トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略
2016年4月17日
この記事では、指向性応答の間にplasmodesmal透過性、ひいてはオーキシン勾配を制御する遺伝子をスクリーニングするための方法を説明します。これは、胚軸における向性応答の程度の測定を含みます シロイヌナズナおよび8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）ロードし、最終的にカロースレベルの評価によりplasmodesmal透過性を確認します。
この手順の全体的な目標は、熱帯反応中の脳底媒介性体質ゲーティングに関与する遺伝子をスクリーニングすることです。この方法は、熱帯応答中にどの未知の遺伝子がplasmodesmataによる細胞間シグナル伝達を制御するかなど、植物発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで、機能も、繰り返し再生できることです。
一般的に、この方法に不慣れな個人は、シロイヌナズナの黄化心軸を全プロセス中に損傷を受けずに取り扱うことが難しいため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、原形質ゲーティングにおけるグルコース合成酵素であるGSL8のルールを確立したときでした。オーディオで言及されている手順では、特別なセットアップと処理が必要だったために実行が困難な重要なステップが説明されていないため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。
実験の1日前に、MurashigeとSkoog、またはMS培地を準備します。それをオートクレーブし、125ミリメートル四方のプレートにプレートあたり50ミリリットルのメディアを充填します。翌日、半乾燥プレートに1.1%次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した種子を点在させます。
1mmのマイクロピペットの先端から、200マイクロリットルの水で種を点在させます。種子を1.8センチ間隔で5列に並べ、種子は列内で最低0.1センチメートル離れています。プレートをサージカルテープで覆って密封する前に、水を蒸発させます。
次に、プレートをホイルで包み、箱に入れます。ボックスを摂氏4度で3日間インキュベートします。3日間の冷処理の後、種子の箱を摂氏22度に3日間移します。
さらに3日後、暗い部屋で、緑色の光の下で種子の発芽状況を確認します。通常、生後3日のCol-0黄化苗は、長さが最大1.6センチメートルまで成長します。緑色のライトの下で、変化した光向性および重力応答を解析します。
滅菌されたピックを使用して、まっすぐな垂直に成長する同様のサイズの苗を選択します。他の部分に触れずに、子軸の最も低い部分から苗をそっと持ち上げます。次に、選択した苗を新鮮なMS寒天プレートに慎重に移します。
新しいプレートで、苗のフックを同じように向けます。各遺伝的背景の苗木を少なくとも20本選択して各列を作成し、すべてのプレートの複製を作成します。各プレートには、2つの遺伝子型が2列に並んでいます。
光屈性反応を確認するには、プレートをブラックボックスに配置して、苗が垂直に向くようにします。ボックスの片側をプレートの端まで開いたままにしておきます。次に、ボックスを片側白色光のある植物成長チャンバーでインキュベートします。
重力応答を確認するには、プレートをホイルで包み、苗が水平になるようにブラックボックスに入れます。いくつかの時点(通常は90分から始まり、12時間まで)で、暗い条件下でプレートを画像化します。スキャナーセットを使用して、600 DPI JPEG画像を収集します。
苗の曲げ角度を測定するには、ImageJソフトウェアに画像をロードします。拡大ツールを使用してズームインし、解析する苗までスクロールします。次に、角度ツールを使用して、苗が曲がる角度を測定します。
これを行うには、元の胚軸の成長方向ポイントAをダブルクリックし、マウスを曲げ開始ポイントBにドラッグします。次に、マウスを点Bから曲げ端の点Cにドラッグし、左クリックして2番目の線を描画し、角度Aを形成します。真の曲げ角度は角度Bで、180度から角度Aを引いたものに等しくなります。ここで、キーボードのMを押して角度Aを測定して記録します。結果ファイルは個別に開きます。
前の手順を繰り返して残りの苗木を測定し、データセットのスプレッドシートファイルを使用して2つの異なる背景の平均角度を測定します。このアッセイに必要なHPTSアガロースブロックの調製は、テキストプロトコールで説明されています。植物サンプルの準備から始めます。
この例では、plasmodesmataサイズの除外限界が変更された変異体が解析されます。まず、アッセイ用のプラットフォームを作成します。顕微鏡カバースライドを新しいMSミディアムプレートに置きます。
次に、3日齢の黄化苗が入ったMSプレートから、鋭利な手術用ハサミを使用してフックの付け根から苗を慎重に切除し、カバーガラスに移します。遺伝的背景ごとに少なくとも5本の苗木を移します。切除位置から0.5センチメートルの胚軸だけがカバースライドに残り、残りの胚軸が培地に触れるように苗を向きます。
次に、切除した苗の上にHPTSアガロースブロックを置き、切除された領域がHPTSブロックに接触するようにします。連絡がとられていることを確認してください。ブロックを胚軸に5分間置いておきます。
その後、倍水を入れた10mmシャーレに胚軸を移し、15分間振とうしながら洗います。次に、洗浄した苗をスライドに移します。各変異体をコントロールの隣に配置して、直接比較します。
胚軸を100〜150マイクロリットルの二重蒸留水で覆い、カバースライドを適用します。次に、テキストプロトコルで説明されているように、共焦点顕微鏡を使用してスライドを分析します。このアッセイには、2日未満の新鮮な調製済み染料を使用し、暗所に保管します。
de novoカロース合成を阻害するには、染料に1.5ミリモルの2-デオキシ-D-グルコースを添加します。このアッセイは、カルロース染色用の生後3日齢の黄化苗を選択することから始めます(トロピックレスポンスの有無にかかわらず)。細い手術用ハサミを使用して、フック部分から苗を切り取ります。
次に、つまようじの先端を使用して、2ミリリットルの染色緩衝液が入った小さなシャーレに苗を移します。暗所の染色緩衝液で苗を2時間インキュベートし、30 RPMで連続的に振とうします。染色後、苗木を二度蒸留水で2分間洗浄し、余分な染色緩衝液を除去します。
洗浄したら、共焦点分析のために各バックグラウンドの少なくとも5つの苗を選択します。ImageJソフトウェアでカロース信号強度を測定します。JPEG形式で保存した共焦点顕微鏡ファイルをイメージングソフトウェアで開きます。
次に、長方形の選択ツールを使用して、カーソルを画像にドラッグし、調査する領域を選択します。次に、Mを押して信号強度の数値を測定し、記録します。結果ファイルでは、「平均」という用語は、選択した領域の信号強度を示し、複数の領域の平均を示します。
この方法で、苗ごとに信号を1つずつ解析します。上記の手順を繰り返して残りの苗木を測定し、データセットスプレッドシートファイルを使用して2つの異なる背景の平均角度を測定します。記載されたプロトコルを用いて、AtGSL8のデキサメタゾン誘導性RNAi株を分析した。
DsGSL8の実生は、光屈性および重力に明らかに欠陥があった。彼らはどちらの力の影響でも曲がることを示さなかった。共形質運動の変化は、HPTSA色素の移動がdsGSL8 RNAiノックダウンにおいて、どちらの対照よりも大幅に広範であることを示しました。
Calloseはplasmodesmataのサイズ排除限界の主要な調節因子の1つであり、AtGSL8は知られているplasmodesmataのcalloseのシンターゼである。そこで、カロースアニリンブルー染色を行いました。コントロールでは、黄色の矢印でマークされているように、カロースが6時間後に蓄積しました。
しかし、6時間後、変異体は持続的に低血漿質カリロースレベルを示しました。このカロース合成の欠如は、光屈性後3時間という早い時期に測定可能なほど減少しました。このビデオを見た後、純粋にタロースを調節することにより、熱帯応答による体質藻質ゲーティングを制御するバリアントの遺伝子の迅速なスクリーニングを行う方法を十分に理解しているはずです。
習得すると、この技術はシロイヌナズナの苗の3日間の発芽後約6時間で行うことができます。この手順を試みるときは、苗を移す際に苗を傷つけないように注意することが重要です。また、ローディングアッセイ中に寒天と胚軸との間に適切な接触をすることも重要です。
この開発の後、この技術は、熱帯期の共形伝導性を制御する役割を果たす遺伝子、新しい遺伝子を探索するための発生生物学への道を開きました
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、植物のトロピック反応におけるプラズモデスマの透過性とオーキシンの勾配を調節する遺伝子のスクリーニング方法について概説します。アラビドプシス・サリアナの仮軸に焦点を当て、プラズモデスマの透過性とカロースのレベルを評価します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物発生生物学
- 細胞間シグナリング
- 遺伝子スクリーニング
背景
- プラズモデスマのゲーティングの理解は植物シグナリングにとって重要です。
- カロースはプラズモデスマの透過性を調節する上で重要な役割を果たします。
- 植物のトロピック反応には複雑な遺伝的相互作用が関与しています。
- アラビドプシス・サリアナはこれらの研究のモデル生物として機能します。
研究の目的
- トロピック反応時のプラズモデスマシグナリングを制御する未知の遺伝子を特定すること。
- カロースによるプラズモデスマゲーティングの理解を深めること。
- この分野の研究者に簡単な方法論を提供すること。
使用した方法
- アラビドプシス仮軸におけるトロピック反応の測定。
- HPTSローディングを用いたプラズモデスマ透過性の評価。
- 植物組織におけるカロースレベルの評価。
- 方法の実行を助ける視覚的デモンストレーション。
主要な結果
- プラズモデスマゲーティングに関与する主要遺伝子の特定。
- 制御された条件下でのトロピック反応の測定の成功。
- この方法の有効性と再現性の実証。
- アラビドプシス仮軸の取り扱いの課題の強調。
結論
- この方法は植物シグナリングの遺伝的制御に関する洞察を提供します。
- 視覚的な補助は、この技術の成功した実装に不可欠です。
- さらなる研究はこれらの知見を基に、他の遺伝的要因を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding gene-mediated regulation of plasmodesmal connectivity provides mechanistic insight into auxin gradient formation, a foundational process in plant developmental signaling. This strategy enables systematic identification of genetic regulators of symplasmic gating, supporting target validation in plant signaling pathways. Such knowledge aids in de-risking hypotheses about intercellular communication mechanisms relevant to crop trait development and stress response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses linking plasmodesmal callose synthesis to tropic response phenotypes.
- Operational Value: Uses aberrant tropic response screening in seedlings to prioritize genes affecting symplasmic connectivity.
- Scientific Value: Supports functional validation of candidate genes via symplasmic tracer movement and callose deposition assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes quantitative plasmodesmal permeability readouts using HPTS agarose block assays.
- Operational Value: Standardizes callose synthesis inhibition via 2-Deoxy-D-glucose treatment for comparative analysis.
- Scientific Value: Enables confocal microscopy-based signal intensity measurement to assess plasmodesmal gating dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links gene modulation to altered symplasmic connectivity during tropic responses, informing mechanistic models.
- Operational Value: Facilitates cross-genetic background comparison using duplicate plate designs and standardized hypocotyl excision.
- Scientific Value: Supports phenotypic screening workflows for genes influencing cell-to-cell signaling in developmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by connecting genetic screening to functional validation of plasmodesmal regulators, informing downstream target confidence assessments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes controlling cell-to-cell signaling via plasmodesmata during tropic responses.
- Screening: Enables assay readiness through standardized HPTS loading and callose staining protocols for permeability and gating quantification.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (bending angle, signal intensity) enabling condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Provides mechanistic continuity from gene perturbation to symplasmic connectivity changes in tropic response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for genes modulating symplasmic signaling in plant developmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking gene function to plasmodesmal gating mechanisms.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized seedling handling, plate duplication, and blinded angle measurement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target prioritization by reducing mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with validated roles in symplasmic connectivity regulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Arabidopsis seedling sterilization, plating, and hypocotyl handling without mechanical damage.
- Dependent on instrumentation for confocal microscopy, ImageJ analysis, and controlled light/temperature growth chambers.
- Necessitates cross-team standardization for tropic response imaging, callose staining, and symplasmic tracer assay execution.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different genetic backgrounds or developmental stages.
- Includes practical limitations such as seedling transfer sensitivity and the need for precise agar-hypocotyl contact during loading assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Screening for Altered Phototropic or Gravitropic Responses
4:09
Analysis of Seedling Bending Angles
5:32
Hypocotyl Assay: HPTS Dye-loading
7:30
Callose Aniline Blue Staining
8:44
Analysis of Callose Signal
9:45
Results: Screening AtGSL8 RNAi Plants
11:06
Conclusion
