Name: 新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 学ぶ新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル。背側椎弓切除術と修正Yasargilクリップを用いて再現性のある損傷を誘導し、適応的可塑性と機能回復のメカニズムを神経科学の観点から解明する。この手法は治療開発への重要な知見を提供する。

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この作業は、南東ノルウェー地域保健局（JLB, 2014119;JCG、プロジェクト番号2015045および2012065)、ノルウェー研究評議会(JCG、プロジェクト番号23 00 00)およびオスロ大学による。

この実験プロトコルは、欧州連合（EU）動物管理規則（連邦欧州実験動物学協会）に準拠したノルウェーの国立動物研究機関（Forsøksdyrutvalget、地元の実験承認番号12.4591）によって承認されています。努力が使用される動物の数およびそれらの苦痛を最小限にするために行われました。この記事では出生後（P）1日目の野生型ICR（インプリンティング制御領域）マウス（Jackson、USA）上で使用される手順が記載されているが、同じアプローチは、後の段階で使用することができます。 1.新生児マウス（図1）のためにガス麻酔システムの構築<ol><li>注射器の先端から鼻マスクをビルドします。プラスチック管（ -赤いチューブ及び図2A1 図1）との3方活栓にこれを接続します。 </li><li>鼻マスクの側面に小さな穴をドリルからのガスのオーバーフローを除去するためにプラスチック製のチューブにこれを接続しますマスク。チューブのいずれかのわずかな負圧に設定された真空ポンプで、またはヒュームフード（ -明るい緑色のチューブ図1）でを終了します。 </li><li> 150ミリメートル×25ミリメートルのプラスチックシャーレ（ 図2A2）から麻酔室を作ります。 <ol><li>片側には、マウスの頭と鼻マスクを収容するのに十分な大きさの穴を作ります。 </li><li>反対側、及び鼻マスクからプラスチック管を挿通可能な2つのより小さな穴（ -それぞれ赤色と明るい緑色のチューブ、 図1）を作ります。 </li><li>蓋の上に第3ホールを作成し、これに真空ポンプ（ 図1 -暗緑色のチューブ）で終わる第三プラスチックチューブを取り付けます。この第3チューブの目的は、鼻マスクからの出口によって捕獲されていない余分なガスが除去されることを保証することです。 </li></ol></li><li> Cに十分な大きさラボ皿の任意の種類の底に穴を作ることによって、睡眠室を構築しますマウスontainと滑らかであってもエッジを持っている（皿の開口部は、ガスの漏洩を防止するためのテーブルと同一面に位置しな​​ければなりません）。プラスチック管（ -茶色のチューブ図1）との3方コックにチャンバー内の穴を接続します。ヒュームフードの下で睡眠室を置きます。 </li><li>気化器（ -黄色のチューブ及び図2A3 図1）からの出口管に3方活栓を接続します。 </li><li>酸素供給（ -青チューブ図1）に気化器の入口を接続します。 </li></ol>圧縮ツールを作成するYasargil一時瘤ミニクリップの2変形例（図2、表1） <ol><li>クランプ付き、スタンドにしっかりとクリップを貼り付けます。研ぎ石を使用して、約150μmの最終的な厚さに各クリップのブレードの先端の外表面を下にファイル、視覚的な制御のための双眼ルーペを使用すると、ドリル（ 図2BおよびC）に搭載されました。 </李&gt; <li>マイクロナイフ（ 表1）を使用して、実体顕微鏡下でポリエチレン毛細管（ 表1）の短いストレッチを切断することにより、クリップのストッパーを行い、ブレードの1つでこれを置く（ 図2A4及び図2BおよびC 図 ）。これは、クリップの完全な閉鎖を防止し、標準化された圧縮寸法を作成します。クリップが閉じられたときにブレード間の距離は約230μmです。ブレード間のスペースを変更するであろう使用中に圧縮することができるポリエチレン材料、などの各実験のための新たなストッパーを作成します。 注：クリップのばね張力は、時間の経過とともに減少する約80圧縮後のクリップがもはやストッパを完全に閉じて交換する必要があるようにします。 </li></ol>手術前に3.準備<ol><li>睡眠室（ 図1）にマウスを置き、4％イソフルラン（ 図2A5で麻酔を開始</strong&gt;）気化器（ 図2A3および表1）を用いて、純酸素で気化。 </li><li>軽く薄いプラスチックピンセットで指の間の皮膚のウェブをつまんで、マウスの引っ込め反射をテストします。新生マウスを簡単に負傷しているように慎重にこれを行います。即時のあ​​ざであまりにもハードな結果をつまん。鎮静の開始時に、このテストを実行すると、反射を誘発し、必要な力の量の良好な指標を提供します。 </li><li>反射が廃止されると、睡眠室からマウスを削除し、純酸素（ 図1）で混合し、4％イソフルランの連続的な供給を提供する鼻マスクに挿入された鼻と手術台にうつ伏せに置きます。温暖化パッドは致命的なことができ、手術中に低体温として37から38℃にオンになり、設定されていることを確認してください。 </li><li>完全な鎮痛を達成するために、（皮下局所麻酔薬ブピバカインの50μLを注入2.5 mg / mlで、 <stronグラム&gt;手術部位で図2A6）9-T11）（ここで報告した実験では、これは胸部レベル（Tです）。注入を行うためにインスリン注射器（300μlを、30 G、 図2A7および表1）を使用します。 </li><li>百分の1から2に鼻マスクに配信イソフルラン濃度を低下させます。 </li></ol> 4.背側椎弓切除<ol><li>顕微鏡制御下で手術を行います。 </li><li>少なくとも30秒間、グルコン酸クロルヘキシジン（ 表1＃19）で手術エリアを清掃した後、マイクロナイフ（ 図2A8）を使用して、T9-T11で1〜2ミリメートル横皮膚切開を行います。 注：ICR新生児マウスで胃の吻側部分を、それは牛乳が含まれている目に見えるとき、椎レベルT12-T13（ 図3）に直面しています。別のランドマークは、約T8-9で終了胸部皮下脂肪組織集合体の吻側部分です。このランドマークは、皮膚切開後にのみ表示されます。 </li><l私&gt;使用鉗子（ 図2A9及びA10）（肌が滑らかで、まっすぐに傷を作成し、簡単に涙）吻側および尾側優しく肌を引いて、8〜9ミリメートルに横方向に皮膚の開口部を広くします。これは、脊柱への十分な横方向のアクセスを提供します。 </li><li>切開部に皮下吻側および尾側止血ゼラチンスポンジ（ 図2A11および表1）の無菌部分を挿入することにより、構造を根底から皮膚切開の縁を撤回。これは、開口部を拡大し、手術中にエリアを後退し、不明瞭から肌を防ぐことができます。止血ゼラチンスポンジは、使用前に生理食塩水に浸しする必要はありません。 </li><li>背骨を公開するには、薄いはさみ（ 図2A12、および表1）を使用して、傍脊柱筋を解剖。脊柱に筋肉の添付ファイルをカットし、ラミナ（ 図4A）を公開します。しませんeはまた、この段階での脊髄プロセスが未発達であること。 </li><li>正中線を特定し、薄いはさみ（ 図4B）と（この段階では軟骨である）2薄層の間に横方向に切断。ラミナおよび硬膜（ 図4C）との間に薄い鉗子の1のブレードを慎重に配置し、鉗子でラミナをつかみ、片が離れて破断するまで慎重に持ち上げ、（ 図4D）は無傷の硬膜を残します。 1-2セグメント長い椎弓切除を得るために、この2〜3回繰り返します。 </li><li>骨鉗子のような薄い鉗子を使用して、脊柱管の中にクリップを配置するために十分なスペースを得るために、両側椎間関節の部分を削除します。止血ゼラチンスポンジの小片で出血手術領域と制御を清掃してください。 </li></ol> 5.脊髄圧縮損傷<ol><li>クリップホルダー（ 図2A13および図2B）で修正された動脈瘤のミニクリップを開き、目を配置ファセットジョインとコードの間の空間における脊髄の両側に電子ブレード。ブレードは、脊髄の腹の部分に影響を与える十分深く挿入されていることを確認します。これが不可能な場合は、椎間関節の多くを削除します。 </li><li>スライドするのを防ぐために、クリップホルダーを所定の位置に保持し、速やかにミニクリップをリリース。 15秒間の圧縮を維持します。 </li><li>急速にミニクリップを開き、それを削除。前（第15秒の圧縮のために逆方向でクリップを再配置し、ミニクリップの向きを逆にし、ガイドとして第1の圧縮からの出血性浮腫によって作ら簡単に見られるマークを使用して、対称的な圧縮を達成するために、単一の圧迫がない1を行うのに対し、実験が）、これは対称組織学的および生理学的な障害を発生させることが示されました。硬膜は、圧縮によって損傷されないようにしてください。 </li><li>エリアを清掃し、止血ゼラチンスポンジの小片で止血を維持します。</li><li>手術の開始時に皮膚切開の縁の下に置かれた止血ゼラチンスポンジの部分を削除し、滅菌6.0縫合糸と針ホルダ（ 図2A14及び15）で皮膚切開を閉じます。 </li><li>皮下注入0.75 mg / kg体重ブプレノルフィンインスリン注射器（300μlを、30 G）を使用して、滅菌PBSで希釈した（図2A16）。 </li></ol> 6.術後ケア<ol><li>鼻マスクからマウスを取り外し、麻酔が切れるとマウスが（1-3時間は、典型的には十分である）アラートになるまで、30℃に設定温度制御室に配置します。 </li><li>腹腔内に母親（8グラム/ kg体重）にジアゼパム（ 図2B17）を注入します。これは、このリスクが最も高いときに、最初の夜の間に共食いの危険性を減少させる冬眠を作成します。 </li><li>ごみに操作マウスを返します。 </li><li>リターがlである場合ARGE（&gt; 12仔）は、サイズが異なる場合は、牛乳のための競争を減らすために、無操作子犬、優先的に大型動物の一部を削除します。産子数は約9子犬であれば操作仔の妊産婦ケアは、ICRラインで最高です。 </li><li>疼痛管理のために、インスリン注射器（300μlを、30 G）を使用して、術後1日の間にブプレノルフィン（0.75 mg / kg体重）皮下一日一回の投与。皮下注射のための適切な量は30から50μlです。新生児マウスの発声と攪拌では、痛みの良好な指標です。 </li><li>栄養、体重、脱水、痛み、創傷治癒、尿の保持と感染状況を評価するためにスコアシートを使用して損傷マウスの毎日の検査を行います。得られたスコアによれば、このような異常な栄養の場合には、滅菌小児栄養液（ 表1＃18）の注射剤として、特別なケアを提供。また、スコアシート0;人道的エンドポイントの基準を定義します。負傷した子犬を拒否していない母親は最高の介護者です。 </li><li>機能が回復するまで、膀胱機能障害の異常な場合には、一日二回膀胱マッサージを行います。これは、片手で仰臥位でマウスを置き、指先を使って吻側尾側方向にそっと下腹部をマッサージすることによって行われます。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

この記事では、P1マウスのクリップで生成されたSCC損傷のための手順が記載されています。同じ手順は、後の段階で行うことができます。圧縮損傷はP5、P7、P9およびP12（Züchner、 ら 、原稿準備中）で正常に実行されました。すべての出生後の段階では、全身麻酔は、純酸素中で気化イソフルランで得られるが、麻酔結果は年齢に大きく依存します。局所麻酔をプロトコルに導入される前に、P1-P4での初期の試みでは、不十分な鎮静および過剰摂取の間の狭い用量効果ウィンドウによる深いと長期の鎮静を得ることは困難でした。また、新生動物におけるイソフルランの神経毒性効果に関連する懸念は27-30を提起されています。 2-3倍のイソフルラン線量低減を可能にしながら、イソフルランとより深く、より安定した麻酔中の局所麻酔薬ブピバカイン結果の組み合わせ。 anesthe異なるタイプのSIAは31,32 cryoanesthesia含め、新生児げっ歯類のために記載されているが、cryoanesthesiaの1の潜在的な不便さは、効率的かつ再現性の損傷の発生を複雑にし得る（33,34によってレビュー）その神経保護効果を、です。バルビツール酸系麻酔が原因成人35,36よりも血清アルブミンおよび体脂肪の低いレベルに新生仔マウスでより低い効率を有すると考えられます。 非常に侵襲的および外傷が手順が確立されると、手術中の死亡率は低いです。しかし、手術マウスの回復および生存率を改善するために、特に注意が必要な手順の間の重要なステップがあります。一つの重要な問題は、手術を生き残るために最善の機会を持つことになります子犬を選択することです。ごみが大きい場合は、個々の仔の栄養状態が変化します。手術中に起こる避けられない出血に加えて、操作子犬は時間を過ごします離れて母親からだ、と彼らはしばしば翌朝前に牛乳を飲みません。すでに胃内乳の一定量を有する仔を選択することが有利です。これは、P0からP7に腹部の皮膚を通して容易に見ることができます。 最初の夜の間に操作子犬が母親によってcannibalizedされているの偉大な危険にさらされています。このモデルの初期の開発中に、より操作したマウスの半数以上は、ケージ内の血液の明確な兆候で、翌朝欠落していました。げっ歯類でNecrophagy、共食いと嬰児は何十年も37から40のために研究されてきました。本研究では、共食いは一度だけ目撃したが、ケージに戻した子犬は、夜の間に自然の原因によって死が起こりそう見えたような良い形で、一般的であったためnecrophagyよりも可能性のある説明と考えられました。これは、不安や攻撃性私を減らすためにジアゼパムなどの可逆薬剤を使用するという考えを促しましたn個（41によってレビュー）母。ジアゼパムの腹腔内注射を大幅に超える60％から20％未満に最初の夜の間に死亡率を落とし、状況を改善しました。 術後の復帰以下のできるだけごみを淘汰し、妨害することにより、ごみのサイズを小さくする手術動物に利益をもたらすことができる追加要素です。しかし、母親と一緒にのみ操作仔を残すことは有益ではありません。 /操作無操作仔のベストバランスはラインに応じて異なりますが、3-4未手術の子犬と一緒に4-5操作仔（傷害または偽）を残しICRおよびSCID-ICRマウスのために最良の結果が得られたことがあります。 一般的な意味では、この新生児のSCIモデルの主な制限は、新生児脊髄は、成人の脊髄から多くの点で異なり、したがって、成人のSCIモデルから得られたものに匹敵する実験結果を提供しないことです。このような違いは、全体のサイズが含まれており、過小表現例えば、乏突起膠細胞、未成熟な免疫応答および未熟神経回路などの特定の細胞型の脊髄の量、細胞数、。このモデルでの実験から導かれた結論は、したがって、慎重に検討する必要があります。一方、モデルは、小児SCIの比較的少ない調べシナリオに関連します。また、大人のSCIモデルに対する明白な弱点は、それが復活した場合、成人の脊髄における最低限現存するものの、治療基板を表すことができる、可塑性のメカニズムの解明を可能にすることができるように潜在的な強度もあります。新生児あるいは胚の状態の回復があまり発達した細胞または組織の移植によって、または以前の発達特性を持つ成体組織を生じる試薬で処理することによって実施することができると考えられます。ニューロン周囲網を除去するために酵素を使用すると、後者のアプローチ42,43の一例です。 例は 、離断は、片側切断は、インパクター、デバイスに影響を与えるに関してなどバルーン圧縮、鉗子クラッシュ、静的重量の圧縮は、この方向での努力がでSCIモデルをもたらした重要な側面でありますこのようなスピード、力と持続時間などの影響の複数のパラメータを操作することができる大人のげっ歯類（44によってレビュー）。別のアプローチは、以下の機器を含む、カーロッキードの動脈瘤クリップ45,46の変形例を採用しています。インパクターは、クリップ模倣同時虚血のある程度で圧迫損傷に対し、挫傷を模倣これらの2のアプローチは相補的です。そのため、実質的なサイズの制約および新生児マウスの大きい脆弱性を、より高い死亡率は、長い手術と同様のdevelのコストに関連付けられています小さい規模の装置を途上、それがインパクターで生成された挫傷のアプローチではなくクリッ​​プで生成された圧縮を開発するために選ばれました。これは、新生児のマウス1の脊柱のサイズに適応するように商業的に入手可能な動脈瘤ミニクリップを適合させることにより達成されました。ストッパーを追加すると、標準化された圧縮幅を保証し、そして限り、クリップの張力がストッパーの限界まで圧縮するよう、最小限の幅で静的フェーズの間の圧縮の力が少し変化すべきです。これは、その寿命にわたってクリップ張力が変化するにつれて変化しますので、どのような標準化されていないことは、そのダイナミックなフェーズ中の圧縮の速度です。圧縮の静的位相がダイナミック位相よりもはるかに長く続き、脊髄組織は、ミニクリップブレードに対する反の多く発揮することを示唆することはほとんどありませんように、損傷の重症度は、に最も依存している可能性があり静的位相。しかしながら、これは、試験されていません。損傷重症度は、静的圧縮力及び持続時間、圧縮および伸張の速度、ミニクリップの位置、同じサイトで実行圧迫の数を含む複数の要因に依存する可能性があります。したがって、これらのパラメータの組み合わせの変動が弱いから重度の負傷の重大度のスペクトルの発生につながる可能性があります。変動の潜在的にもかかわらず、私たちの以前に発表された研究1で、我々は組織学的、生理学的および行動のレベルで一貫性のある結果を得たので、許容可能な標準化が達成することは困難であることを示唆することはほとんどないです。私たちは、その研究で我々は、図5に示すような空気ステッピングなどの行動テストを含めて、各レベルでの検証の複数のメソッドを使用することに注意してください。 この新生児のSCIモデルでは傷害は、軸索の一定割合を惜しみ、それによって再modelinを通じて適応可塑性を誘発するための有利な状況を提供します免れ接続と新たな回路の形成のグラム。新生児マウスは、多くの実験方法による調査に適していますので、逆行し、順行性軸索トレース、免疫組織化学、電気生理学および高、行動テストを含む統合的なアプローチ、との機能回復と適応可塑性を研究するためにこのモデルを使用することが可能です-throughput光記録1。一例として、我々は、脳幹および脊髄損傷1のエクスビボホールマウント調製物における高スループットのカルシウムイメージングを使用して、特定の下り入力のレベルでネットワーク再モデリングを実証するために、この統合的アプローチを利用しました。これは、脊髄神経細胞の特定の亜集団間のシナプス結合の再形成を評価するために神経光遺伝学および光遺伝学薬理学ツールを使用して、さらに押し込むことができます。

過去10年間で、異なる脊髄損傷(SCI)モデルから得られる証拠の増加は、脊髄ネットワークが自発的に再編成して機能回復に寄与することを示しています1-9。その結果、適応可塑性はSCI研究の重要なトピックになりました。可塑性には、温存された軸索の再成長、新しい軸索側副枝の発芽、および新しいシナプス結合の形成が含まれることが示されています。この知識の多くは、成体動物の行動学的または解剖学的研究から得られています。成人の脊髄研究の重要な制限は、ハイスループットの生理学的評価を行うことの難しさであり、これは新生児の準備1で容易です。大きな違いの1つは、成体脳幹と脊髄のホールマウントex vivo調製物は生存率が低いことです。もう一つは、成体の脊椎組織は厚く、有髄であるため、光に対してより不透明であるということです。近年のin vivoイメージング(例えば、10-12参照)の進歩により、これらの問題は部分的に克服されるかもしれないが、所与の脳幹-脊髄調製物に沿った複数の部位において、任意の所望の背腹深でハイスループットイメージングを行う可能性は、現在、新生児においてのみ実現可能である。新生児脊髄における軸索髄鞘形成の未熟な状態は、ハイスループットのex vivo光学記録を容易にし、したがって、機能的なシナプス結合の動的評価を可能にする13-17。遺伝的にコードされたカルシウムレポーターや光遺伝学的刺激および薬理学ツールと組み合わせることで、光学的アプローチは適応可塑性の根底にあるメカニズムのより深い理解に貢献することができます。
すべての脊髄損傷の1-10%が乳幼児と18-22歳の子供に影響を与えると推定されています。成人の SCI とは対照的に、小児 SCI の病因と自然回復の可能性はあまり研究されていません。したがって、新生児 SCI モデルを使用すると、小児 SCI についてより深い洞察が得られ、関連する病因と回復メカニズムの理解を深めることができます。さらに、成体脊髄の機能回復を支えるSCI後の可塑性は、軸索の成長、分岐、新しいシナプスの形成など、中枢神経系の発達を支配するメカニズムと少なくとも部分的には同じメカニズムに関与していると考えられています23-26。したがって、新生児SCIモデルを使用すると、成人の脊髄でも機能するメカニズム、または成人の脊髄で回復する可能性のあるメカニズム(たとえば、胎児の細胞や組織の移植、または多能性幹細胞からde novoで構築された組織の移植など)について重要な洞察が得られる可能性があります回復を促進するために。
したがって、新生児マウスは、脊髄損傷後の適応可塑性を調査するための統合的でマルチ方法論的なアプローチのためのプラットフォームを提供します。そこでは、行動的、生理学的、解剖学的、分子的、遺伝的方法の組み合わせを容易に使用することができます。標準化された新生児損傷モデルを確立することは、このような研究を実施するための重要なステップです。

<table><tbody><tr><td>プラスチックシリンジ(30または50&nbsp;ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックシャーレ(150 x 25&nbsp;mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortecイソフルラン気化器</td><td>Cyplane</td><td></td><td>私たちは生産から古いデバイスを使用し、新しいデバイス</td></tr><tr><td>Yasargil一時的な動脈瘤ミニクリップ</td><td>&AEligのリンクを確認してください。スキュラップ</td><td>FE681K</td><td></td></tr><tr><td>ファインボアポリエチレンチューブID 0.58&nbsp;mm、外径0.96&nbsp;mm</td><td>スミスメディカル</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン (フォレン)</td><td>Abbott GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marcain (Bupivacain)</td><td>アストラゼネカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン セイリンジ 0.3&nbsp;ミリリットル 30&nbsp;G×8&nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>80086-442</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラファインマイクロナイフ 5&nbsp;mm カッティングエッジ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10315-12</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイングレーフ鉗子 &ndash; 0.5&nbsp;mm先端</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1153-10</td><td>本当に必要ではない、しばしば歯が大きすぎる</td></tr><tr><td>鉗子SuperGrip</td>ストレート<td>ファインサイエンスツール</td><td>00632-11</td><td>2つの鉗子が必要です</td></tr><tr><td>Spongostan Special 70 x 50 x 1&nbsp;mm</td><td>Ferrosan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas スプリングハサミ &ndash; 2&nbsp;mmの刃のまっすぐ</td><td>な精密科学用具</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr>鉗子<td>Aesculap</td><td>FE502T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6&ndashを適用するVarioクリップ;0 (Ethicon)</td><td>ジョンソン・エンド・ジョンソン</td><td>J105G</td><td></td></tr><tr><td>ディートリッヒ マイクロ ニードル ホルダー</td><td></td><td>11-510-20</td><td></td></tr><tr><td>テムゲシック (ブプレノルフィン)</td><td>シェリング・プラウ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステソリッド (ジアゼパム)</td><td>アクタビス</td><td></td><td>別名 バリウム</td></tr><tr><td>ペダミックス</td><td>フレゼニウス カビ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジンスプリット (グルコン酸クロルヘキシジン)</td><td>フレゼニウスカビ</td><td>D08A C02</td><td></td></tr></tbody></table>

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

脊髄損傷（SCI）は、典型的には、特に脊髄脳から下降繊維に損害を与えて、壊滅的な神経障害を引き起こします。研究の主要な現在の面積は、SCI後の自発的または誘導された機能回復の根底に適応可塑性のメカニズムに焦点を当てています。自発的な機能回復は、脊髄が発展するようにどのように適応可塑性の変化についての興味深い疑問を提起、初期の生活の中で大きいことが報告されています。このダイナミックの調査を容易にするために、我々は、新生児マウスにおけるSCIモデルを開発しました。モデルが少なすぎる検討されている小児SCIのための関連性を持っています。成人における神経可塑性は、人生の早い段階1における神経可塑性と同様のメカニズムの一部を含むので、このモデルは、潜在的に大人SCIのためにも、いくつかの関連性を有することができます。ここでは、新生児マウスで再現性の脊髄圧迫（SCC）の損傷を生成するための全体手順を説明します早ければ生後（P）などの1日目SCC（ここでは胸椎レベル9-11で説明）指定された脊髄レベルで椎弓切除術を行った後、急速に脊髄を圧迫し、解凍するように変更Yasargil瘤ミニクリップを使用することによって達成されます。前述のように、損傷した新生仔マウスは、行動障害について試験または電気生理学的および高スループットの光記録技術1を用いて、シナプス接続のex vivoでの生理学的分析のために犠牲にすることができます。行動や生理的評価を使用して、以前と現在進行中の研究では、2週間以内に完了機能回復、および識別されたシナプス結合1を下降のレベルで機能回路の変化の最初の証拠が続く後肢運動性の劇的な、急性障害を実証しました。

脊髄圧迫損傷および機能喪失 術前手術と術後の手順を最適化することにより、前述したように、新生児マウスにおける再現圧縮SCIモデル1を得ることができます。クリップ（ 図2BおよびC）の1ブレード上に配置されたポリエチレンストッパーは、クリップの完全な閉鎖を防止し、約230ミクロンで一貫してブレード間の距離を保ちます。組織学的後遺症によって判断されるように、対称的な傷害に2圧縮の結果の間でクリップの向きを反転させる（ 図5Aおよび1）。すぐにミニクリップを除去した後、圧縮された脊髄組織は出血性挫傷および浮腫による暗くなります。エオシンおよびヘマトキシリン​​について染色損傷した脊髄の連続切片の観察すでに1日のA病変震源地（ 図5A）に近づいたときにFTER損傷は、組織の漸進的な劣化を明らかにする。病変における脊髄空洞または血液の存在は珍しいことではありません。 行動評価、数時間の手術後の非体重負荷条件下で後肢の軌跡を追跡することによって、例えば、唯一の椎弓切除が行われる偽対照マウスと比較してSCC損傷マウスにおける後肢運動性の劇的な障害を示した （ 図5Bおよび1） 。マウスは自重1軸受必要とする他の行動試験を行うことができるまでこの試験を繰り返すことができます。 手術後の死亡率と回復 術中死亡率は、主に無呼吸と十分なanesthesiを達成するために必要なイソフルランの高濃度によって引き起こされる心停止に起因していますA。外科的なプ​​ロトコルに局所麻酔薬ブピバカインを導入することイソフルラン濃度の低減を可能にし、それによって大幅に死亡率を減少させます。 20以上の動物を含む最近の一連の実験では、術中死亡率はゼロでした。これとは対照的に、術後生存率は、主に母親による手術マウスの受け入れに影響されます。不安や攻撃性がごみ1に操作マウスを返す前に母親にジアゼパム（腹腔8グラム/ kg体重）の単回注射を送達することにより減少したときに有意な改善が発生しました。受け入れて動作マウスの術後の回復は、胃内のミルクが存在することによってモニターすることができます。酒に酔った牛乳を持ってP1-P7マウスの胃は、腹部皮膚（ 図3）を介して、はっきりと白と表示されます。操作、シャム対照と無操作マウスでの給餌を比較すると、傷行為の栄養状態を評価するために有用ですDマウス。無操作マウスに対する操作の成長を評価することは、最初の手術後の日中少し体重減少にもかかわらず、手術マウスの成長曲線は（ 図6）、その後急速に正常化することを示しています。膀胱機能障害または感染に関連した死亡率は限り7週間のために勉強したマウスであっても認められませんでした。 <table border="1"><tbody><tr><td> 図中の番号。 2 </td><td> 名 </td><td> メーカー/プロバイダ </td><td> 参照 ＃ </td><td colspan="3"> リンク </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1 </td><td>プラスチック注射器（30または50 ml）を</td><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td>プラスチック製のペトリ皿（150×25ミリメートル） </td><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> Fortecイソフルラン気化器</td><td> Cypraね</td><td></td><td colspan="3"> http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ </td><td>私たちは、生産から使用して、古いデバイス、新しいデバイスへのリンクをチェックします</td></tr><tr><td>図4a </td><td> Yasargil一時的な動脈瘤のミニクリップ</td><td> AESCULAP </td><td> FE681K </td><td colspan="3"> http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf </td><td></td></tr><tr><td>図4b </td><td>ファインボアポリエチレンキャピラリーチューブのID 0.58ミリメートル、外径0.96ミリメートル</td><td>スミスメディカル</td><td> 800/100/200 </td><td colspan="3"> http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td>イソフルラン（Forene） </td><td>アボット社＆Co. KG社</td><td></td><td colspan="3"> http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> Marcain（ブピバカイン） </td><td>アストラゼネカ</td><td></td><td colspan="3"> http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine </td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Insulineシリンジ0.3ミリリットル30のGのx 8ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 80086-442 </td><td colspan="3"> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 </td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td>超微細マイクロナイフ5ミリメートルのカッティングエッジ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10315から12 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= キャット＆suchkatalog = 0019900000＆reloadmenu = 1 </td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td>エクストラファイングレーフェ鉗子 - 0.5ミリメートルのヒント</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 1153から1110 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= キャット＆suchkatalog = 0055700000＆reloadmenu = 1 </td><td>本当に必要ではない、多くの場合、歯が大きすぎます</td></tr><tr> &lt;TD&gt; 10 </td><td>鉗子SuperGripストレート</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 00632から11 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= キャット＆suchkatalog = 0053500000＆reloadmenu = 1 </td><td>二つの鉗子が必要です</td></tr><tr><td> 11 </td><td> Spongostan特別70×50×1ミリメートル</td><td> Ferrosan </td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> Vannas春はさみ - 2ミリメートルブレードストレート</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から03 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= キャット＆suchkatalog = 0012800000＆reloadmenu = 1 </td><td></td></tr><tr><td> 13 </td><td>バリオクリップ適用鉗子</td><td> AESCULAP </td><td> FE502T </td><td colspan="3"> http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf </td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td>ビクリル6-; 0（エチコン） </td><td>ジョンソンとジョンソン</td><td> J105G </td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td>ディートリックマイクロニードルホルダー</td><td></td><td> 11-510-20 </td><td colspan="3"> http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html </td><td></td></tr><tr><td> 16 </td><td> Temgesic（ブプレノルフィン） </td><td>シェリング・プラウ</td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 17 </td><td> Stesolid（ジアゼパム） </td><td>アクタビス</td><td></td><td colspan="3"></td><td>また、バリウムとして知られています</td></tr><tr><td> 18 </td><td> Pedamix </td><td>フレゼニウスカービ</td><td></td><td colspan="3"> http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring </td><td></td></tr><tr><td> 19 </td><td> Klorhexidinsprit（グルコン酸クロルヘキシジン） </td><td> FresenIUSカービ</td><td> D08A C02 </td><td colspan="3"> http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639 </td><td></td></tr></tbody></table> 新生児マウスにクリップ駆動型脊髄圧迫損傷を生成するためのツールと機器の表1のリスト。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig1.jpg" /> 麻酔セットアップの図1の回路図。この回路図は、最初の麻酔や手術中の継続的な麻酔用鼻マスクデバイスのための睡眠室で、新生児マウス用に設計された麻酔の設定を提示します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig2.jpg" /> 図2.主なツールと圧縮クリップ。（A）処置の間に使用するツール。数字は表1。（B及びC）を手動で約150μmの厚さにまでトリミングされた各ブレードの先端とYasargil一時的な動脈瘤ミニクリップで使用される注釈に対応しています。ポリエチレンチューブ（ 表1）のスライス製の栓は、クリップの完全な閉鎖を防止するために、ブレードの1つに配置されています。スケールバー：2ミリメートル。アプリ：クリップアプリケータ（A中＃12）。聖：ストッパー<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig3.jpg" /> 新生児のICRマウスにおける脊髄レベルの術前評価図3.ランドマーク。（A）の中に白いミルクP1 ICRマウスの側面図<html> tomach。胃の吻側部分はT12-T13脊髄レベルに相当します。 （B）腹臥位で麻酔下P1 ICRマウス。 （A）よりも視覚化することがより困難であるが、ミルクを充填した胃が認識可能です。胃の吻側部分はT12-T13脊髄レベルを示しています。スケールバー：0.5センチメートル。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig4.jpg" /> 図4.背側椎弓切除。傍脊椎筋の（A）解剖。この歳で脊髄プロセスが未発達であることに注意してください。 （B）細いハサミで薄層の横方向切片。 （C）ラミナと硬膜の間に薄い鉗子の1のブレードの導入。エントリポイントは、矢印で示されています。 （D）薄層を除去します。スケールバー：2ミリメートル。 ファイル/ ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg &quot;/&gt; P1における脊髄圧迫損傷後の図5.組織学的および行動の成果。負傷したマウスからの脊髄切片中の（A）エオシン及びヘマトキシリン染色（損傷後1日）傷害震源から異なる距離にあります。 （B）は、前肢と後肢の軌跡の代表的なトレースが損傷後または偽制御椎弓切除後6時間を観察しました。トップのパターンは、動物の側面図から見た軌跡を表します。下部のトレースは、動物の腹側面から見た軌跡を表します。また、1を参照してください。スケールバー：250μmで。 DH：背ホーン; L、左; R：右; SCC：脊髄圧迫。 VH：前角<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <imgのALT = &quot;図6&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53498 / 53498fig6.jpg&quot; /&gt; 図6.比較成長曲線。ヒストグラムは、生後9日目に生後1日目から操作されないとSCC損傷マウスの体重増加を示しました。

この記事では、新生児マウスで再現可能な脊髄圧迫損傷(SCI)を生成する方法について説明します。このモデルは、自発的な機能回復の根底にある適応可塑性のメカニズムを研究するための有利なプラットフォームを提供します。

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

本手順の全体的な目的は、新生マウスにおいて再現性のある脊髄圧迫損傷を再現することです。まず、マウスを深く麻酔し、次いで背側椎弓切除術を行って脊髄を露出させることでこれを達成します。そして最後に、圧迫損傷を作製します。私たちは最近、新生子マウスを用いた脊髄損傷モデルを確立し、新生子マウスが驚異的な程度の適応可塑性を示すことを明らかにしました。回復の根底にあるこのメカニズムを研究することは、脊髄損傷の治療に利用可能な重要な知見を提供し得ると考えられます。このビデオでは、生後1日のマウスにおいて脊髄圧迫損傷を誘発する方法を実演します。この外科的手技には、麻酔、椎弓切除術、およびクリップを用いた2回の硬膜外圧迫が含まれます。手術の準備を行います。手術は実体顕微鏡下で行います。顕微鏡の下にウォーミングパッドを設置してください。手術中の突然死を防ぐため、仔マウスを保温しておくことが極めて重要です。ウォーミングパッドの上に、手術用ブランケットまたは清潔で柔らかいラボペーパーの大きなシートを敷きます。術前鎮痛のため、滅菌PBSで希釈し最終濃度を2.5 mg/mLとした局所麻酔薬Marcaineを満たした、0.3 mLの30ゲージインスリン注射器を準備します。皮膚切開、筋肉除去および椎弓切除には、マイクロナイフ、微細ピンセット、および微細虹彩切除用鋏を使用します。ここでは、先端を曲げて歯を形成したピンセットも使用していることに注意してください。歯を非常に小さくする必要があるため、市販の有鉤ピンセットよりもこちらの方が適しています。脊髄圧迫には、後述する特別に改造したYasargil Temporary Aneurysm Miniclipを使用します。また、クリップが完全に閉じるのを防ぐためのストッパーとして、短いプラスチック製キャピラリーチューブと、クリップを装着するためのクリップアプリケーターが必要です。縫合には、ニードルホルダーと、糸を切断するための小型の鋏を使用します。疼痛緩和のためには、Temgesicを滅菌PBSで0.03 mg/mLに希釈します。脊髄損傷は、Yasargil Temporary Aneurysm Miniclipを用いたクリップ駆動圧縮法によって誘発します。使用前に、研磨石を用いてクリップのブレードの厚さを150 micrometersまで削り、機械的に修正する必要があります。手術の直前に、短いプラスチックチューブを切断し、それをクリップブレードの一方に被せます。チューブは、クリップが完全に閉じるのを防ぐストッパーとして機能します。麻酔および鎮痛。ガス麻酔には、酸素タンクに接続した気化器を使用します。イソフルランは、純酸素中で気化させる麻酔剤です。イソフルランと酸素の混合気をマウスに供給するためには、新生児に適したノーズマスクを作成する必要があります。新生児マウスは非常に小さいため、マスクはシリンジの先端で作成でき、これが気化器の出口に接続されたプラスチックチューブの入口として機能します。マスクの側面に小さな穴を開け、排気チューブを接続します。チューブの先は、回収ユニットを備えた調整可能な真空ポンプ、または単にドラフトチャンバーに繋いでください。150 × 25 mLのプラスチック製ペトリ皿を用いて、麻酔用オーバーフローチャンバーを作成します。片側に、マウスの頭が入る十分な大きさの穴を開けます。反対側に、プラスチックチューブの直径と同じ大きさの小さな穴を2つ開けます。最後に、ディッシュの上部に、他の穴よりも小さい排気用の穴を開けます。250 µL ピペットチップの先端を切り取り、この最後の穴に挿入します。ピペットチップは、わずかな負圧に設定された真空装置に接続された排気チューブのコネクタとして機能します。プラスティシンを用いて、マウスの頭用の穴のすぐ内側にマスクを固定します。テープまたはプラスティシンを使用して、プラスチックチューブをチャンバーの天井に固定し、チューブが適切な穴にしっかりと配置されていることを確認してください。チャンバーを顕微鏡下の手術用ブランケットの上に置きます。システム全体はこの概略図に示されています。気化器の出力側に三方活栓が配置されています。ここでは、スリープチャンバーへの経路が開いており、マスクへの経路が遮断されているため、マウスをスリープチャンバーに入れて鎮静を開始させることができます。3方活栓を右に回すと、ガスがマスクへ流れ、スリープチャンバーへの経路が遮断されます。この構成で、マウスをマスクへ移すことができます。オーバーフローチャンバーから真空吸引により漏れたガスを除去します。皮膚を通して白い色が確認でき、最近まで授乳していたことがわかるマウスの幼仔を選択します。幼仔を睡眠チャンバーに入れ、4%の気化イソフルランを導入して迅速に鎮静させます。幼マウスをマスクに移します。麻酔ガスに十分に曝露されるよう、マウスの鼻先をマスクの奥まで慎重に位置合わせします。3方コックを回し、ガスをマスク側に切り替えます。手術予定部位に、2.5 mg/mLのMarcaine 50 µLを皮下注射します。血管を容易に穿刺する可能性があり、血管内にMarcaineが注入されると致死的であるため、深く注射しすぎないよう注意してください。余分なMarcaineは、小さな滅菌ガーゼで拭き取ります。背側椎弓切除術。イソフルランの濃度を1〜2%に下げます。数分後、マイクロナイフで皮膚を穿刺し、皮膚を吻側から尾側に向かって緩やかに牽引しながら、8〜9 mmの切開口を作成します。転移開口（transference opening）を用いる方がはるかに便利であり、椎弓切除術を行うための側方へのアクセス性も向上します。切開部位の吻側および尾側の皮下にスポンジスタティンを挿入し、皮膚切開の端を下の組織から剥離させます。細い剪刀で椎前筋を切断し、脊椎を露出させます。新生児では脊椎突起が十分に発達していないことに注意してください。正中線を特定し、細い鋏を用いて椎弓を横方向に切断します。深く切りすぎると、硬膜や脊髄を損傷する可能性があるため、注意してください。細いピンセットの片方の先端を、椎弓と硬膜の間に慎重に挿入します。ピンセットを閉じて椎弓を掴み、硬膜を傷つけないように注意しながら、剥離するまで慎重に持ち上げます。この手順を2〜3回繰り返し、1〜2セグメントの椎弓切除を行います。スポンジスタチンの小片を用いて止血します。細いピンセットをロンジュールとして使い、椎管内に modified aneurysm miniclip を配置するための十分なスペースを確保するため、両側の椎間関節の一部を除去します。この工程ではしばしば出血が発生しますが、スポンジスタチンの小片を用いて止血することが可能です。視認性を向上させるために、37 °Cの温めた滅菌PBSで洗浄することが時に有効です。脊髄圧迫損傷を誘発します。クリップを開き、関節突起と脊髄の間の隙間に、脊髄の両側にブレードを配置します。ブレードが脊髄の腹側を十分に包含するように深く挿入されていることを確認します。クリップが後方に滑るのを防ぐため、アプリケーターを固定したまま、迅速にクリップを閉じます。15秒後、迅速にクリップを解除します。スポンジスタチンを用いて傷口を清浄にする。対称的な圧迫を実現するため、ブレードを反転させ、反対方向に15秒間2回目の圧迫を行う。縫合。手術開始時に皮膚下に配置したスポンジスタチンの破片を取り除き、6.0縫合糸で皮膚を閉鎖する。30ゲージのインスリン用注射器を用いて、0.03 mg/mLのTemgesicを0.05 mL皮下注射し、幼仔を30 °Cに制御された環境に数時間安置する。手術後、初夜に術後の幼仔に対する母親の攻撃的な行動を抑制するため、クリーンなPBSで希釈した0.1 mg/mLのDiazepam溶液を調製し、8 g/kgの用量で腹腔内投与する。結果。このグラフに示されているように、脊髄圧迫から6時間後、下部胸髄レベルにおいて、損傷したマウスの後肢は麻痺していますが、前肢は麻痺していません。椎弓切除術のみを受けたシャム対照動物の場合、後肢と前肢の両方が高い可動性を示しています。脊髄の切片では、損傷部位に残血が認められます。さらに、組織が半透明になっており、これは組織の消失を示唆しています。これにより、数日後に空洞が形成されることがよくあります。結論として、このビデオを視聴することで、新生子マウスにおいて脊髄圧迫損傷を誘発する方法について十分な理解が得られたはずです。新生子マウスを用いる利点は、成体マウスでは適用できない、適応的可塑性を検討するための特定の手法を利用できる点にあります。さらに、このモデルは幹細胞移植などの治療アプローチを検証するためのプラットフォームを提供します。

a-neonatal-mouse-spinal-cord-compression-injury-model

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典:Elzat, E. Y. Y., et al., Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique.J. Vis. Exp.

脊髄損傷同軸プラットフォームを使用したマウスモデルにおける脊髄挫傷の誘発

出典:Lakshman, N., et al.A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenus Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp.

神経幹細胞の活性化と移動を研究するための最小限の脊髄損傷モデル

出典:Kumar, S., et.al. 脊髄損傷後の褥瘡のマウスモデル。J. Vis. Exp.

脊髄損傷のマウスモデルの生成

脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。...

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マウスにおける完全なトランセクション型脊髄損傷の誘導

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マウスの中枢索症候群(CCS)をシミュレートする本プロトコルは、解剖学的構造を過度に破壊することを回避し、実験動物への再現性を向上させ、操作の損傷を最小限に抑えました。この研究の戦略は、一貫した結果を生み出すことで損傷メカニズムの研究を可能にするという点で有利です。...

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新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

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