Name: SPRi、ナノのSPRiおよびELISAアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンの比較分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T11:00:01.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶSPRiとナノSPRiおよびELISAアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンを検出する方法。ラベルフリーでリアルタイムのバイオマーカー検出により、治療効果のモニタリングや疾患の早期発見に応用可能です。

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SPRiのためのソリューションおよびタンパク質試料の調製<ol><li> 10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウム、およびpH 7.4を含有する低塩リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液100mlを準備します。 </li><li> 10mMリン酸塩、750mMの塩化ナトリウム、およびpH 7.4を含む高塩PBS溶液50mlを調製します。 </li><li> 10 mM酢酸ナトリウムの5ミリリットルを準備します。 </li><li>低塩溶液をPBSで希釈した5 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）のストックを調製。 </li><li>低塩PBS溶液中に1μg/ mlの濃度で組換えヒト成長ホルモン（rhGH）のストック溶液を調製します。 </li><li> 100μg/ mlの濃度で抗のrhGHおよび陰性対照抗体のストック溶液を準備します。 </li></ol> 2.抗体アレイ用のSPRiチップを準備<ol><li> 50℃で90分間（1 30％過酸化水素に濃硫酸3）とすすぐことによって安定化されたフォローピラニア溶液120mlに超音波処理することにより、チップを清掃5分間水で超音波処理。その後、窒素流でエタノールとドライでチップをすすぎます。 </li><li>任意の汚染物質を除去するために30分間UV /オゾンチャンバー内の金のチップを置きます。 </li><li>攪拌棒及び管のキャップが含まれている試験管に20ミリリットルのエタノールに11メルカプトウンデカン酸150mgのを追加します。 </li><li> 50 Wで試験管およびマイクロ波チューブ/チップにチップを置き、5分間50℃。 </li><li>エタノールでチップを洗浄し、5分間エタノールに浸します。 </li><li>水ですすぎによってに従い、5分間水に浸します。 </li><li>攪拌棒及び管のキャップを含んでいる試験管内の20mlの水に1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド150mgのを加えます。ステップ2.4​​のように、マイクロ波チップ。 </li><li>水でチップを洗浄し、5分間水に浸します。 </li><li>攪拌棒及び管のキャップを含んでいる試験管に20mlの水にN-ヒドロキシスクシンイミド150mgのを加えます。ステップ2.4​​のように、マイクロ波チップ。 </li><li>水でチップを洗浄し、5分間水に浸します。 </li><li> Prepa攪拌棒及び管のキャップが含まれている試験管内の20mlの水で250μMのポリエチレングリコール（PEG、800 Da）で再。ステップ2.4​​のように、マイクロ波チップ。 注：センサーの表面上のマイクロ波PEG800は、後の実験で使用される血清タンパク質と量子ドット複合体の非特異的結合を防止するためのブロッキング工程として実行されます。これは、PEG800は、チップ上の非占有裸の金部位と反応させることにより達成されます。 </li><li>水でチップを洗浄し、5分間水に浸します。 </li><li>抗rhGHの抗体溶液と抗免疫グロブリンG（抗IgG）のネガティブコントロール液15μg/ mlを調製し、384ウェルプレート中のウェルに各抗体溶液10μlを加えます。 </li><li> 500μmのテフロンを使用して、抗体を用いてマイクロアレイヤー（各サンプルの4×7の象限）とスポットチップでスポッティングパターンを設計するには、ピンをひっくり返し。 </li><li> RTで75％以上の湿潤雰囲気下で2時間斑点チップをインキュベートします。 </li><li>すすぎ、水にチップを浸し5分。その後、窒素流で乾燥したチップ。 </li></ol> 3.のSPRi実験のセットアップとブロッキング<ol><li>楽器を選択し、ディレクトリを初期化します。リアルタイムのカメラを選択し、脱気した水10mlで1 ml /分でシリンジポンプを起動します。機器にチップを挿入して、すべての気泡が除去されるまで水を注入しておきます。 </li><li> 10mlの水でチップを洗浄した後、画像取得を開始し、低塩、PBSにバッファーを切り替えて従うと、それは5ミリリットルのために1ml /分で実行できるようにし、20分間ダウンを20μl/分、その後遅い流速。 </li><li>チップ上にスポット固定化された抗体を示し、高対比画像を選択します。 </li><li>固定された抗体に対応する400μmの個々の円形のスポットを選択して定義します。 </li><li>機器がプラズモン曲線をトレースした後、反射率曲線における最大の傾斜を有する作動角を選択します。 </li><li>低Sの20μL/分でランニングバッファーフロー選択されたスポットのすべてからの信号が安定するまでのシステムを介して、PBSをALT。 </li><li>負荷位置に噴射弁をサンプルループ（150μL）にバッファを実行するには、BSA（100μg/ ml）をロードします。その後、フローセルに溶液を注入する注入位置にバルブを切り換えます。 注：BSAは共有結合、アミン反応性表面に結合するように注入され、残りの未結合BSAは、バッファリンスを介して表面を洗い流します。 </li><li>表面上の10 mM酢酸ナトリウムの溶液を150μLを注入し、高濃度の塩のPBSを150μl注入することにより行います。 </li><li>アミン反応性表面を不活性化するためにエタノールアミン（1ミリモル）の150μLを注入します。 </li><li>表面を洗浄するために10 mM酢酸ナトリウムの150μLを注入します。 </li><li>その後、5ミリリットルの合計250マイクロリットル/分の流量で50μg/ mlのBSAを含むPBSにランニングバッファーを切り替えます。 注意：50μg/ mlのBSAはシュールの追加のブロッキングのためのランニングバッファーに追加されます非共有結合の非特異的部位を占有し、これはさらに、表面に非特異的血清タンパク質の結合を減少させるために行われることにより、顔。 </li><li> 5μL/分に変更し、流量を、それが20分間安定させます。 </li></ol>ヒト成長ホルモンの4のSPRi検出<ol><li> 10％血清及び1mg / mlのBSAを含有するPBS中に希釈したrhGHの設定濃度（2.5 pg / mlで、および0.25 pg / mlで、250 pg / mlで; 25 pg / mlで3万pg / mlで）の溶液を調製します。 </li><li> 0.5ミリリットルマイクロチューブに赤外線量子ドット（1μM）の近くにコーティングされたストレプトアビジンの3μlにビオチン標識抗rhGHを検出抗体（6μM）の1μLを追加することにより、1液と有効な結合のために30分間インキュベート：2を準備します。 </li><li>注入ループでヒト血清溶液をスパイクしたhGHの150μLを注入します。これは、表面からすすぎ非特異的に結合した血清からゆっくり降下が続くシグナルの強い増加をもたらします。 </li><li>記号たらアルは、ランニング緩衝液に添加450 mM塩化ナトリウムの溶液で表面を洗浄し、安定化します。 </li><li> 10 nMの（2：1）の濃度に対する抗rhGHを検出抗体と量子ドットの溶液を希釈緩衝液を実行している（PBS、50μg/ mlのBSAを含む）及びフローセルに注入します。 </li></ol> 5.のSPRiデータ分析注：のrhGHの注射後は、ヒト血清および量子ドットエンハンサーをスパイク、反射率変化の増加は、プラズモン曲線の増幅されたシフトに起因する発生します。これは、チップ上の信号に相関するグレースケール画像を表す差分画像が得られます。 <ol><li>データ解析プログラムにデータをインポートします。時間（s）対のSPRi信号（％の反射率）をプロットし、高塩洗浄後の抗rhGHを、負の対照抗体のスポット間の差を求めます。 </li></ol> 6. ELISAプロトコル（1日目） <ol><li>すべてのアッセイ成分は、私を含め保管nは2〜8℃でのrhGH ELISAキット。これは、ヒツジ血清、ヒト血清中のコントロール（1＆2）、共役バッファ、（200X）洗浄緩衝液、クロモゲンTMB（テトラメチルベンジジン）でウェルプレート、標準（0-5）を塗布し、試薬を止める抗rhGHの抗体が含まれます。 </li><li>セットアップ試薬および市販のELISAキットのプロトコールに記載の方法に従ってください。 </li><li>まず、抗rhGHの抗体は、従来の箔パッケージを開封し、室温に加温し96ウェルをコーティングしたことができます。 </li><li>その後、アッセイのために8ウェルストリップの所望の数を削除し、2〜8℃で残りのウェルと店舗を含む箔パッケージを再シール。 </li><li>標準の蒸留水（1-5）1ml中、およびコントロールの蒸留水1ml（1＆2）で、標準の＃0のために2mlの蒸留水で再構成することによって基準を準備します。以下は、標準およびコントロール（ 表1）の対応する濃度のテーブルには、次のとおりです。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep--next.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> スタンダード </td><td> 濃度（ngの/ ml）を </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.94 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2.63 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 26.9 </td></tr><tr><td>対照＃1 </td><td> 1.22±0.33 ng / mlで</td></tr><tr><td>コントロール＃2 </td><td> 4.97±1.25 ng / mlで</td></tr></tbody></table> 表の基準とコントロールの1濃度は、市販のELISAキットに含まれています。 <ol start="6"><li>以下の濃度（ 表2）で、10％ヒト血清中のrhGHホルモンで構成されたサンプルを準備します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> &lt;強い&gt;サンプル</td><td> 濃度（ngの/ ml）を </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> 表10％血清中で調製したrhGHサンプルを2濃度。 <ol start="7"><li> （三重で）を各ウェルに各標準、対照およびサンプルの50μlのを追加します。井戸を密封し、穏やかに振盪下に4℃での標準、コントロール、およびrhGHのサンプルO / Nでインキュベートします。 </li></ol> 7. ELISAプロトコル（2日目） <ol><li>シェーカーからプレートを取り外し、それはアッセイの前に進むにRT（15〜20分）に加温することができます。 </li><li>削除アンチのrhGH-HRPコンジュゲートバ​​ッファー、洗浄バッファー（200X）、色素原TMB（テトラメチルベンジジン）、冷蔵庫からD停止試薬とを室温に温めことができます。 </li><li>試薬の調製：（製造元の仕様に応じて） <ol><li>共役緩衝液でアンチのrhGH-HRP 40倍希釈します。蒸留水で200倍に希釈して洗浄バッファーを準備します。 </li></ol></li><li> 、各ウェルにアンチのrhGH-HRPコンジュゲートの50μlを添加したウェルを密閉し、穏やかに振盪しながら室温で30分間インキュベートします。 </li><li>井戸からの溶液をデカントし、プレートを反転し、吸収性組織上にドライタップします。その後、各ウェルに洗浄用緩衝液200μlを添加します。 </li><li>洗浄溶液をデカントし、吸水性組織上にドライタップします。このステップを3回繰り返します。 </li><li>洗浄ステップの後、15分以内に各ウェルにTMB基質100μlのを追加します。静かに振盪しながら暗所で室温で30分間インキュベートします。ソリューションは、無色から青に変わります。 </li><li>各ウェルに停止試薬を100μlを追加します。ソリューションは、青から黄色に変わります。すぐに、目を読みますマイクロプレートリーダーを用いて450nmで各ウェルの吸光度E。 </li><li>提供規格（0-5）のための標準曲線をプロットします。その後、各サンプルの濃度に対して10％の血清サンプル中のrhGHの光学密度をプロットします。 </li></ol>

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M.G. Sandros は、Horiba Scientific のコンサルタントです。彼女は、Horiba ScientificとSyngentaから口頭発表への参加に対する謝礼を受け取っています。著者は、開示されたものを除いて、原稿で議論されている主題または資料に金銭的利益または金銭的対立を持つ組織または団体と、他の関連する提携または金銭的関与はありません。この原稿の作成には執筆支援は利用されませんでした

hGHの、天然に存在するホルモンの不規則なレベルは、人間の成長と発展に影響を与える多数の医学的障害にリンクされています。また、のrhGHの外因性投与は、一般的に、その性能を高めるために、ドーピング剤として、それが禁止されているにもかかわらず、運動選手によって使用されます。内因性のフォームから外因性のhGHを区別することの困難からのrhGHの誤用の結果を検出するのに挑戦。このように、外因性のhGHを検出するための現在認可された技術は、20 kDaのアイソフォームに関連して22 kDaのhGHのアイソフォームの割合を測定することに依存しています。広い濃度範囲で短時間で同時に複数のhGHアイソフォームを測定するためのアイソフォームのテスト要求するので、したがって、私たちは完全な一致としてのSPRiプラットフォームを検討しました。また、内因性のhGHレベルしたがって、検出システムは、高SPで快適にこの範囲を測定することができなければならない血流中（0.03 ngの/ ml）を非常に低いレベルに変動しますecificity。その結果、我々はまた、hGHのための診断ツールとして、本研究ではナノのSPRiの可能性を調査し、のSPRiと古典免疫測定法、ELISAと直接比較しました。 この研究から得られた結果に基づいて、のSPRi及びナノのSPRi方法の主な利点は、のrhGH濃度がより従来の方法のELISAに比べて迅速な方法で測定することができるということです。ナノのSPRiがプロセスに追加のステップのために2時間を要したのに対し、直接検出法と一つのサンプル中のrhGHレベルを測定するための標準的な持続時間は1時間でした。全体的に、のSPRiとナノのSPRi実験では、サンプルの注入前に、較正ステップを強くお勧めします。加えて、結果としていくつかの非特異​​的相互作用におけるヒト血清の結果のような粗試料の注入は、それは、特定の相互作用を明らかにするために、高塩洗浄緩衝液を注入するために不可欠です。これは、洗浄工程が絶対に必要であることも注目に値します非結合分子を除去するために、センサ表面に分子を遮断導入後。 ELISA時間要件に関しては1試料の分析のために（〜16〜18時間）、はるかに大きいです。アッセイの感度は、特にこの研究のために強化されるように、焦点検出の下限値を比較することであったように、より長いインキュベーション時間が必要です。 表面化学の選択は、あるアプリケーションから別のものに変化し、これは、のSPRi技術の限界の一つとして実現することができます。本研究では、広い範囲の化学的リンカーおよびブロッキング分子の組み合わせは、センサ表面へのrhGHの最適な結合効率を観察するために適切な組み合わせを達成するために評価しました。例えば、この研究において、BSAとPEGとの組み合わせは、非特異的相互作用を最小限にするに十分に役立ちました。しかし、捕獲リガンドは、アプタマーであった以前の研究17には、PEGだけでは最高のブロッキング分子を務めました。変数それは、リガンドへの検体の結合効率に影響を与え、またpHは、緩衝液および温度に依存しています。したがって、任意のアプリケーションで、これらの変数を最適化する必要があります。また、チップ表面へのリガンドの最適なスポッティング濃度を決定することが重要です。固定化リガンドの濃度範囲での滴定実験は、研究を開始する前に実行されます。これは残留液体が残りません確保としてELISA用として、手順における重要なステップは、マイクロプレートを叩いてウェルから洗浄緩衝液をデカントすることでした。ピペットで緩衝液洗浄を削除すると、ターゲットサンプルの信号読み出しを妨害する任意の残液としては十分ではなかったです。 感度を参照して、ELISA（1 ng / ml）をのSPRi（3.61 ngの/ mlで）が、ナノのSPRi（9.20 pg / mlで）に匹敵する、それによってのrhGHの低い生物学的レベルでの測定を可能にする、3桁感度を向上させ0.03 ng / mlで。我々は以前に1を報告したように6,17は、NanoEnhancersによって付与される信号強調は、質量負荷効果と近赤外蛍光団と金膜のナノ構造のための表面プラズモンを伝播する間に存在する強い結合に起因します。 、ナノのSPRiがプロシージャに余分なステップを追加していますが、この感度のレベルはさまざまな店舗でのSPRi技術の用途を広げることができます。 ELISAは唯一の親和性値を報告することができ、一方のSPRiは、科学者に抗体/ rhGHの相互作用の完全動態プロファイル（K D、K aおよびK d）を提供します。変動係数（CV）は、良好な再現性を示唆している、のSPRi（4.1％）およびELISA（6.5％）が10％未満でした。センサーチップ上に固定化された捕捉抗体をELISA 96ウェルプレートに固定化された抗体とは異なるため、ELISAとのSPRi親和性の値が異なっています。ナノのSPRiとして高いCV値（20％）が観察されました。 ERROの源として貢献することができるいくつかのパラメータがあります。CVの決意のためのRS。例えば、分析物のかなり低い濃度が測定されているナノのSPRi実験で、NanoEnhancersの添加は、手順における別のステップを追加し、実験は、手動で行いました。ナノのSPRiおよびELISAの間に非常に良好な相関がスパイクヒト血清中のrhGHの検出を達成しました。最後に、ELISAは、方法自体は、それがhGHのの場合のように、それは難しい、リアルタイムの監視と多重化を必要とする状況で使用できるようになり、時間がかかりますが信頼性の高い技術であることができます。また、のSPRiをELISAを介して提供しています。この研究では、直接調査しなかったより魅力的な特徴は、同時にリアルタイムで相互作用の数百を測定する能力です。したがって、将来的に、ナノのSPRi方法は、実行可能な臨床診断ツールとしての可能性を検討するために、種々の濃度の血清中に存在する多数のバイオマーカーを同時にリアルタイムで（多重化）を検出するために評価されます。

ヒト成長ホルモン（hGH）は191アミノ酸のペプチド（22キロダルトン）、下垂体によって産生され、直接血流に放出されます。視床下部ペプチド成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）および成長ホルモン間の相互作用は、hGHの拍動性分泌を誘導します。その結果、hGHのレベルは0.03 ngの/ mlの範囲1で安値に50〜100 ng / mlで高値で異なります。体内の欠乏またはhGHの過剰は、異常な生理学的症状の広い範囲を引き起こすことができます。例えば、hGHの過剰レベルは巨人症2型糖尿病および3につながることができます。 hGHの枯渇レベルは新生児に低血糖を引き起こす、と大人4に弱い骨密度とうつ病。 体脂肪を減らしながらのhGH（rhGHの）の組換え型の投与は、除脂肪体重を向上させます。それはADVを与える物理的強度を向上させるなどのように、この物質は、プロとアマチュアスポーツ選手のための第一選択薬となりました競技スポーツでアンテージ。 rhGHは、その存在または同化作用を検出することができるテストを開発する上で注目されている国際的な研究者が世界アンチ・ドーピング機構（WADA）5,6及び多くの努力により禁止されています。 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、全血7におけるhGHの決意するための好ましい方法でした。 ELISAは良好な感度と選択性を提供する信頼性の高い技術であるが、比較的時間と労働集約的です。また、ELISAは、酵素タグを使用することによって、hGHの間接的検出に依存します。対照的に、表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでのラベルを使用することなく、直接、hGHの検出を可能にします。 SPR後ろ検出原理は、薄い金属層（金または銀）で被覆されたプリズムからなるセンサ面を伴います。単色の偏光が金属表面と相互作用する場合、「表面プラズモン」が生成されます。検体の結合金属表面上に固定化された表面受容体へのその後の分析対象物濃度と相関させることができるシフト共振ディップが生じる共振状態を乱します。 SPRベースのバイオセンサーは、生体分子結合事象および生化学反応8-10を監視するリアルタイム、ラベルフリーの技術を提供している現在市販されています。最近では、のSPRiは多重化の必要性に応じて開発された（ すなわち、同時に複数の結合事象のモニタリング）古典SPRバイオセンサでは不可能でした、。したがって、のSPRiは同時に複数の結合事象を監視するためのツールと​​して浮上しています。現在のSPRiシステムは、特定の角度と波長10の光で励起された表面の顕微鏡イメージングに基づいています。画像は、電荷結合素子（CCD）アレイ上に捕捉されます。 今日まで、hGHの11-14を検出するために開発され 、いくつかのSPRベースのアッセイが行われています。一つの特定の戦略非22-kDaの内因性レベルは、外因性のrhGHの投与後にドロップとして、アイソフォーム法15として知られ、合計のhGHへの22kDaのhGHの比の検出に依存しています。最近では、フアン・フランコら 11は 22 kDaのヒト血清サンプル中の20kDaのhGHアイソフォームの選択的検出のためのSPRベースの免疫の開発を報告したデ。各アイソフォームに特異的なモノクローナル抗体は、0.9 ngのミリリットル-1で検出限界を持つ単一の注射で同時に両方のアイソフォームの測定を可能にする金センサ上に直接固定化しました。代替的に、SPRは、hGH 13に対して高い特異性を有する抗体をスクリーニングするために使用されてきました。標的分析物の濃度は検出のSPRiシステムの限界（&lt;nM）を下回った場合は、1は、ナノ粒子（ナノのSPRi）の利用を経由してのSPRi信号を増幅に頼らなければなりません。このようなSPRベースの増幅はよくVについての文献16-19に記載されています検体および表面のarious種類。 本研究では、のSPRiとナノのSPRiベースのバイオセンサーの分析の可能性は、特にスパイクヒト血清中のrhGHの検出、および直接ELISA法との検出能力の比較のために、検査しました。以下のパラメータを見直し、検討されます。検出時間、感度、動態プロファイル、再現性と特異性。

<table><tbody><tr><td>ソマトトロピン成長ホルモン(GH1)捕捉抗体&nbsp;</td><td>Acris 抗体</td><td>DM1015</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>フィッシャーバイオ試薬&nbsp;</td><td>BP671-10</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン標識ソマトトロピン成長ホルモン(GH1)検出抗体&nbsp;</td><td>Acris 抗体</td><td>AM09304BT-N</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide&nbsp;</td><td>TCIアメリカ</td><td>D1601</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>アクロスオーガニックス&nbsp;</td><td>141-43-5</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーケミカルズ&nbsp;&nbsp;</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>ヒトHGH エリーサキット&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td></td><td></td>KAQ1081</tr><tr><td>ヒト血清&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>H4522&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウサギIgG抗体&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>I5006</td><td></td></tr><tr><td>11-メルカプトンデカン酸&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>450561</tr><tr><td>ナノストリップ&nbsp;</td><td>シアンテック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>130672</tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-3002</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール(800 Da)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>729108</tr><tr><td>組換えヒト成長ホルモン&nbsp;</td><td>カルビオケム</td><td>869008</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ&nbsp;</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカルズ&nbsp;&nbsp;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン被覆近赤外量子ドット&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td></td><td></td>Q10171MP</tr><tr><td>UV/オゾンプロクリーナー</td><td>バイオフォースナノサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波リアクター&nbsp;&nbsp;</td><td>CEM Corporation</td><td></td><td>Discoverシステム&nbsp;</td></tr><tr><td>SPRi-アレイヤ&nbsp;&nbsp;</td><td>LabNext Xactllマイクロアレイシステム&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRバイオチップ</td><td>堀場製作所&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRi-Lab+</td><td>HORIBA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx マルチモードマイクロプレートリーダー&nbsp;</td><td>ビオテック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScrubberGen</td><td>HORIBA</td><td></td><td>データ解析ソフトウェア&nbsp;</td></tr></tbody></table>

spri、ナノのspriおよびelisaアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンの比較分析

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

広範囲の濃度にわたって、ヒト成長ホルモン（hGH）を検出するための高感度かつ選択的な方法（50-100 ngのmlの高レベル- 0.03 ngのmlの1及び最小レベルが- 1）循環血液中の変数のレベルとして不可欠であるかもしれません変更された生理機能を示します。例えば、子供の頃に発生する増殖性疾患は、血液中のhGHのレベルを測定することによって診断することができます。また、スポーツにおける組換えhGHの悪用だけではなく、それはまた、虐待者への深刻な健康への脅威を提示し、倫理的な問題が生じます。非22 kDaの内因性レベルは、外因性の組換えのhGH（rhGHの）投与後にドロップとしてのhGH誤用を測定するための1つの一般的な戦略は、合計のhGHへの22kDaのhGHの比の検出に依存しています。 表面プラズモン共鳴画像（のSPRi）屈折INDの変化を記録することによって、生体分子の相互作用の直接的な（ラベルフリー）モニタリングと可視化を可能にする分析ツールです。リアルタイムでセンサー表面に隣接する元。対照的に、最も頻繁に使用される比色法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、間接的に色の変化を誘発する基質を加えた後に検体濃度を測定するために酵素標識した検出抗体を使用します。検出感度を高めるために、増幅のSPRiは、信号強度を増大させるために、サンドイッチアッセイフォーマットおよび近赤外量子ドット（QD）を使用します。スパイクされたヒト血清中の組換えのrhGHの直接のSPRi検出した後、のSPRi信号が近赤外量子ドット（ナノのSPRi）でコーティングされた検出抗体の連続注入によって増幅されます。本研究では、直接、増幅のSPRiの診断可能性は、ヒト血清中にスパイクし、市販のELISAキットの能力と直接比較したrhGHを測定するために評価しました。

SPRiとナノのSPRi（NanoEnhancersを採用するのSPRi）の性能は、複雑な環境でのrhGHの検出のためのELISA法と比較しました。これらの方法の設定の違いは、ここで簡単に説明します。 SPRi（直接検出、 図1）については、捕捉抗体は、表面上に固定化され、次いでサンプルを注入し、センサー表面への検体の結合のリアルタイムおよびラベルフリーの方法で直接測定されます。分析物がセンサー表面に結合した後、しかし、ナノのSPRi（ 図1）を用いて、連続した噴射がのSPRi信号を増幅するために、検出抗体で被覆された量子ドットと続きます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig1.jpg" /> 図1のCでのrhGHの検出のダイレクトモード（のSPRi）を比較略図及び増幅モード（ナノのSPRi）<html>失礼なサンプル。リガンド（rhGHをまたはIgG特異的抗体）がのSPRiのバイオチップ上のアレイ形式で固定化しました。標的タンパク質（rhGHの）はセンサ表面に導入されたヒト血清中にスパイク直接（のSPRi）を検出し、順次NanoEnhancers（ナノのSPRi）と強調した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ELISAに関しては、マルチウェルプレートは、既に捕捉抗体で予め官能到着すると、サンプルを導入し、目的の分析物が結合します。検出抗体は、基質を加え、続いて導入されます。光学密度は、その後、450nmで測定されます。本研究では、市販のELISAキット（図2）のrhGHを10％ヒト血清にスパイクを測定するために使用しました。 8 / 53508fig2.jpg &quot;/&gt; 図2 ELISAアッセイ手順の略図 。 rhGHタンパク質（青楕円）のrhGHのに特異的なモノクローナル抗体（黄）で予め官能化されているウェルに導入されます。非特異的相互作用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP、紫）でprefunctionalized検出抗体を導入し、続いて洗浄緩衝液でウェルを洗浄することによって除去されます。解決策は、基質テトラメチルベンジジン（TMB、金）を追加した後の色に変化します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3は、のrhGHの滴定曲線は、10％ヒト血清にスパイクし、450 nmで得たODに対してプロットされている表します。良好な線形応答が観察され、検出限界は、1 ngの/ mlであると決定されました。 VARの係数iation（CV）は、良好な再現性を示唆して6.5％でした。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig3.jpg" /> 図3. ELISAデータ分析。血清中にスパイクのrhGHの濃度は、450nmで得られたODに対してプロットされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 次に、ヒト血清中にスパイクしたrhGHの検出のSPRiで評価しました。 rhGHの直接検出は、対応する濃度勾配曲線（ 図4）で得られた、各点は、各濃度について3のSPRi動態曲線から計算した反射率差の平均値を表します。検出限界（LOD）は、3.61 ng / mlであると決定されました。 SPRi直接検出アッセイは、アッセイのCVとして非常に再現性がありました唯一の4.1％でした。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig4.jpg" /> hGHの図4.直接のSPRi検出を、10％ヒト血清中にスパイクした。hGHの様々な量を注入した後、得られた正規化のSPRi運動プロットが高塩緩衝液の注入（垂直破線）は、非除去するための、ヒトの血清中にスパイク固有の相互作用。 hGHの様々な量の結合を表す濃度勾配曲線は、ビオチン化hGHの固有-抗体でprefunctionalizedされたセンサ表面にヒト血清にスパイクした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> SPRiバイオセンサの感度を高めるために、NanoEnhancersは（量子ドットは、検出抗体で予備官能化）に順次ヒト血清中スパイクのrhGHの存在を強調するためにセンサ表面にtroduced。 。の関心イメージングの制御された領域上に図5、バックグラウンド減算した後、NanoEnhancersは、最小限の信号変化（免疫グロブリンG（IgG）特異的抗体、反射率0.38％の変化で、しかし、7.9％までのバイオセンサーの応答を増幅することができましたセンサー表面は、rhGHの特異的抗体を持っている興味のある領域のみが経験に運動センサーの応答を直接裏付ける最大のコントラスト変化を固定化したことを明らかにしました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig5.jpg" /> 図5.事前にサンドイッチアッセイを10％ヒト血清にスパイクした。のSPRi動態プロットバッファー中のrhGH（30 ngの/ ml）を注射した後（10mMのPBS、150mM塩化ナトリウム、pH値= 7.4）を用いたrhGHの検出 11メルカプトウンデカン酸/ rhGH-と-functionalizedチップ特異的抗体、その後、検出抗体でコーティングされた量子ドット（NanoEnhancers）を加え、続いて、BSAでブロックしたIgG抗体を制御する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ナノのSPRiバイオセンサーの実用性を実証するために、粗製サンプル中のrhGHの測定範囲を評価しました。 0.25 PG / mlの3万PG /から拡張作業範囲はNanoEnhancers（ 図6）の添加に応答として得られました。これは、滴定曲線上の各点は、3つの独立した実験から平均化されることは注目に値します。したがって、検出の下限は9.20 pg / mlであることが算出され、変動係数は20％でした。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig6.jpg" /> 図6。hGHのナノのSPRiの検出は、ヒト血清中にスパイクされたヒト血清サンプルについてhGH_specific_Anti、量子ドット、増幅された信号の正規化のSPRi動態プロット表現はhGHの異なる濃度でスパイクしました。 （灰色の）垂直の破線は、ランニング緩衝液の注入点を表します。 （b）は、hGHの様々な量の注入後NanoEnhancers（hGH_specific_Anti、量子ドット）の結合を示す濃度勾配曲線11メルカプトウンデカン酸/ hGHを特異的抗体でprefunctionalizedされたセンサー表面にヒト血清にスパイクした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig6large.jpg" target="_blank">クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。</a> 次に、濃度の関数としてのSPR反射率曲線で発生する変更は、直接およびNanoEnhancerバイオアッセイ法（ 図7）との間で比較しました。直接デについて25および0.25 pg / mlでの間tection技法は、信号が平坦域に開始し、これらの濃度が3 ng / mlで（ 図7）のLODを下回るように、これは驚くべきことではありません。同様に、増幅された技術のために、9.2 pg / mlで信号のLOD以下の濃度は、高原に開始され、実質的に全く変化を示さありませんでした。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig7.jpg" /> rhGHの導入は30,000ヒト血清中NanoEnhancersの注入に続いて（直接検出）（増幅された検出）をスパイクした後、 図7ナノのSPRiでのSPRiの比較分析。この棒グラフは、反射率の変化率（％R）を示しますpg / mlで、2.5 pg / mlで250 pg / mlで、25 pg / mlであり、0.25 pg / mlで。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt;さらに、ナノのSPRiバイオセンサの特異性を評価しました。インスリン様成長因子-1（IGF-1）は、hGHが肝細胞膜上の成長ホルモン受容体を介してIGF-1の分泌を刺激するための対照として注射したヒト血清にスパイク。 IGF-1血清中の注入後、NanoEnhancersを順次注入し、SPRシグナル応答は、任意の特異的結合（ 図8）を示さありませんでした。血清試料中のスパイクのrhGHのrhGHが抗体で官能全く同じ場所に注入されたときしかし、シグナル増強が観察されました。結論として、ナノのSPRiプラットフォームは、rhGHのための優れた特異性と選択性を示しました。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig8.jpg" /> 図8のrhGHに向けてナノのSPRi選択性の評価。s内のrhGH（黒）およびIGF-1（赤）の注射後のナノのSPRiバイオセンサーの応答先のとがった血清。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 相関分析のSPRiは、信号強度およびELISAの光学密度の値（ 図9）との間の相関を決定するために、ピアソンの相関係数を用いて行きました。 p値&lt;0.01を有意とみなしました。このグラフに示されるように、のSPRiおよびELISAによって測定スパイクヒト血清中のrhGHレベルの間に良好な相関があります。 r値は、9種類の試料について0.9263でした。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/53508/53508fig9.jpg" /> ELISA及びナノのSPRi間に 図9 ピアソン相関分析。プロットは、ELISA光学濃度（x軸）の値を持つナノのSPRi信号強度（y軸）を相関させます。 （梨相関係数のn = 9、R = 0.9263、P = 0.00000183）に。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53508/53508fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 平衡解離定数（K D）は、ELISA用のGraphPadソフトウェアを用いて決定しました。計算されたK D値は、約79 nMであった（表3）。 （Kのa）のオンとオフ（K d）は速度をELISAによって決定することができませんでした。しかし、データ分析ソフトウェアを使用して、直接検出方法は、1つのrhGH分子に相当する22キロダルトンの分子量を用いて、23ピコモルのK D値となりました。オンとオフ率は、それぞれ6.1×10 7 M -1 s -1の1.33×10 -3 秒 -1であると計算されました。これは本質的に変換し、第2あたりのrhGHおよび抗体複合体崩壊の0.13％。 AについてmplifiedのSPRi実験、より強力な全体的な相互作用を計算した結合親和性としてNanoEnhancersとのrhGHの間で観察されたが4.3 pMであると決定しました。また、強​​力な会合速度が捕捉抗体よりNanoEnhancersとのrhGHのために観察された/ rhGHを、しかし解離速度が示唆毎秒NanoEnhancer /のrhGH /捕捉抗体崩壊の0.26パーセント。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 方法 </td><td> K D（アフィニティ） </td><td> K（オン率） </td><td> （オフレート） の K d </td><td> LOD </td></tr><tr><td> ELISA </td><td> 79.45×10 -9 M </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 ngの/ mlの</td></tr><tr><td> SPRi </td><td> 23.2×10 -12 M </td><td> 6.1×10 7 M -1 秒 -1 </td><td&gt; 1.33×10 -3 秒 -1 </td><td> 3.61 ng / mlで</td></tr><tr><td>ナノのSPRi </td><td> 4.33×10 -12 M </td><td> 7.54×10 8 M -1 秒 -1 </td><td> 2.62×10 -3 秒 -1 </td><td> 0.0092 ng / mlで</td></tr></tbody></table> 表3.全動態データ解析。親和性の評価、レートオンとオフ率グラフパッド（ELISA）およびデータ解析（のSPRiとナノのSPRi）ソフトウェアを用いて抗体応答の。 1のrhGH分子に対応する22キロダルトンの分子量を用いて、結合活性の決意を選択しました。検出限界は、Excelを使用して、すべての3つの研究のために決定しました。

提案された作業は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて直接のSPRi結果を比較することにより、特にスパイクヒト血清中の組換えヒト成長ホルモンの検出のために、直接、増幅、表面プラズモン共鳴イメージング（のSPRi）アッセイの診断の可能性を評価しますキット。

SPRi、ナノのSPRiおよびELISAアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンの比較分析

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

本研究の全体的な目的は、血清中のバイオマーカー検出における直接的および増幅的表面プラズモン共鳴イメージング（SPRi）アッセイの診断能を評価し、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットと直接比較することである。この手法は、疾患の早期段階の特定や治療 efficacy のモニタリング手段の提供など、生物医学分野における重要な課題の解決に寄与し得る。SPRiの主な利点は、センサー表面に隣接する屈折率の変化を記録することで、バイオ分子相互作用のラベルフリーかつリアルタイムなモニタリングと可視化が可能である点にある。内因性hGHは、ヒトの成長および発達に影響を及ぼす数多くの医学的疾患に関連しているため、本手法の意義は血清中のhGH濃度の診断へと広がります。バイオチップの表面化学処理の手順は習得が困難であり、わずかなミスが結果に多大な影響を及ぼす可能性があるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。テキストプロトコルに従って溶液およびタンパク質試料を調製した後、120 millilitersの安定化ピラニア溶液を用いて、50 degrees Celsiusで90分間、超音波洗浄によりゴールドチップを洗浄してください。水を用いてチップを洗浄し、水中で5分間超音波洗浄を行います。次に、チップをエタノールで洗浄し、窒素気流を用いて乾燥させます。金チップをUVオゾン洗浄機に入れ、30分間処理して汚染物質を除去します。次に、チップを固定するためのプラスチックキャップと、溶液を均一に混合するための撹拌子が入った試験管に、11-メルカプトウンデカン酸 150 milligramsをエタノール 20 millilitersに加えて溶解させます。試験管にチップを入れ、キャップを締めます。その後、試験管を50 watts、50 degrees Celsiusで5分間マイクロ波加熱します。エタノールでチップをすすぎ、そのままエタノールに5分間浸します。水を用いてすすぎを繰り返し、5分間浸します。スターバーを入れた試験管内の20 millilitersの水に、1-Ethyl-3-carbodiimideを150 milligrams加えます。チップを試験管に移し、先ほど示した方法で電子レンジ加熱します。水でチップをすすぎ、水に5分間浸します。次に、撹拌子を入れた試験管内の 20 milliliters の水に、150 milligrams の N-Hydroxysuccinimide を加えます。チップを試験管に入れ、キャップで密閉して電子レンジで加熱します。前述と同様にチップを水で洗浄および浸漬した後、250 µMのポリエチレングリコールを20 mLの水に溶解した溶液を、スターラーバーを入れた試験管に加えます。そこにチップを加えて電子レンジで加熱し、その後、前述と同様に水で洗浄および浸漬します。15 µg/mLの抗rhGH抗体溶液および陰性コントロールとしての抗IgGを調製し、384ウェルプレートの各ウェルに10 µLずつ分注します。マイクロアレイヤーでスポットパターンを設計し、500 µmのテフロンチップピンを用いて、チップに抗体をスポットします。スポットしたチップを室温、湿度75%の条件下で2時間インキュベートします。SPRi実験のセットアップを行い、テキストプロトコルに従ってチップをブロッキングした後、10%血清および1 mg/mL BSAを含むPBSを用いて、以下の濃度セットのrhGH溶液を調製します。このステップで選択するブロッキング分子の種類を強調することが重要です。その目的は、非特異的相互作用を最小限に抑えることにあるからです。0.5 mLマイクロ遠心チューブに、1 µMのストレプトアビジン修飾近赤外量子ドット 3 µLと、6 µMのビオチン標識抗rhGH検出抗体 1 µLを加え、2:1の溶液を調製します。注入ループに、hGHを添加したヒト血清溶液 150 µLを注入します。信号が強く増加した後、表面から非特異的に結合した血清が洗浄されるため、緩やかに減少します。信号が安定したら、ランニングバッファーに450 millimolarの塩化ナトリウムを加えた溶液を用いて、表面を洗浄します。抗rhGH検出抗体と量子ドットの溶液をランニングバッファーで10 nanomolarの濃度まで希釈し、フローセルに注入します。データをデータ解析プログラムに取り込みます。次に、SPRi信号を時間に対してプロットし、高塩濃度洗浄後のanti-rhGHスポットと陰性対照抗体スポットとの差を決定します。ELISAを実施するために、テキストプロトコルに従って試薬、抗体コートウェル、および標準品を調製した後、10%ヒト血清中のrhGHホルモンのサンプルを以下の濃度で調製します。各標準品、対照、およびサンプルを50 µLずつ、各ウェルに3連（triplicate）で加えます。次にウェルを密封し、4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。翌日、プレートをシェーカーから取り出し、室温に戻します。anti-rhGH HRP、コンジュゲートバッファー、洗浄バッファー、発色剤のテトラメチルベンジジン（TMB）、および停止試薬を室温に温めておきます。作業用試薬を調製するために、コンジュゲートバッファーを用いてanti-rhGH HRPを40倍に希釈します。蒸留水を用いて洗浄バッファーを200倍に希釈します。各ウェルにanti-rhGH HRPコンジュゲートを50 microlitersずつ加えます。ウェルを密封し、緩やかに揺らしながら室温で30分間インキュベートします。ウェルから溶液を捨て、プレートを逆さにして吸水性のティッシュの上で叩いて水分を除去します。各ウェルに200 microlitersの洗浄バッファーを加え、再び溶液を捨てて叩いて水分を除去します。洗浄を3回繰り返します。ピペットのみでは不十分なため、プレートをタッピングして副試薬を完全に除去することが重要です。次に、洗浄ステップから15分以内に、各ウェルに100 µLの発色剤を加えます。室温の暗所で、緩やかに振盪しながら30分間インキュベートします。無色の溶液が青色に変化します。各ウェルにストップ試薬を100 microliters加えます。溶液は青色から黄色に変化します。プレートリーダーを用いて450 nanometersで各ウェルの吸光度を直ちに測定してください。最後に、提供された標準物質を用いて標準曲線を作成し、10%serumサンプル中のrhGHの光学密度を各サンプルの濃度に対してプロットしてください。このビデオでは、rhGHの検出におけるSPRiおよびnano-SPRiの性能をELISAと比較しました。この図は、10%ヒト血清にスパイクしたrhGHの滴定曲線であり、450ナノメートルで得られたODに対してプロットされています。良好な線形応答が観察され、検出限界は1 ng/mLと決定されました。ここでは、SPRiを用いてrhGHの検出能を評価しました。濃度勾配曲線の各点は、各濃度について3本のSPRiキネティック曲線から算出された反射率差の平均値を表しています。検出限界（LoD）は3.61 nanograms per milliliterと決定されました。SPRiバイオセンサの感度を向上させるため、ナノエンハンサーをセンサに順次導入しました。本実験において、ナノエンハンサーはバイオセンサの応答を最大7.9%増幅させましたが、コントロールへの信号変化は最小限にとどまりました。ナノSPRiバイオセンサの実用性は、30,000から0.25 pg/mLの範囲のrhGHを測定することで評価しました。LoDは9.2 picograms per milliliterと算出され、変動係数は20%でした。この手法を習得し、適切に実施すれば、直接検出では1時間、nano-SPRiでは2時間で完了させることができます。本手順を行う際は、各ステップの条件を最適化することが重要であり、最適化後はより短時間で結果を容易に再現することが可能です。本手順に続き、SPRi実験後にチップ上で直接multi-tuffやmaspeck解析などの他の手法を行うことで、捕捉した分子に関するさらなる知見を得ることができます。本手法の開発により、医療診断分野の研究者が、がん、神経疾患、および心血管疾患に関連する複数のバイオマーカーの同時検出を探索するための道が開かれることが期待されます。このビデオを視聴することで、ヒト血清中のhGHレベルを検出するためのSPRi、nano-SPRi、およびELISAアッセイのセットアップ方法について十分に理解できるはずです。試薬の取り扱いは非常に危険な場合があるため、本手順を実施する際は、常に手袋や保護メガネの着用などの予防措置を講じてください。

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