生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

この方法の全体的な目標は、可視光パルスによる刺激による細胞膜電位を制御することです。光伝達プロセスは、感光性共役ポリマーによって媒介されます。この方法は、光遺伝学や生細胞活動の光学的制御のための熱刺激などの既存の方法に代わる貴重な方法であるため、テクノロジー分野で新しいツールを提供します。

この技術の主な利点は、あらゆる電気生理学者のタイプとの迅速な積分性、潜在的に高い特殊および時間分解能であり、侵襲性を低下させます。さらに、光遺伝学に必要な遺伝子導入を回避することができます。ここでは、in vitro細胞培養の光刺激について、当社の方法について述べる。

しかし、それはまた、in vivoアプリケーションのための興味深い機会を開くかもしれません。この手順を実演するのは、Caterina BossioとSusana Vaquero Morataが、それぞれ生物化学と物理化学のバックグラウンドを持つ研究室のポスドクです。まず、クロロベンジン中のP3HTとPCBMを1対1の相対濃度で混合することにより、感光性共役ポリマーの溶液を調製します。

溶液をマグネチックスターラーと60°Cで少なくとも4時間混合します。次に、脱イオン水、アセトン、およびイソプロパノールをソニケーターで連続10分間浴して、酸化インジウムスズでコーティングされたスライドガラスを洗浄します。カバースリップを窒素ガンで乾燥させた後、プラズマクリーナーで基板を処理します。

きれいになったら、スライドをスピンコーターのチャックにセットし、ITOコーティング面を上に向けてください。次に、150マイクロリットルのP3HT PCBM溶液をスライドに加え、サンプルをスピンコートします。スピンコーターが完成後、サンプルを取り出し、アセトンに浸したクリーンルームスワブを使用して基板の裏側を清掃します。

光活性基質を蓋付きの耐熱容器に入れ、120°Cで2時間加熱して滅菌します。次に、サンプルを滅菌フードに移し、冷まします。この時点から、サンプルの無菌性を維持します。

光活性基板を6ウェルプレートに入れます。共役ポリマー層の疎水性を考慮して、ポリジメチルシロキサンウェルを作成してサンプルを固定し、添付のテキストプロトコルに記載されているように溶液を閉じ込めます。次に、光活性基質をプレートのウェルに入れ、各サンプルの全表面をPBS中のフィブロネクチンの溶液1リットルあたり2ミリグラムの500〜750マイクロリットルで覆います。

サンプルを摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、ガラスピペットを使用してフィブロネクチン溶液を除去し、次に基質を2ミリリットルのPBSで一度洗浄します。まず、ウェルあたり750〜1,000マイクロリットルの総量を完全な成長培地に加えます。

次に、光活性基質の平方センチメートルあたり15,000個のAGK293細胞を各ウェルにプレートします。その後、細胞を24〜48時間インキュベートします。細胞は、フィブロネクチンのような適切な接着層が沈着している場合、光活性基質上で容易に培養することができます。

まず、付属のテキストプロトコルに記載されているように、細胞外溶液と細胞内溶液の両方を調製します。溶液を0.2ミクロンのフィルターに通して滅菌します。次に、細胞外溶液を摂氏37度の水浴に入れて予温します。

また、1ミリリットルの注射器に細胞内溶液を充填し、34ゲージの針を装備します。ATPの分解を避けるために、細胞内溶液を氷と接触させてください。次に、インキュベーターから細胞被覆基質を取り出し、PDMSを慎重に取り出します。

次に、ガラスピペットで増殖培地を取り出し、細胞の剥離を避けるために細胞外溶液でサンプルをゆっくりとすすぎます。各ウェルに3ミリリットルの細胞外溶液を加え、プレートを電気生理学ステーションのサンプルホルダーに移します。所定の位置に配置されたら、参照電極をテスト対象のウェルにセットします。

次に、マイクロピペットプーラーを使用して、パッチクランプ用の新しいガラスマイクロピペットを準備します。ピペットの半分を細胞内溶液で満たします。マイクロマニピュレーターを使用して、選択した細胞膜にパッチピペット

位置決め中は、チップに汚れが付着しないように、ピペットに過圧をかけてください。ピペットを細胞から数ミクロン上に置いた状態で、パッチ制御ソフトウェアでピペットの抵抗を抑えながら、ピペットを細胞膜に向かって下げ始めます。ピペットの抵抗が約1メガオーム増加したら、過圧を取り除き、ピペットと細胞膜の間にギガシールを形成するために、穏やかに吸引します。

次に、負の40ミリボルトの負電位をピペットに印加して、シールを安定させます。ピペットの容量による容量性の過渡現象を、パッチアンプおよび/またはパッチ制御ソフトウェアの相対コマンドで補償します。メンブレンを破り、細胞質への電気的アクセスを可能にするために、ピペットに短時間で強力な吸引インパルスを加えます。

次に、パッチアンプを電流クランプモードに設定して、セルに電流が注入されないようにします。電流クランプモードでは、細胞膜電位を追跡し、安定するまで数分待ちます。安定したら、細胞の下の光活性膜を450〜600ナノメートルの範囲の光で照らすことにより、所望の照明プロトコルを細胞に適用します。

膜電位に対する光の影響を記録します。約10〜20ミリ秒の短い光パルスは、細胞の一時的な脱分極をもたらしますが、数百ミリ秒程度の長時間の照明が持続すると、光がオフになるまで双曲線化が観察されます。光活性基質によって媒介される細胞の光刺激は、光刺激の持続時間に応じて、細胞膜に異なる影響を与える可能性があります。

ここに示すような高速スパイクの後には、数十ミリ秒のオーダーで一時的な脱分極が続きます。光のパルスが短い場合、光がオフになると、反対の動作が観察されます。これらの信号は、光吸収後の局所的な加熱による膜容量の変動に起因しています。

長時間の照明では、最初の脱分極が細胞の過分極に変わります。この現象も熱起源ですが、この場合、温度の上昇によってイオンチャネルの導電率が変化することによる膜平衡ポテンシャルの変化に関連しています。この技術は非常に柔軟性があり、例えば、光毒性ポリマー、製造プロセス、または照明プロトコルを変更することにより、特定の実験の特定のニーズに適応できることに注意することが重要です。

ただし、プロトコルを変更する前に、まず、その生体適合性、滅菌プロセスへの適合性、電気化学的および時間的安定性など、活性ポリマーの重要な特性を確認する必要があります。このビデオを見れば、結合ポリマーと生細胞との間のハイブリッド界面を実現する方法と、それを細胞活動の光学制御に使用する方法について十分に理解できるはずです。この技術は、in vitro研究のための神経科学の補完的なツールとなり、また、in vivoアプリケーションへの新たな視点を開くことも約束すると信じています。

しかし、プロトコルを洗練させるためには、材料科学者と神経科学者、物理学者、医師による強力で共同の努力が不可欠です。