新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

本手順の全体的な目的は、新生マウスにおいて再現性のある脊髄圧迫損傷を再現することです。まず、マウスを深く麻酔し、次いで背側椎弓切除術を行って脊髄を露出させることでこれを達成します。

そして最後に、圧迫損傷を作製します。私たちは最近、新生子マウスを用いた脊髄損傷モデルを確立し、新生子マウスが驚異的な程度の適応可塑性を示すことを明らかにしました。回復の根底にあるこのメカニズムを研究することは、脊髄損傷の治療に利用可能な重要な知見を提供し得ると考えられます。

このビデオでは、生後1日のマウスにおいて脊髄圧迫損傷を誘発する方法を実演します。この外科的手技には、麻酔、椎弓切除術、およびクリップを用いた2回の硬膜外圧迫が含まれます。手術の準備を行います。

手術は実体顕微鏡下で行います。顕微鏡の下にウォーミングパッドを設置してください。手術中の突然死を防ぐため、仔マウスを保温しておくことが極めて重要です。

ウォーミングパッドの上に、手術用ブランケットまたは清潔で柔らかいラボペーパーの大きなシートを敷きます。術前鎮痛のため、滅菌PBSで希釈し最終濃度を2.5 mg/mLとした局所麻酔薬Marcaineを満たした、0.3 mLの30ゲージインスリン注射器を準備します。皮膚切開、筋肉除去および椎弓切除には、マイクロナイフ、微細ピンセット、および微細虹彩切除用鋏を使用します。

ここでは、先端を曲げて歯を形成したピンセットも使用していることに注意してください。歯を非常に小さくする必要があるため、市販の有鉤ピンセットよりもこちらの方が適しています。脊髄圧迫には、後述する特別に改造したYasargil Temporary Aneurysm Miniclipを使用します。

また、クリップが完全に閉じるのを防ぐためのストッパーとして、短いプラスチック製キャピラリーチューブと、クリップを装着するためのクリップアプリケーターが必要です。縫合には、ニードルホルダーと、糸を切断するための小型の鋏を使用します。疼痛緩和のためには、Temgesicを滅菌PBSで0.03 mg/mLに希釈します。

脊髄損傷は、Yasargil Temporary Aneurysm Miniclipを用いたクリップ駆動圧縮法によって誘発します。使用前に、研磨石を用いてクリップのブレードの厚さを150 micrometersまで削り、機械的に修正する必要があります。手術の直前に、短いプラスチックチューブを切断し、それをクリップブレードの一方に被せます。

チューブは、クリップが完全に閉じるのを防ぐストッパーとして機能します。麻酔および鎮痛。ガス麻酔には、酸素タンクに接続した気化器を使用します。

イソフルランは、純酸素中で気化させる麻酔剤です。イソフルランと酸素の混合気をマウスに供給するためには、新生児に適したノーズマスクを作成する必要があります。新生児マウスは非常に小さいため、マスクはシリンジの先端で作成でき、これが気化器の出口に接続されたプラスチックチューブの入口として機能します。

マスクの側面に小さな穴を開け、排気チューブを接続します。チューブの先は、回収ユニットを備えた調整可能な真空ポンプ、または単にドラフトチャンバーに繋いでください。150 × 25 mLのプラスチック製ペトリ皿を用いて、麻酔用オーバーフローチャンバーを作成します。片側に、マウスの頭が入る十分な大きさの穴を開けます。

反対側に、プラスチックチューブの直径と同じ大きさの小さな穴を2つ開けます。最後に、ディッシュの上部に、他の穴よりも小さい排気用の穴を開けます。250 µL ピペットチップの先端を切り取り、この最後の穴に挿入します。

ピペットチップは、わずかな負圧に設定された真空装置に接続された排気チューブのコネクタとして機能します。プラスティシンを用いて、マウスの頭用の穴のすぐ内側にマスクを固定します。テープまたはプラスティシンを使用して、プラスチックチューブをチャンバーの天井に固定し、チューブが適切な穴にしっかりと配置されていることを確認してください。

チャンバーを顕微鏡下の手術用ブランケットの上に置きます。システム全体はこの概略図に示されています。気化器の出力側に三方活栓が配置されています。

ここでは、スリープチャンバーへの経路が開いており、マスクへの経路が遮断されているため、マウスをスリープチャンバーに入れて鎮静を開始させることができます。3方活栓を右に回すと、ガスがマスクへ流れ、スリープチャンバーへの経路が遮断されます。この構成で、マウスをマスクへ移すことができます。

オーバーフローチャンバーから真空吸引により漏れたガスを除去します。皮膚を通して白い色が確認でき、最近まで授乳していたことがわかるマウスの幼仔を選択します。幼仔を睡眠チャンバーに入れ、4%の気化イソフルランを導入して迅速に鎮静させます。

幼マウスをマスクに移します。麻酔ガスに十分に曝露されるよう、マウスの鼻先をマスクの奥まで慎重に位置合わせします。3方コックを回し、ガスをマスク側に切り替えます。

手術予定部位に、2.5 mg/mLのMarcaine 50 µLを皮下注射します。血管を容易に穿刺する可能性があり、血管内にMarcaineが注入されると致死的であるため、深く注射しすぎないよう注意してください。余分なMarcaineは、小さな滅菌ガーゼで拭き取ります。

背側椎弓切除術。イソフルランの濃度を1〜2%に下げます。数分後、マイクロナイフで皮膚を穿刺し、皮膚を吻側から尾側に向かって緩やかに牽引しながら、8〜9 mmの切開口を作成します。

転移開口（transference opening）を用いる方がはるかに便利であり、椎弓切除術を行うための側方へのアクセス性も向上します。切開部位の吻側および尾側の皮下にスポンジスタティンを挿入し、皮膚切開の端を下の組織から剥離させます。細い剪刀で椎前筋を切断し、脊椎を露出させます。

新生児では脊椎突起が十分に発達していないことに注意してください。正中線を特定し、細い鋏を用いて椎弓を横方向に切断します。深く切りすぎると、硬膜や脊髄を損傷する可能性があるため、注意してください。

細いピンセットの片方の先端を、椎弓と硬膜の間に慎重に挿入します。ピンセットを閉じて椎弓を掴み、硬膜を傷つけないように注意しながら、剥離するまで慎重に持ち上げます。この手順を2〜3回繰り返し、1〜2セグメントの椎弓切除を行います。

スポンジスタチンの小片を用いて止血します。細いピンセットをロンジュールとして使い、椎管内に modified aneurysm miniclip を配置するための十分なスペースを確保するため、両側の椎間関節の一部を除去します。この工程ではしばしば出血が発生しますが、スポンジスタチンの小片を用いて止血することが可能です。

視認性を向上させるために、37 °Cの温めた滅菌PBSで洗浄することが時に有効です。脊髄圧迫損傷を誘発します。クリップを開き、関節突起と脊髄の間の隙間に、脊髄の両側にブレードを配置します。

ブレードが脊髄の腹側を十分に包含するように深く挿入されていることを確認します。クリップが後方に滑るのを防ぐため、アプリケーターを固定したまま、迅速にクリップを閉じます。15秒後、迅速にクリップを解除します。

スポンジスタチンを用いて傷口を清浄にする。対称的な圧迫を実現するため、ブレードを反転させ、反対方向に15秒間2回目の圧迫を行う。縫合。手術開始時に皮膚下に配置したスポンジスタチンの破片を取り除き、6.0縫合糸で皮膚を閉鎖する。

30ゲージのインスリン用注射器を用いて、0.03 mg/mLのTemgesicを0.05 mL皮下注射し、幼仔を30 °Cに制御された環境に数時間安置する。手術後、初夜に術後の幼仔に対する母親の攻撃的な行動を抑制するため、クリーンなPBSで希釈した0.1 mg/mLのDiazepam溶液を調製し、8 g/kgの用量で腹腔内投与する。結果。

このグラフに示されているように、脊髄圧迫から6時間後、下部胸髄レベルにおいて、損傷したマウスの後肢は麻痺していますが、前肢は麻痺していません。椎弓切除術のみを受けたシャム対照動物の場合、後肢と前肢の両方が高い可動性を示しています。脊髄の切片では、損傷部位に残血が認められます。

さらに、組織が半透明になっており、これは組織の消失を示唆しています。これにより、数日後に空洞が形成されることがよくあります。結論として、このビデオを視聴することで、新生子マウスにおいて脊髄圧迫損傷を誘発する方法について十分な理解が得られたはずです。新生子マウスを用いる利点は、成体マウスでは適用できない、適応的可塑性を検討するための特定の手法を利用できる点にあります。

さらに、このモデルは幹細胞移植などの治療アプローチを検証するためのプラットフォームを提供します。