプルからハンドヘルドメーターで溶存酸素レベルも測定します。96時間の露出の終わりに、水泳行動分析のためのビデオを作成します。テストアリーナを露出タンク内に配置します。

魚が自由に泳ぐのに十分な大きさのテストアリーナを必ず選択してください。各テストアリーナの真上に、三脚にハンドヘルドビデオカメラを設置します。次に、処理した魚から、最大3人の生存者をランダムに選択します。

小さなメッシュネットを使用して3つをテストアリーナに移します。魚がアリーナに約30分間順応するのを待ちます。魚が順応している間、画像の焦点を合わせ、水の流れによるグレアの歪みを最小限に抑え、背景に対する魚のコントラストを最大化し、魚が隠れないようにビューを調整します。

魚が慣れたら、録画を開始し、2分間のビデオデータを収集します。ビデオを撮った後、魚を安楽死させて処分します。ビデオファイルをデジタル分析ソフトウェアに必要な形式に変換した後、トラッキングソフトウェアを開き、メイン画面の[新しい実験の作成]オプションで新しいデフォルトの実験を選択します。

プロンプトに入力し、[OK]を押します。次に、[セットアップ] の [実験設定] オプションに移動し、[ビデオ ソース] の [ビデオ ファイルから] を選択します。アリーナの数を 1 に設定します。

アリーナごとの科目数を 3 に設定します。次に、追跡対象フィーチャの下の中心点検出を選択し、目的の単位を選択します。次に、[セットアップ]で、試用版リストオプションを選択し、画面上部の[ビデオの追加]をクリックします。

ダイアログボックスからアルファベット順を選択します。[参照] をクリックします。ビデオが配置されているフォルダに移動し、関連するファイルを強調表示して、[開く]をクリックします。

ビデオファイルが選択されたので、ソフトウェアで実験の範囲を定義するに進みます。まず、画面上部の「変数を追加」をクリックし、ラベルボックスに濃度を入力します。説明ボックスに銅の濃度をマイクログラム/リットルで入力します。

次に、タイプのドロップダウンリストから数値を選択します。[事前定義された値] ボックスをクリックし、ダイアログボックスから [個々の値の定義] オプションを選択します。実験に使用する濃度を入力し、各数値の追加の間に「追加」をクリックします。

次に、[他の値を許可する]オプションのチェックを外し、[OK]をクリックします。スコープボックスのドロップダウンメニューから試用版を選択します。各試行の適切な濃度を所定のボックスに入力します。

画面上部の「変数を追加」をクリックします。ラベルボックスに「replicate」と入力します。説明ボックスにレプリケート番号を入力します。

[タイプ] のドロップダウン リストから [数値] を選択します。次に、事前定義された値ボックスをクリックし、ダイアログボックスから個々の値を定義するオプションを選択します。1、2、3、4 を入力し、[他の値を許可する] オプションのチェックを外します。

次に、[OK]をクリックします。次に、スコープボックスのドロップダウンメニューから試用オプションを選択します。各試行の適切なレプリケート番号を入力します。

次のタスクは、アリーナスペースの設定です。[セットアップ]タブでアリーナ設定を選択することから始め、最初の設定にトライアル1という名前を付けます。ダイアログボックスから、「背景画像を取得」オプションを選択し、「参照」をクリックします。

試用版のビデオファイルを見つけて、[開く]をクリックします。ビデオが表示されたら、背景画像の取り込みダイアログボックスで[グラブ]をクリックします。次に、アリーナ設定の下の画面上部にある白い円のアイコンをクリックし、水泳エリアを囲むように表示される円を操作します。

次に、アリーナ設定の下にあるキャリブレーションスケールアイコンをクリックします。クリック&ホールド&ドラッグモーションを使用して、アリーナスペースを選択します。次に、キャリブレーション距離の実世界の距離ボックスに、10ポイント5を入力します。

次に、[OK]をクリックします。必要に応じて、キャリブレーション ラインが円形アリーナの直径全体に広がるように調整します。アリーナ設定ボックスの「アリーナ設定の検証」オプションをクリックし、検証されなかった設定の問題に対処します。

次に、各試行のすべてのアリーナが定義されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、魚の検出パラメータを設定します。まず、画面の左側にある実験探索ツール バーから、セットアップ オプションの下にある検出設定を選択します。

次に、検出設定1ダイアログボックスの方法の下にあるドロップダウンメニューから動的減算を選択します。また、ダイアログボックスの「サブジェクト識別」で各サブジェクトの塗りつぶし色を選択します。次に、ビデオを選択し、試用版のビデオを見つけます。

検出設定1ダイアログで、ビデオの下のサンプルレートボックスに5ポイント9941を入力します。同じボックスで、[検出] の下の参照画像オプションの設定をクリックします。次に、参照画像ダイアログボックスの[Cの学習を開始]オプションをクリックします。

参照画像ダイアログボックスの画像が動物なしで表示されたら、ダイアログボックス内の取得設定の下にある動的参照画像を使用するをクリックして、このダイアログボックスを閉じます。次に、ドロップダウンメニューから暗いを選択します 被写体は検出中です 検出設定1つのダイアログボックスで。検出中の暗いコントラストの場合は、小さい方の数値を 33 に、大きい方の数値を 153 に設定します。

次に、右下にある[変更を保存]をクリックします。次に、そのソフトウェアが影や破片ではなく、動物を正常に追跡していることを確認します。再生コントロールダイアログボックスの再生ボタンをクリックし、必要に応じて暗いコントラストの数値を調整します。

行った調整は必ず保存してください。これで、ソフトウェアがビデオからデータを収集するように設定されたので、次のタスクは各試行で魚を追跡することです。まず、画面左側の実験エクスプローラーツールバーから、セットアップオプションでacquisitionを選択します。

次に、取得設定ダイアログボックスで「次回の計画トライアルを追跡」をクリックし、取得設定ダイアログボックスの設定の下に正しいトライアル、ビデオ、アリーナ設定がすべて表示されていることを確認します。次に、取得制御ダイアログボックスで検出速度決定オプションを確認します。白い四角で囲まれた緑色の円のボタンをクリックして、取得プロセスを開始します。

すべての試行が追跡されるまで、このプロセスを繰り返します。これで、魚である追跡対象を分析できます。まず、画面左側の実験エクスプローラーツールバーから、分析オプションの下にあるデータプロファイルをクリックします。

次に、コンポーネントツールバーのネストオプションの下で時間を選択します。時間ダイアログ ボックスの [時間間隔のトラック選択] 設定で、[終了] の値を 2 分に調整し、[OK] をクリックします。次に、画面右側のデータプロファイル領域で、開始ボックスと結果1ボックスの間のネストボックスをドラッグします。

画面の左側にある実験エクスプローラーのツールバーで、解析オプションの下を見て、解析プロファイルをクリックします。次に、従属変数ツールバーで、距離と時間の見出しの下にある速度をクリックします。[追加] をクリックし、従属変数ツールバーの距離と時間の見出しの下にある [移動距離] をクリックします。

次に、[移動距離] ダイアログ ボックスで [追加] をクリックし、従属変数ツール バーの個々の動作見出しの下にある [移動] をクリックします。移動ダイアログボックスで、外れ値フィルターの見出しの下を見て、平均化間隔を1に調整します。次に、しきい値の見出しの下で、開始速度を 2 ポイント ゼロ ゼロに調整し、停止速度を 1 ポイント 7 5 に調整します。

「統計の計算」見出しの下で、「移動」と「移動しない」の両方のチェックボックスをオンにします。次に、[追加]をクリックし、画面の左側にある実験エクスプローラーツールバーの[結果]オプションの下にある[分析出力]をクリックします。次に、[計算]をクリックします。

従属変数が計算されたら、画面上部の[エクスポート]をクリックします。[エクスポート解析出力] ダイアログ ボックスから保存先フォルダーを選択し、ファイル タイプのドロップダウン メニューから [Excel] を選択します。次に、[OK]をクリックします。

最後に、画面上部の[ファイル]タブの下にある[実験の保存]をクリックします。デジタル追跡ソフトウェアを閉じます。データをスプレッドシートファイルにインポートし、市販の統計分析ソフトウェアパッケージを使用して分析します。

さまざまな銅濃度にわずか72時間さらされた後、ハッチの2日後、チョウザメは多くの観察可能な異常を示しました。遊泳行動には明らかな影響がありました。ビデオデータは、この行動障害を定義するのに役立ちました。

さらなる試験では、孵化後30日目のチョウザメは、96時間の銅曝露に敏感であることが証明された。遊泳速度、移動時間、移動距離はすべて、銅濃度の増加とともに大幅に減少しました。遊泳路も、銅濃度の増加に伴って減少しました。

このビデオを見れば、毒性試験における行動の定量化方法についてよく理解できるはずです。この手法は、環境管理者に、行動的に定義された基準を使用して環境傷害を文書化し、修復を導く手段を提供できます。この手順を実行するときは、行動観察を記録する際に一貫性を保つことを覚えておくことが重要です。

摂食や攻撃性などの他の行動は、汚染物質への曝露が生存に及ぼす長期的な影響に関する追加の質問に答えるために、この手順に従うことで定量化できます。