enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

この手順の全体的な目的は、特定のゲノム領域を分子相互作用を保持したまま単離し、そのゲノム領域と相互作用する分子を同定することです。この手法は、転写やエピジェネティック調節などのゲノム機能分野における疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、特定のゲノム領域と相互作用する分子を直接同定できることです。

本手順のデモンストレーションは、私の研究室の助教である藤田利嗣が行います。テキストプロトコルに従い、目的のDNA結合分子を構築してください。これには、目的のgBlock配列を作成し、例えばそれをレトロウイルスに挿入して、3つのFLAG-dCas9と複合体を形成するガイドRNAを産生させることが含まれます。

あるいは、標的配列を認識する3種類のFLAG-TALタンパク質を作製することも可能です。その後、テキストプロトコルに従って、調製したレトロウイルスを細胞に感染させます。作製したDNA結合分子の発現を確認し、細胞株を確立してください。

次に、ホルムアルデヒドを用いて細胞を架橋します。形質導入した細胞20 million個を30 millilitersの通常培地に懸濁し、最終濃度が1%になるように37%ホルムアルデヒドを810 microliters加えます。この混合物を37 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。5分後、1.25 molarグリシンを3.1 milliliters加えて、架橋反応を停止させます。

次に進む前に、細胞を室温で10分間静置します。次に、冷蔵遠心機を用いて、細胞チューブを300 Gで5分間遠心分離します。上清を慎重に除き、30 mLのPBSで細胞ペレットを混合および遠心分離して洗浄します。

PBSで2回洗浄します。必要に応じて、固定細胞の洗浄済みペレットを-80°Cで保存できます。続いて、細胞からクロマチンを回収します。

10 mLのライシスバッファーに懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。次に、冷却遠心機を用いて細胞を回収し、上清を注意深く除きます。その後、細胞ペレットを核ライシスバッファーに懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。

インキュベーション中、数分おきに混合液を短時間ボルテックスします。再び、遠心分離によって細胞を回収します。次に、ペレットを10 millilitersのPBSで洗浄し、再度遠心分離を行って洗浄液を除去します。

これによりクロマチン画分が得られ、必要に応じて急速冷凍し、-80°Cで保存することができます。次に、クロマチンペレットを800 µLの修正溶解バッファー3に懸濁させ、その懸濁液をより小さい1.5 mLチューブに移します。ここで、超音波破砕機のプローブをレベル3の出力、連続動作モードで起動します。

クロマチンを断片化するため、10秒間のソニケーションと20秒間の氷上静置を、手動で繰り返し行います。5回目または6回目のサイクルごとに、サンプルの過熱を防ぐため、氷上静置の時間を2分間に延長してください。このソニケーションサイクルを10回から18回行い、その際、サンプルの泡立ちを避けるため、プローブのチップがチューブの底に触れないようにしてください。

超音波処理後、高速冷蔵遠心分離によってサンプルを回収します。次に、断片化されたクロマチンを含む上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。断片化の評価方法については、テキストプロトコルを参照してください。

免疫沈殿の準備として、まず抗体をDynabeadsに結合させます。この免疫沈殿は、2,000万個の細胞由来のサンプルに合わせてスケールされています。断片化したクロマチンに、Triton X-100を含む修飾溶解バッファー3を1/5量加え、最終濃度を1% Tritonにします。

次に、混合液を正常マウスIgGが結合した磁気ビーズに加えます。回転ミキサーを用い、冷蔵状態で1時間反応させます。その後、マグネットスタンドを用いて、溶液からビーズを3分間回収します。

次に、上清を回収します。上清をanti-FLAG抗体結合磁気ビーズが入ったチューブに移します。この結合反応を、ローテーターを用いて4°Cで一晩行います。

翌朝、チューブにマグネットを3分間適用してビーズを回収します。その後、上清をピペットで吸い出し、廃棄します。次に、ビーズを洗浄します。

これらを1 mLの低塩バッファーに懸濁し、ローテーターを用いて4 °Cで5分間インキュベートします。インキュベート後、磁石を用いてビーズを分離し、上清を捨てます。この低塩バッファーによる洗浄工程をもう一度繰り返します。

同じ手法を用いて、高塩濃度バッファーでの洗浄をさらに2回行います。引き続きこの方法で、塩化リチウムバッファーによるビーズの洗浄を2回行います。最後に、TBS-IGEPAL CA-630でビーズを1回だけ洗浄します。

7回の洗浄ステップの後、ビーズを200 µLの溶出バッファーに懸濁し、37 °Cで20分間インキュベートします。次に、磁石を用いてビーズを回収し、上清を新しいチューブに回収します。収量を増やすために、この溶出ステップを繰り返します。

次に、収量を推定するため、DNAの約5%を精製します。まず、溶出液の大部分を沈殿反応に混合します。クロマチンを-20°Cで一晩沈殿させます。

翌日、サンプルを遠心分離し、上澄み液を除去します。ペレットを1 mLの70% ethanolで洗浄し、再び10分間遠心分離を行います。その後、上澄み液を除去し、ペレットを40 µLの2x sample bufferに懸濁させます。

次に、懸濁液を5分間十分にボルテックスします。その後、100 °Cで30分間インキュベートし、変性と架橋の解除を行います。加熱後、サンプルの40 µLをSDS-PAGEゲルにロードして泳動します。

通常、4〜20%の勾配を用います。染料がウェルから1 cm下に到達するまでゲルを電気泳動します。その後、ゲルを染色し、約2 mmの長さの5つの断片に切断します。

ゲル片からタンパク質を溶出し、質量分析に用います。RNAの精製およびそれに続くシーケンシング解析については、テキストプロトコルに記載されています。全体として、enChIPを用いることで、標的ゲノム領域の最大10%を精製することが可能です。

ここでは、非特異的なSox2遺伝子座と比較した、IRF-1遺伝子のプロモーター領域を標的とした解析の収率が示されています。別の例として、テロメアと非特異的なガンマサテライト遺伝子座の標的化の比較があります。enChIP SILACにより、インターフェロンガンマ特異的にIRF-1プロモーターに関連する複数のタンパク質が同定されました。

enChIPと質量分析法を組み合わせることで、テロメア結合タンパク質も同定されました。その後、enChIP RNAシーケンシングを用いて、テロメアに関連するRNAが同定されました。この技術の開発により、転写およびエピジェネティック制御の分野の研究者が、さまざまな生物学的システムにおいてこのようなメカニズムを探索する道が開かれました。