Name: マウスで同所後肢移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 学ぶマウス同所後肢移植の非縫合カフ法による超微小血管吻合技術。血管化複合同種移植における同種免疫応答の研究に有用なモデルです。

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この作品は賞号W81XWH-13-2-0053の下で、AFIRM II努力をサポートするために、陸軍、海軍、NIH、空軍、VAおよび保健省によってサポートされていました。米陸軍医学研究買収活動、820チャンドラーストリート、フォート・デトリックMD 21702から5014までは表彰および管理取得オフィスです。ご意見、解釈、結論と勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されていません。 著者らは、この研究の間に、その優れた獣医のサポートのためにジェシカイッチ、DVM、キャロライン・ギャレット、DVMとジュリー・ワトソン、DVMに感謝したいと思います。

全ての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M108下で行いました。 1.ドナー操作<ol><li>手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の世話のとおりと前皮膚切開にブプレノルフィン皮下に1時間の0.1ミリグラム/キログラムBWプロトコルの使用を使用します。 </li><li>イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。手続きの開始に先立って麻酔深度を監視するためにつま先ピンチ撤退反射を実行します。 </li><li>マスク、使い捨ての分離ガウンと手袋を着用してください。 </li><li>外科的ARを剃りますEA、特に後肢と鼠径部、および10％のポビドンで準備を - ヨウ素。 </li><li>滅菌野ドレープ、オートクレーブ処理機器や高倍率顕微鏡（40X）を使用します。 </li><li>半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。 </li><li>大腿動脈、静脈や神経を特定し、解剖。鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を分離します。 </li><li>血管茎を解剖したら、マイクロはさみを使用して、鼠径靱帯のレベルで血管を分割します。 </li><li>次に、はさみを使用して、ドナー動物からの移植片を分離するために半ば腿のレベルで近位個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群20を分割し続けます。 </li><li>大腿骨を横断し、はさみを使用して大腿骨シャフトの中間で切断。 </li><li>イソフルラン過剰摂取FOLにより動物を安楽死させます頚椎脱臼が続き。心拍や呼吸の停止を確認してください。 </li><li>注射器に取り付けられた33のGフラッシング針を使用してヘパリン化2ミリリットル（30 IE）の冷（4℃）生理食塩水で手足をフラッシュ（材料表を参照してください）​​。 </li><li>それぞれ、大腿静脈と動脈に1ポリイミドカフを配置します。 </li><li>インセットまで湿った綿ガーゼ、4℃でペトリ皿や店舗内の所定の場所に移植片をラップします。 </li></ol> 2.受信者の操作<ol><li> 後肢の除去 <ol><li>手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の管理と使用プロトコルを使用ブプレノルフィンSC 1時間前に皮膚切開の0.1ミリグラム/ kg体重あたりとして。 </li><li>イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。 DEPTを監視するために、つま先のピンチ撤退の反射を行います手続きの開始に先立って麻酔の時間。 </li><li>麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を使用してください。 </li><li>特に、10％ポビドンと後肢と脚の付け根と準備を手術領域を剃る - ヨウ素。 </li><li>半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。 </li><li>鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を特定し、大腿動脈、静脈や神経を解剖し、分離します。 </li><li>血管茎を解剖したら、鼠径靱帯のレベルで大腿血管をクランプします。 </li><li>浅腹壁動脈のレベルで遠位血管をカットします。 </li><li>次に、ネイティブ後肢リチウムを分離するために、近位に半ば腿のレベルで個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群20を分割し続けますはさみを使用して、レシピエント動物からMB。 </li><li>はさみを使用して大腿骨シャフトの中央に大腿骨を横断。 </li><li>切開部位の出血、したがってレシピエントの血液損失を防止するために、以前に離断大腿部の筋肉を焼灼。 </li></ol></li><li> 移植 <ol><li>温かい生理食塩水（37°C）で術野を灌漑し、操作の前と後の0.3ミリリットル暖かい生理食塩水を注入することにより、流体の損失を最小限に抑えます。 </li><li>受信者の大腿骨と移植片を整列させることによって、ネイティブ後肢の正確な解剖学的位置を反映し、髄内ロッドとして20 G脊髄針を使用してそれらを接続する方法で、移植片を置きます。 </li><li>吸収性縫合糸材料（6-0ポリソーブ）を使用して癒合腹側と背側の筋肉群。 </li><li>非縫合カフ技術を用いて大腿血管を接続します。詳細に、以前グラーフの容器端部に取り付けられたカフの上に容器の受信者側を引っ張りますトン。 10-0ナイロン縫合糸を使用し、袖口に受信者の容器を固定するために、円周ネクタイを行います。 </li><li>次のクランプを解放します。この段階で視覚的にカフ回転および血管の誤回転やねじれを防止するための最適な位置を確認します。 </li><li>筋肉の受信者ドナーインターフェースと骨の両端を中心とした電気メスを使用して細心の止血を行います。 </li><li>非吸収性ナイロン縫合糸（6-0 Ethilon）を用いて皮膚を閉じます。 </li><li>動物は加熱ランプの下で、そのケージに回復できるようにすることで、正常体温条件を確立します。住宅施設に戻す前に、少なくとも4時間、定期的なモニタリングを続けます。 </li><li> 3日間は0.1mg / kgをSC毎に6-8時間の用量でブプレノルフィンと術後鎮痛を提供します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

このような壊滅的な組織欠損の再建のための上肢と顔面移植などの血管新生したコンポジット同種移植は、従来の再建手続きに修正可能ではない患者に対する有効な治療法の選択肢として発展してきました。マイクロサージャリーの分野における技術の進歩だけでなく、強力な免疫抑制および固形臓器移植における免疫調節療法と豊富な経験は、今、このユニークな患者集団3,21の長期同種移植片の生存を可能にします。しかし、同種移植片の維持および生存のために必要な長期的な免疫抑制の重大な副作用は、まだ3,22,23救命再建モダリティを強化ではなく、これらの生命のより広い適用を制限します。また、固形臓器移植とは対照的に、のVCAの成功はまた、運動機能のための両方の筋肉を神経支配再ならびにする同種移植に受信者の神経のタイムリーな再生に依存タッチと機能を回復する温度感覚のための感覚のコンポーネント。免疫学的な観点から、移植医療のすべてのように、再建移植における包括的な目標は、長期維持免疫抑制23を必要とせずに同種移植片の受け入れを可能にする運用寛容の状態を達成することです。この点において、マウスは、無傷の免疫系にお...

90年代後半は、1998年にフランスで初めて成功した手の移植により、再建移植の先駆的な時代を告げました。それ以来、壊滅的な組織欠損の再建のためのVCAの使用は、幅広い患者に採用され、成功を収めています。現在までに、世界は112の上肢の76人のレシピエントと31の顔1-3を数えています。さらに、腹壁4、喉頭5、気管6、血管新生関節7、さらには陰茎8など、他のいくつかの種類のVCAが行われています。さらに、子宮移植後の赤ちゃんの生児出産が最近報告されました9。この世界的な経験の高まりは、従来の再建および修復手術および治療では修正できない重大な機能組織欠損に苦しむ患者にとって、再建移植が有効な治療選択肢になっていることを示しています。
「同類」を置き換えるという考えは臨床的な熱意を呼び起こしましたが、同種移植片とその機能を維持するために必要な従来の高用量免疫抑制の副作用に関しては、当初の懐疑論が依然として優勢です10,11。しかし、Leeらの独創的な研究によって示されるように、これらの複合移植片は、その個々の成分よりも拒絶する可能性が低く、さらに、血管新生骨コンパートメントなどの組織成分の一部は、免疫受容と拒絶のバランスに独自の免疫学的効果を発揮する可能性があるため、楽観主義を煽っています12。
私たちのグループは、固形臓器移植のためのいくつかの顕微手術動物モデル、ならびに血管新生複合同種移植13-19の先駆者となりました。ここでは、非縫合カフ技術を使用して、同所性マウス後肢移植モデルで超微小血管吻合を行う新しい外科的処置について説明します。この移植モデルは、免疫受容および拒絶メカニズム、ならびにマウス種の免疫学的に汎用性の高い環境における耐性誘導に向けた血管新生骨髄コンパートメントなどの個々の組織構成要素の役割を調査するための有用なツールを提供します。さらに、四肢の同所性配置は、VCAの設定にとって非常に重要な神経再生と機能転帰研究の可能性を開きます。

<table><tbody><tr><td>縫合糸、6-0 ナイロン</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸、6-0 ポリソーブ</td><td>MWI</td><td>72667</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸、10-0 ナイロン</td><td>エアロ サージカル</td><td>TK-107038</td><td></td></tr><tr><td>ポリイミド チューブ、サイズ 25</td><td>Vention Medical</td><td>141-0023</td><td></td></tr><tr><td>ポリイミド チューブ、サイズ 27</td><td>Vention Medical</td><td>141-0015</td><td></td></tr><tr><td>微小血管クランプ (シングル)</td><td>Synovis</td><td>00396</td><td></td></tr><tr><td>微小血管クランプ (ダブル)</td><td>Synovis</td><td>00414</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>Synovis</td><td>SAS-18</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ鉗子</td><td>Synovis</td><td>FRS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ拡張器</td><td>Synovis</td><td>FRS-15 RM-8d.1</td><td></td></tr><tr><td>マイクロニードルドライバー</td><td>Synovis</td><td>C-14</td><td></td></tr><tr><td>マイクロクランプアプリケーター</td><td>Synovis</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフラッシングニードル</td><td>ハミルトン</td><td></td><td>10MM、30&deg;、33G</td></tr><tr><td>乳酸リンガー 溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9968051</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td></td><td></td><td>DEA 番号が必要です。ホスピタル薬局から入手。</td></tr><tr><td>エンロフロキサシン;バイトリル</td><td>バイエルヘルスケア</td><td>186599</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td></td><td></td><td>ホスピタル薬局から入手</td></tr></tbody></table>

マウスで同所後肢移植

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

生体内動物モデルシステム、特にマウスモデルは、移植医療の分野における基礎研究やトランスレーショナル研究に不可欠な強力で汎用性の高い科学ツールへと進化しました。この設定では、診断およびインターベンションアプリケーション用のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を含む、膨大な数の試薬が専用に提供されています。さらに、膨大な数の遺伝子型、近交系、トランスジェニック、およびノックアウト株により、免疫応答の複雑な相互作用に対する体液性および細胞成分の個々の寄与を詳細に調査することができ、マウスを免疫学研究のゴールドスタンダードにしています。
血管新生複合同種移植（VCA）は、外傷性または先天性の組織喪失に苦しむ患者の「同種を同種」に置き換えるために同種移植片を使用した新しい移植分野を描写しています。この外科的方法論的プロトコルは、同所性マウス後肢移植モデルにおける超微小血管吻合のための非縫合カフ技術の使用を示しています。このモデルは、固形臓器移植における確立されたパラダイムと、さまざまな異なる組織成分からなる新しい移植形態との比較を特に可能にします。ユニークなことに、このモデルは、免疫受容と拒絶のバランスに有益な効果を発揮する可能性のある生存可能な血管新生骨髄コンパートメントとニッチの移植を可能にします。この技術は、同種抗原の認識と同種移植片の拒絶反応と受容を調査するツールを提供するだけでなく、この新しい移植分野をさらに前進させるための機能的神経再生研究の追求を可能にします。

非縫合カフ技術を用いて、マウスモデルにおいて血管新生複合同種移植を行うと、 図1に示すように優れ、長期間の移植および動物の生存を達成することができる。また、血管新生合成の緩やかな同種移植片拒絶反応の再現可能な結果を得るための信頼できる方法を表します。などの同種移植は、 図2に示されている画像によって文書化。拒絶を受けた動物から得られた組織のH＆E組織学はさらに、このマウスモデル（ 図3）に同種移植片拒絶反応の再現性のダイナミクスを強調しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53483/53483fig1.jpg" /> すべての同系transplながら[C57BL6（H2K b）はへのBalb / C（H2K d）は]完全H2...

超微小血管吻合のための非縫合カフ技術を適用したマウスにおける同所後肢移植のためのこの新規モデルは、血管新生複合同種移植（VCA）に関連したin vivoでのメカニズムの免疫学的研究のための強力なツールを提供します。

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

この指導ビデオの全体的な目的は、超微小血管吻合のための非縫合カフ法を用いた、マウスの同所性後肢移植モデルを紹介することです。動物モデルはヒトの疾患の理解と治療において極めて重要であり、過去20年間にわたり再建移植が臨床的に実現するための道を切り拓いてきました。この特定のモデルは、血管柄付き複合同種移植片に特有の同種免疫反応の病態生理に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、非縫合カフ法によって、この超微小血管手術の複雑さを大幅に軽減し、成功率を高めることができる点にあります。足指へのピンチ刺激で適切な鎮静レベルにあることを確認した後、ドナー動物の後肢と鼠径部の除毛を行います。次に、10%ポビドンヨードで皮膚を消毒し、マウスを解剖顕微鏡の下に配置します。ハサミを用い、大腿部中央より近位の鼠径部皮膚を切開し、ドナー肢の採取を開始します。切開線を円周状につなげて、後肢を体の残りの部分から切り離します。その後、大腿動脈、静脈、および神経を同定して剥離します。次に、ピンセットとマイクロシザースを用いて3つの構造を分離します。手技の成功を確実にするためには、ノータッチテクニックを用いて血管壁への微小外傷を防ぐことが不可欠です。血管茎の剥離が完了したら、マイクロシザースを用いて鼠径靱帯で血管を切断します。個別の腹側および背側の筋肉群を大腿部の中ほどまで切り分け、移植片をドナー動物から切り離します。次に、大腿骨シャフトの中央で大腿骨を切断します。33ゲージの針を装着したシリンジを用い、採取した肢に2 mlのヘパリン添加4 °C生理食塩水をフラッシュします。次に、個々のポリイミドカフを大腿静脈と大腿動脈に装着します。そして、移植片を濡れた脱脂綿で包み、ペトリ皿に入れて4 °Cで留置するまで保存します。擬似血管をポリイミドカフに固定する工程が、本処置において最も重要なステップとなります。不適切な結紮は血流を損なう可能性があり、また不適切な組織圧迫は一部の抗生物質組織を露出し、血栓形成の可能性を高めることがあります。レシピエントの後肢を摘出するために、温 saline 0.3 ML を腹腔内に注入します。後肢の周囲に円周状の切開を加え、先に示した通りに大腿動脈、静脈、および神経を同定し、剥離します。血管茎の剥離が完了したら、鼠径靭帯部位で大腿血管をクランプします。次いで、浅腹壁動脈の遠位側で血管を切断します。続いて、太もものほぼ中央で腹側および背側の各筋肉群をさらに切断し、ドナーの後肢を受容動物から完全に分離します。次に、大腿骨幹の中央で大腿骨を切断します。その後、20ゲージの脊髄針を髄腔内ロッドとして使用し、レシピエントと移植片の大腿骨を、本来の後肢の位置に合わせて整列させます。ドナーとレシピエントの大腿骨を接続します。吸収性縫合糸を用いて、腹側および背側の筋肉群を接合します。このアライメントを正確かつ迅速に行うことで、骨腔からの持続的な出血を防ぐことができます。大腿血管を接続するには、血管のレシピエント側をポリイミドカフの上に引き寄せます。次に、10-0ナイロン縫合糸を用いて、受容血管をカフに周方向の結紮で固定します。血管が安定したら、クランプを解除してください。そして、カフが誤って回転していないことを視覚的に確認します。止血が十分であることを目視で確認し、出血点がある場合は電気凝固器を用いて止血します。その後、非吸収性ナイロン縫合糸で皮膚を閉鎖します。動物が完全に回復するまで観察を続けてください。この非縫合カフ法を用いたマウスモデルでの血管付き複合同種移植の実施は、優れた長期的な移植片および動物の生存率の達成を容易にします。さらに、画像で示されている通り、この手法は、段階的な同種移植片拒絶反応の再現可能な結果を得るための信頼性の高い方法であり、血管付き複合同種移植モデルを構築する手段となります。実際に、拒絶反応を起こした動物から採取した組織の組織学的解析により、このマウスモデルにおける同種移植片拒絶反応の再現性のある動態がさらに裏付けられています。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、90分から120分で完了させることができます。この手順を行う際は、組織の取り扱いに細心の注意を払い、いかなる出血も避けることが重要です。この手法の開発により、再建移植分野の研究者に新たな道が開かれることが期待されます。血管化複合同種移植の同種免疫に関する基本的なメカニズム上の問題を探索すること。このビデオを視聴することで、マウスにおける正位後肢移植のすべての重要なステップをどのように実施するかについて、十分な理解を得ることができます。

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Medicine

医学

マウス異所性心臓移植モデルは、拒絶反応や免疫応答のメカニズムを研究するための重要な方法であると多くの研究者によって証明されています。しかし、関係する技術はまだ厳しいです。標準的な技術を変更することにより我々は1000以上の移植で成功を収めている。...

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ここでは、ゴールドスタンダードと思われる同所性ラット後肢移植の手順を、説明します。...

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我々は、マウスからの腹部大動脈の部分がちょうど同種もしくは同系レシピエントにおける腎動脈下に同所移植する技術が記載されている。この手法は、均一な大きさの大きな動脈の移植が有利と認められる研究に役立つことがあります。...

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マウスの心臓の異所性移植のための顕微手術のための技術が実証されています。これには、ドナー採取とレシピエント血管の吻合のための簡略化された方法が含まれています。...

異マウスハートTransplantion用に変更する方法

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次のステップを踏む:ラットの機能回復を最大化するための神経凝集整体交位後肢移植モデル

本論文は、ラットにおける部分的な異所性骨髄性骨切りばん移植プロトコルと、中期的なフォローアップにおけるその潜在的な結果を提示する。...

ラットにおける部分的な異所性後肢移植モデル

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マイクロコンピュータ断層撮影血管造影を用いたマウスの同所性肝移植の成功

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マウスにおける異所性後肢から頸部への移植:血管化複合型アロ移植の超顕微外科モデル

このプロトコルは、マウス頸部心臓移植のための簡略化された端側縫合吻合技術を提示し、移植免疫学の研究において堅牢かつ再現性の高いモデルを提供します。...

エンドツーサイド吻合技術を用いた子宮頸部ヘテロトピオマウス心臓移植による移植免疫学の研究

学ぶマウス同所後肢移植の非縫合カフ法による超微小血管吻合技術。血管化複合同種移植における同種免疫応答の研究に有用なモデルです。

マウスで同所後肢移植

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