新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

この手順の全体的な目標は、新生児マウスで再現可能な脊髄圧迫損傷を行うことです。これは、最初にマウスに深く麻酔をかけることによって達成されます。次に、背側椎弓切除術を行い、脊髄を明らかにします。

そして最後に、圧迫傷害を作ることによって。私たちは最近、脊髄損傷の新生児マウスモデルを確立し、新生仔マウスが驚くべき適応可塑性を示すことを実証しました。回復の根底にあるこのメカニズムを研究することは、脊髄損傷の治療に使用できる可能性のある重要な洞察を提供する可能性があります。

このビデオでは、生後1日齢のマウスで脊髄圧迫損傷を行う方法を示します。この外科的処置には、麻酔、椎弓切除術、2つのクリップによる硬膜外圧迫が含まれます。手術の準備。

手術は実体顕微鏡下で行われます。顕微鏡の下に保温パッドを置きます。手術中の突然死を避けるために、子犬を暖かく保つことが重要です。

サージカルブランケットまたは清潔で柔らかい実験用紙の大きなシートを保温パッドの上に置きます。術前鎮痛のために、局所麻酔薬であるマルカインを充填した0.3ミリリットル30ゲージのインスリン注射器を準備し、滅菌PBSで希釈し、最終濃度を1ミリリットルあたり2.5ミリグラムにします。皮膚の切開、筋肉の除去、椎弓切除には、マイクロナイフ、細い鉗子、細かい虹彩切除はさみを使用してください。

ここでは、先端を曲げて歯を形成した鉗子も使用していることに注意してください。これらは、歯が非常に小さい必要があるため、市販の歯付き鉗子よりもうまく機能します。脊髄の圧迫には、後で説明する特別に改造されたYasargil Temporary Aneurysm Miniclipを使用します。

クリップが完全に閉じないようにするためのストッパーと、クリップを配置するためのクリップアプリケーターを作るために、短い長さのプラスチックキャピラリーチューブも必要です。縫合には、ニードルホルダーと小さなハサミを使用して糸をカットします。痛みの治療には、テムゲシックを滅菌PBSで0.03ミリグラム/ミリリットルに希釈します。.

脊髄損傷には、Yasargil Temporary Aneurysm Miniclipを使用したクリップ駆動の圧迫が含まれます。使用する前に、砥石を使用してブレードの厚さを150マイクロメートルにトリミングすることにより、クリップを機械的に修正する必要があります。手術の直前に、プラスチックチューブを短く切り取り、クリップブレードの1つに置きます。

チューブは、クリップが完全に閉じるのを防ぐストッパーとして機能します。麻酔と鎮痛。ガス麻酔には、酸素ボンベに接続されたスープラン気化器を使用します。

イソフルランは、純粋な酸素で気化される麻酔薬です。イソフルラン、酸素混合物をマウスに配布するには、新生児に適応した鼻マスクを作成する必要があります。新生児マウスは非常に小さいため、マスクは注射器の先端から作ることができ、注射器は気化器の出口に接続されたプラスチックチューブの入口として機能します。

マスクの側面に小さな穴を開けて、排気管を接続するための穴を開けます。排気管は、調整された真空ポンプ、収集ユニット、または単にヒュームフードで終わります。150 x 25ミリリットルのプラスチック製ペトリ皿を使用して麻酔オーバーフローチャンバーを作成します。片側に、マウスの頭に十分な大きさの穴を開けます。

反対側に、プラスチックチューブの直径の小さな穴を2つ開けます。最後に、皿の上部に他の穴よりも小さい避難穴を作ります。250マイクロリットルのピペットチップの先端をカットし、この最後の穴に挿入します。

ピペットチップは、わずかな負圧に設定された真空装置に接続された排気管のコネクタとして機能します。粘土を使用して、マウスの頭の穴のすぐ内側にマスクを固定します。テープまたは粘土を使用して、プラスチックチューブをチャンバーの天井に固定し、チューブが適切な穴に適切に配置されていることを確認します。

チャンバーを顕微鏡下の手術用ブランケットの上に置きます。この回路図では、システム全体を表しています。気化器の出力には三方活栓が配置されています。

ここでは、睡眠室への経路は自由ですが、マスクへの経路はブロックされ、マウスを睡眠室に配置して鎮静を開始できます。三方活栓を右に回すと、ガスがマスクに流れ込み、睡眠室への道が塞がれます。この構成では、マウスをマスクに転送できます。

ガスの漏れは、オーバーフローチャンバーから真空によって除去されます。皮膚を通して見える白い色によって証明されるように、最近牛乳を飲んでいるマウスの子犬を選択します。子犬を睡眠室に入れ、気化したイソフルランを4%に導入して、迅速な鎮静を実現します。

子犬をマスクに移します。マウスの鼻をマスクの中にしっかりと配置して、麻酔ガスに十分にさらされるようにします。三方向ストップコックを回して、ガスをマスクに向けます。

50マイクロリットルのマルカインを1ミリリットルあたり2.5ミリグラムで、手術の所望の部位に皮下注射する。血管が簡単にヒットし、血管へのマルカインの導入は致命的であるため、深く注入しすぎないように注意してください。余分なマルカインを小さな滅菌湿布で拭き取ります。

背側椎弓切除術。イソフルラン濃度を1〜2パーセントに下げます。.数分後、マイクロナイフで皮膚に穴を開け、吻側尾方向に皮膚を優しく引っ張って8〜9ミリメートルの転移開口部を作ります。

トランスファー開口部ははるかに便利で、椎弓切除術を行うためのより良い横方向のアクセスを提供します。スポンギスタチンの断片を挿入することにより、皮膚切開部の端を下部組織から引っ込め、皮下吻側および尾側を切開部に挿入します。細いハサミで椎骨筋を切って背骨を露出させます。

新生児では、脊椎の突起が完全には発達していないことに注意してください。正中線を特定し、細いハサミで椎弓板を横方向に切ります。深く切りすぎると、硬膜や脊髄にまで損傷を与える可能性があるため、注意してください。

細い鉗子の片方の刃を椎弓板と硬膜の間に慎重に置きます。鉗子を閉じて椎弓板をつかみ、硬膜が無傷のまま、外れるまで慎重に持ち上げます。この手順を2〜3回繰り返して、1〜2セグメントの椎弓切除術を取得します。

スポンジスタチンの小片を使用して出血を制御します。.細い鉗子をロンジャーとして使用して、椎間関節の一部を両側に取り外して、修正された動脈瘤ミニクリップを脊柱管内に配置するのに十分なスペースを確保します。このステップは、多くの場合、スポンジスタチンの小片を使用して制御できる出血を引き起こします。

視認性を向上させるためには、摂氏37度の温かい滅菌PBSですすぐことが利点となる場合があります。脊髄圧迫損傷の発生。クリップを開き、脊髄の両側のファセットジョイントとコードの間のスペースにブレードを配置します。

ブレードが脊髄の腹側部分を包み込むのに十分な深さに挿入されていることを確認してください。アプリケーターを所定の位置に保持しながら、クリップをすばやく閉じて、クリップが後方にスライドしないようにします。15秒後、クリップをすばやく離します。

スポンジスタチンを使用して傷口を洗浄します。対称的な圧縮を実現するには、ブレードを逆にして、反対方向に2回目の圧縮を15秒間実行します。縫合。手術開始時に皮下に置かれたスポンジスタチン片を取り除き、6.0縫合糸で皮膚を閉じます。

0.05ミリリットルのテムゲシックを0.03ミリグラム/ミリリットルで30ゲージのインスリン注射器で皮下に注入し、子犬を摂氏30度の温度制御環境に数時間置きます。手術後の最初の夜に手術を受けた子犬に対する攻撃的な母親の行動を減らすために、清潔なPBSで希釈したジアゼパムの溶液を1ミリリットルあたり0.1ミリグラムに調製し、1キログラムあたり8グラムで腹腔内注射を行います。.業績。

このグラフが示すように、脊髄圧迫の6時間後、胸部下部では、負傷したマウスの後肢は麻痺していますが、前肢は麻痺していません。椎弓切除術のみを受けた偽対照動物の場合、後肢と前肢の両方が非常に可動性があります。脊髄の切片は、損傷の視力で残留血液を示しています。

さらに、組織は半透明であり、組織の喪失を示唆しており、数日後に空洞が形成されることがよくあります。結論。このビデオの後、新生児マウスで脊髄圧迫損傷を生成する方法についてよく理解しているはずです。新生児マウスを使用する利点は、成体マウスでは使用できない適応可塑性に対処するための特定の方法を使用できることです。

さらに、このモデルは、幹細胞移植などの治療アプローチをテストするためのプラットフォームを提供します。