SPRi、ナノのSPRiおよびELISAアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンの比較分析

本研究の全体的な目的は、血清中のバイオマーカー検出における直接的および増幅的表面プラズモン共鳴イメージング（SPRi）アッセイの診断能を評価し、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットと直接比較することである。この手法は、疾患の早期段階の特定や治療 efficacy のモニタリング手段の提供など、生物医学分野における重要な課題の解決に寄与し得る。SPRiの主な利点は、センサー表面に隣接する屈折率の変化を記録することで、バイオ分子相互作用のラベルフリーかつリアルタイムなモニタリングと可視化が可能である点にある。

内因性hGHは、ヒトの成長および発達に影響を及ぼす数多くの医学的疾患に関連しているため、本手法の意義は血清中のhGH濃度の診断へと広がります。バイオチップの表面化学処理の手順は習得が困難であり、わずかなミスが結果に多大な影響を及ぼす可能性があるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。テキストプロトコルに従って溶液およびタンパク質試料を調製した後、120 millilitersの安定化ピラニア溶液を用いて、50 degrees Celsiusで90分間、超音波洗浄によりゴールドチップを洗浄してください。

水を用いてチップを洗浄し、水中で5分間超音波洗浄を行います。次に、チップをエタノールで洗浄し、窒素気流を用いて乾燥させます。金チップをUVオゾン洗浄機に入れ、30分間処理して汚染物質を除去します。

次に、チップを固定するためのプラスチックキャップと、溶液を均一に混合するための撹拌子が入った試験管に、11-メルカプトウンデカン酸 150 milligramsをエタノール 20 millilitersに加えて溶解させます。試験管にチップを入れ、キャップを締めます。その後、試験管を50 watts、50 degrees Celsiusで5分間マイクロ波加熱します。

エタノールでチップをすすぎ、そのままエタノールに5分間浸します。水を用いてすすぎを繰り返し、5分間浸します。スターバーを入れた試験管内の20 millilitersの水に、1-Ethyl-3-carbodiimideを150 milligrams加えます。

チップを試験管に移し、先ほど示した方法で電子レンジ加熱します。水でチップをすすぎ、水に5分間浸します。次に、撹拌子を入れた試験管内の 20 milliliters の水に、150 milligrams の N-Hydroxysuccinimide を加えます。

チップを試験管に入れ、キャップで密閉して電子レンジで加熱します。前述と同様にチップを水で洗浄および浸漬した後、250 µMのポリエチレングリコールを20 mLの水に溶解した溶液を、スターラーバーを入れた試験管に加えます。そこにチップを加えて電子レンジで加熱し、その後、前述と同様に水で洗浄および浸漬します。

15 µg/mLの抗rhGH抗体溶液および陰性コントロールとしての抗IgGを調製し、384ウェルプレートの各ウェルに10 µLずつ分注します。マイクロアレイヤーでスポットパターンを設計し、500 µmのテフロンチップピンを用いて、チップに抗体をスポットします。スポットしたチップを室温、湿度75%の条件下で2時間インキュベートします。

SPRi実験のセットアップを行い、テキストプロトコルに従ってチップをブロッキングした後、10%血清および1 mg/mL BSAを含むPBSを用いて、以下の濃度セットのrhGH溶液を調製します。このステップで選択するブロッキング分子の種類を強調することが重要です。その目的は、非特異的相互作用を最小限に抑えることにあるからです。

0.5 mLマイクロ遠心チューブに、1 µMのストレプトアビジン修飾近赤外量子ドット 3 µLと、6 µMのビオチン標識抗rhGH検出抗体 1 µLを加え、2:1の溶液を調製します。注入ループに、hGHを添加したヒト血清溶液 150 µLを注入します。信号が強く増加した後、表面から非特異的に結合した血清が洗浄されるため、緩やかに減少します。

信号が安定したら、ランニングバッファーに450 millimolarの塩化ナトリウムを加えた溶液を用いて、表面を洗浄します。抗rhGH検出抗体と量子ドットの溶液をランニングバッファーで10 nanomolarの濃度まで希釈し、フローセルに注入します。データをデータ解析プログラムに取り込みます。

次に、SPRi信号を時間に対してプロットし、高塩濃度洗浄後のanti-rhGHスポットと陰性対照抗体スポットとの差を決定します。ELISAを実施するために、テキストプロトコルに従って試薬、抗体コートウェル、および標準品を調製した後、10%ヒト血清中のrhGHホルモンのサンプルを以下の濃度で調製します。各標準品、対照、およびサンプルを50 µLずつ、各ウェルに3連（triplicate）で加えます。

次にウェルを密封し、4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。翌日、プレートをシェーカーから取り出し、室温に戻します。anti-rhGH HRP、コンジュゲートバッファー、洗浄バッファー、発色剤のテトラメチルベンジジン（TMB）、および停止試薬を室温に温めておきます。

作業用試薬を調製するために、コンジュゲートバッファーを用いてanti-rhGH HRPを40倍に希釈します。蒸留水を用いて洗浄バッファーを200倍に希釈します。各ウェルにanti-rhGH HRPコンジュゲートを50 microlitersずつ加えます。

ウェルを密封し、緩やかに揺らしながら室温で30分間インキュベートします。ウェルから溶液を捨て、プレートを逆さにして吸水性のティッシュの上で叩いて水分を除去します。各ウェルに200 microlitersの洗浄バッファーを加え、再び溶液を捨てて叩いて水分を除去します。

洗浄を3回繰り返します。ピペットのみでは不十分なため、プレートをタッピングして副試薬を完全に除去することが重要です。次に、洗浄ステップから15分以内に、各ウェルに100 µLの発色剤を加えます。

室温の暗所で、緩やかに振盪しながら30分間インキュベートします。無色の溶液が青色に変化します。各ウェルにストップ試薬を100 microliters加えます。

溶液は青色から黄色に変化します。プレートリーダーを用いて450 nanometersで各ウェルの吸光度を直ちに測定してください。最後に、提供された標準物質を用いて標準曲線を作成し、10%serumサンプル中のrhGHの光学密度を各サンプルの濃度に対してプロットしてください。

このビデオでは、rhGHの検出におけるSPRiおよびnano-SPRiの性能をELISAと比較しました。この図は、10%ヒト血清にスパイクしたrhGHの滴定曲線であり、450ナノメートルで得られたODに対してプロットされています。良好な線形応答が観察され、検出限界は1 ng/mLと決定されました。

ここでは、SPRiを用いてrhGHの検出能を評価しました。濃度勾配曲線の各点は、各濃度について3本のSPRiキネティック曲線から算出された反射率差の平均値を表しています。検出限界（LoD）は3.61 nanograms per milliliterと決定されました。

SPRiバイオセンサの感度を向上させるため、ナノエンハンサーをセンサに順次導入しました。本実験において、ナノエンハンサーはバイオセンサの応答を最大7.9%増幅させましたが、コントロールへの信号変化は最小限にとどまりました。ナノSPRiバイオセンサの実用性は、30,000から0.25 pg/mLの範囲のrhGHを測定することで評価しました。

LoDは9.2 picograms per milliliterと算出され、変動係数は20%でした。この手法を習得し、適切に実施すれば、直接検出では1時間、nano-SPRiでは2時間で完了させることができます。本手順を行う際は、各ステップの条件を最適化することが重要であり、最適化後はより短時間で結果を容易に再現することが可能です。本手順に続き、SPRi実験後にチップ上で直接multi-tuffやmaspeck解析などの他の手法を行うことで、捕捉した分子に関するさらなる知見を得ることができます。

本手法の開発により、医療診断分野の研究者が、がん、神経疾患、および心血管疾患に関連する複数のバイオマーカーの同時検出を探索するための道が開かれることが期待されます。このビデオを視聴することで、ヒト血清中のhGHレベルを検出するためのSPRi、nano-SPRi、およびELISAアッセイのセットアップ方法について十分に理解できるはずです。試薬の取り扱いは非常に危険な場合があるため、本手順を実施する際は、常に手袋や保護メガネの着用などの予防措置を講じてください。