レーザ誘起脈絡膜血管新生のためのマウスモデル

この手順の全体的な目標は、血管新生の加齢黄斑変性症またはMDの特徴を、研究が容易な動物モデルで再現することです。この方法は、遺伝子変異や薬物治療が疾患にどのように影響するか、または疾患がさまざまな画像診断法の下でどのように現れるかなど、血管新生 A MD 研究のさまざまな側面を研究するために使用できます。この手法の主な利点は、一度習得すると簡単に再現できるため、実験を迅速かつ効率的に行うことができることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、成功するための優れた器用さと調整が不足しているため、苦労します。レーザーステーションの位置を準備するには、レーザーとスリットランプに簡単にアクセスできるように、レーザーをオンにして所定のパラメータに設定します。ここでは、75マイクロメートル、スポットサイズ、100ミリワットの電力、100ミリ秒のデュレーションの設定が使用されています。

次に、麻酔アニマルウォーマーティッシュワイプと点眼薬をレーザーオペレーターの手の届くところに置きます。最初のマウスに麻酔をかけた後、約3〜5分間アニマルウォーマーに置きます。つま先をつまんで、完全な麻酔を確実にします。

次に、ロールティッシュワイプを使用して、液体のロールオフによる鼻水の誤嚥を防ぎます。30マイクロリットルの塩酸テトラカインを各眼に入れます。ソリューションが有効になるまで 2 分間待ちます。

次に、瞳孔を拡張するために、各目に局所的な補助剤を1滴塗布します。そして、解決策が有効になるまで2分待ちます。次に、マウスをマウスステージにすばやく置き、次にステージをスリットランプのあご当てにセットします。

スリットランプを点灯し、光の明るさが最も低いものに調整します。マウスの瞳孔散大を評価します。瞳孔が2.5〜3ミリメートルの拡張を達成していない場合。

マウスをアニマルウォーマーに戻すか、瞳孔拡張後に熱帯補助剤を追加で一滴投与します。.マウスをプラットフォームに向け、スリットビームに対して水平に垂直になるようにします。マウスを少し回して、約170度の角度にならないようにします。

ヘッドをレーザーオペレーターに近づけた状態で、プラットフォームの安定性を維持し、オペレーターが細かいモーター操作を行うのに十分なスペースを確保しながら、マウスをスリットランプにできるだけ近づけて配置します。マウスを適切に配置したら、25 mm x 25 mmのガラスカバースリップに人工涙液を1滴塗布します。また、脱水症状を防ぐために、この溶液をマウスの標的化されていない目に1滴置きます。

カバーの片方の角を親指と人差し指の間に挟み、残りの3本の指をマウスに巻き付けて、動物とオペレーターの手の両方を支えて安定させます。次に、カバーを慎重に押します。マウスの目に滑り込ませて角膜を平らにします。

カバースリップをレーザービーム経路に対して垂直に配置して、ビームの散乱や反射を防ぎます。スリットランプを覗き込み、網膜が見えてくるまでフリーハンドでピントを調整します。網膜は淡黄色から赤く見えるはずです はっきりとした赤い血管が存在し、マウスの頭をゆっくりと慎重に動かすか、視神経が観察されるまでカバーを滑ります。

視神経は黄色になり、そこから複数の血管が放射状に広がります。次に、レーザー集光ビームをオンにし、眼底の網膜色素上皮またはRPEに焦点を合わせるように操作します。集光ビームが楕円形または焦点が合っていないように見える場合は、スリットランプの焦点を調整するか、カバースリップします。

集光ビームが適切に調整されたら、フットトリガーを使用してレーザー投与を開始します。レーザー投与直後に気泡が形成されるはずです 境界がかすんだ病変または出血病変のある目は分析から除外する必要があります。.気泡の形成と、集束したレーザー燃焼を示す明確で鮮明な円形の領域を必ず観察してください。

気泡を生じない病変は、CNVを適切に誘導しない可能性がある。必要なすべての脈絡膜新生血管またはCNV位置に追加の病変を作成します。使用しないときはレーザーをスタンバイモードに切り替え、各レーザー投与の場所と結果をラボノートに記録します。

新しいカバースリップと反対側の手を使用して、マウスの2番目の目に対してレーザー投与を繰り返し、マウスを安定させます。すべての投与が完了したら、レーザーとスリットランプをオフにし、カバースリップを捨ててマウスを動物の上に置きます。巨視的に暖かくなります。

角膜表面や白内障の損傷がないか目を検査します。回復後、マウスをケージに戻します。免疫蛍光染色後のフラットマウント脈絡膜の解析により定量されたCNVは、こちらです。

Fit c デキストラン標識は、動物屠殺の直前に灌流によって行われました。これに続いて、Image J.Hereの死後免疫染色における内皮細胞マーカーによる閾値化による面積定量を行いました。ISOセレクチンGS IB 4を実施した後、共焦点顕微鏡によるイメージングを行いました。

FOSSおよび側面図上のCNV病変の3D再構成を生成した。光干渉断層撮影イメージングは、in vivoでのCNV病変の視覚化にも使用されました。ここでは、網膜の断面画像を示し、CNV病変を黄色で囲んだ

病変の EN FOSS 画像も示されており、黄色で囲まれています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば10分で完了します。この手順を試みるときは、動物が適切に麻酔されていることを確認し、手が支えられて安定するように手を配置することが重要です。

このビデオを見れば、フォーカスを合わせる方法について十分に理解できるはずです。レーザー燃焼はCNVを誘発し、その後さまざまな方法で研究することができます。