Name: トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶカロース媒介プラスモデスマゲーティングの遺伝子スクリーニング法。Arabidopsis thaliana下胚軸を用いて、向性応答における細胞間シグナル伝達を制御する遺伝子を同定し、植物発生生物学の理解を深める実験手法です。

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本研究では、韓国の国立研究財団（NRF-2015R1A2A1A10053576）によってサポートされていました、そして次世代BioGreen 21プログラムからの助成金によって（SSACは、PJ01137901を付与）、農村振興庁、韓国。 RK、WS、ABBとDKは脳韓国21・プラス・プログラム（BK21 +）でサポートされていました。

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<li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+of+auxin+transport%3A+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li>
<li>Band, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+is+regulated+by+a+transient+lateral+auxin+gradient+controlled+by+a+tipping+point+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).</li>
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</ol>

著者は何の開示を持っていません。

本稿では、戦略が原因したがって、PD SELが詳細に記載されている変更されたPDのカロースと、への屈光性や重力屈性応答の欠陥がある変異型/過剰発現株をスクリーニングします。 PDのカロース合成および分解は、主にカロース合成酵素とβ-1,3-グルカナーゼにより達成されるが、これらの酵素の調節は、多くの上流の因子によって制御されます。このような上流因子または直接PDの調節に関与する候補者を検索するには、我々は、スクリーニングのために、この方法を設定しています。これは、セットアップのPDカロース生合成（gsl8）を調節するいくつかの重要な酵素の変異体は15致死であり、これは設定によって制限されるような変異体を選別するようにいくつかの制限があります。候補遺伝子が速いか開いているか閉じてPDと一緒に遅く熱帯の応答を示したが、カロースのレベルが変わらない場合も、その後、詳細な解析は、さらに、そのような候補を特徴づけるために必要とされています。重要な要因とトラブルシューティングproce各ステップにおけるSSESも詳述されています。まず、培地調製において、植物の成長に影響を与えることができる重要な要因は、5.7...

植物は、固着生命体として、様々な環境刺激に対処するために、細胞から細胞へのシグナル伝達の高度に洗練されたネットワークを開発しました。トロピック応答は、植物が環境刺激に応答することにより、現象の一つです。植物は、主に2つの指向性応答、光屈性と重力屈性を示しています。光合成植物は、最大エネルギーを収穫する光屈性により光源に向かって曲がります。同様に、重力屈性は、植物が重力の中心に向かって成長することができます。このような熱帯の応答につながる基本的なメカニズムは、植物ホルモンのオーキシン1の非対称勾配の形成を伴います。地元のオーキシン勾配形成の行為は十分に特徴付けされています。このメカニズムに関与する遺伝子は、ホルモン作用2-8のためのロードマップを提供します。オーキシン例えばPIN形成（PIN）として排出される担体、およびP糖タンパク質の特定の位置は、ドナー細胞9,10の細胞壁への細胞質からオーキシンの移動を実行します。 Furthermore、このようなAUX1 / LAXファミリータンパク質としてオーキシン流入キャリアのアクティブH + / IAA共輸送活性により、オーキシンは、最終的には、隣接するレシーバセル2,11,12に配信されます。オーキシンのこの方向の動きは、極性オーキシン輸送（PAT）として知られています。 PATは、種々の発生段階の間に、別の環境刺激13,14に応答して、差動オーキシン分布につながります。また、これらのオーキシンの流入や流出担体のいずれかの局在または発現の破壊は、発達障害につながる、オーキシン勾配の破壊を引き起こすPATの深刻な変化をもたらします。近年、Han ら 。 plasmodesmal規制はオーキシン勾配15を維持するためにも必要であることを報告しました。今日まで、30以上のplasmodesmalタンパク質16が同定されています。これらのタンパク質のうち、AtGSL8は原形質連絡にカロース合成の鍵酵素（PD）として報告されているので、のmaintで重要な役割を果たしていますPDサイズ排除限界（SEL）をaining。抑制AtGSL8発現は、野生型苗15とは対照的に、無指向性応答につながる歪んだオーキシン勾配パターンが得られました。 本稿では、PDの調節に関与する新たな候補遺伝子を探索するための方法が提供されます。これはPDのカロース生合成に寄与する重要な酵素であるようAtGSL8は、これらの方法を試験するためのモデルタンパク質として使用しました。ノックアウトgsl8変異体17の苗-致死に、デキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAi線は以前に発表された報告書15に従って使用しました。ここで提供される戦略は、PD SELによって制御される胚軸指向性応答に関与する遺伝子をスクリーニングするために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>HPTS(8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム塩)</td><td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>共形トレーサーとしての蛍光色素</td></tr><tr><td>LEアガロース</td><td>ドンギン-ゲノム</td><td>GEL001-500G</td><td>HPTSアガロースブロックに使用</td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>LG-ゴールドスター</td><td></td><td>アガロースゲル沸騰機</td></tr><tr><td>100ml ガラス円錐フラスコ</td><td>ドンクァン</td><td>A0205</td><td>HPTSアガロースの沸騰に使用ゲル</td></tr><tr><td>ペトリ皿(35 mm x 10 mm)</td><td>SPLライフサイエンス</td><td>SPL10035</td><td>HPTSアガロースブロックの作成および植物サンプルの洗浄に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡カバースライドとスライドガラス(24mm×50mm)</td><td>マリエンフェルトラボラトリーガラス器具</td><td>101222</td><td>HPTSアガロースブロックや顕微鏡サンプル調製に使用</td></tr><tr><td>MSミディアムプレート 125mm×125mm×20mm</td><td>SPLライフサイエンスSPL11125</td><td></td><td>MS寒天培地を作るためのプレート</td></tr><tr><td></td><td>ドイツステンレス</td><td>HSB 942-11</td><td>植物サンプル</td></tr><tr><td>のフック領域を切除するために使用されますMurashigeとSkoog(MS)の基礎塩混合物</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS中毒ビタミンを含む。</td></tr><tr><td>(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)一水和物</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>MS培地を作るため。</td></tr><tr><td>植物寒天</td><td>Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>MS培地を固化します。</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>シェイカー</td><td>ワイズミックス</td><td>SHO-1D</td><td>アニリンブルー染色緩衝液とHPTS染料を穏やかに洗い流します。</td></tr><tr><td>1 ml ブルーチップ</td><td>ソレンソン</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>1 ml ピペット</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>ミクロポア</td><td>1530-0</td><td>MS プレートをシールする</td></tr><tr><td>アニリンブルー (メチルブルー)</td> <td>シグマ</td><td>M5528-25G</td><td>アニリンブルー染色緩衝液の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td>アニリンブルー染色バッファーの調製に使用します。</td></tr><tr><td>DDG</td><td>Sigma</td><td>D8375-1G</td><td>カロースシンターゼの阻害に使用されます。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>アニリンブルー染色とHPTS色素ローディング結果を確認します。</td></tr><tr><td>スターラー&nbsp;</td><td>私は研究室&nbsp;</td><td>K400</td><td>メディア溶液をミックスします。</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>SWクッキングホイル</td><td></td>暗い<td>状態でプレートを包みます。</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>三進工業</td><td></td><td>表面滅菌種子へ</td></tr></tbody></table>

トロピック応答におけるカロース媒介plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

植物ホルモンのオーキシンは、光と重力向性応答を含む多くの成長と発達の過程で重要な役割を果たしています。オーキシン勾配の確立は光屈性と重力屈性につながる重要なイベントです。以前に、極性オーキシン輸送（PAT）は、植物の異なる細胞ドメインでオーキシン勾配を確立することが示されました。しかし、Han らは 、最近、適切なオーキシン勾配形成のために、隣接するセル間plasmodesmalカロース媒介symplasmic接続性も重要な要素であることを実証しました。本稿では、plasmodesmalカロース合成を調節することを通じてsymplasmic接続を変更することによって光屈性と重力屈性に影響を与える可能性があり、特定の遺伝子の役割を解明するための戦略が議論されています。最初のステップは、野生型と一緒に突然変異体または遺伝子の過剰発現株の3日齢の黄化苗から異常な熱帯応答をスクリーニングすることです。この予備スクリーニングPATで機能やsymplasmicの接続を制御する遺伝子の範囲の同定につながることができます。二次スクリーニングはsymplasmic接続に影響することにより改変された指向性応答を示す候補の選別を伴います。このような候補者に対処するために、symplasmicトレーサーの動きとplasmodesmalカロースの沈着を調べました。この戦略は、熱帯応答や他の発達プロセスの間に直接的または間接的にsymplasmic接続性を調節することができる新たな候補遺伝子を探索するのに有用であろう。

ホモ接合gsl8 T-DNA挿入変異体は致死18苗されているように、現在の設定では、AtGSL8のデキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAiラインを使用した[（+ DEX / -dex）がdsGSL8を以後]。 dsGSL8と±デキサメタゾンと野生型苗の三日齢の黄化苗は屈光性や重力屈性刺激に曝露しました。我々はdsGSL8（+ DEX）苗は光屈性と重力屈性15で不良品であることがわかった。 図5明らかにdsGSL8（+ DEX）は光屈性と重力屈性の両方の影響を受けない曲げを示さないことを示しています。また、dsGSL8（+ DEX）とdsGSL8（-dex）またはCOL-0でsymplasmic動きの変化は、HPTSローディングアッセイによって分析しました。我々の以前の知見と一致して、HPTS色素dsGSL8の動き（+ ...

この記事では、指向性応答の間にplasmodesmal透過性、ひいてはオーキシン勾配を制御する遺伝子をスクリーニングするための方法を説明します。これは、胚軸における向性応答の程度の測定を含みます シロイヌナズナおよび8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）ロードし、最終的にカロースレベルの評価によりplasmodesmal透過性を確認します。

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

本手順の全体的な目的は、屈性反応におけるカローゼ介在性の原形質連絡ゲート制御に関与する遺伝子をスクリーニングすることです。この手法は、屈性反応中にどの未知の遺伝子が原形質連絡による細胞間シグナリングを制御しているかなど、植物発生生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、簡便であり、有効に機能し、再現性があることです。一般的に、この手法に慣れていない方は、全工程を通してArabidopsisの黄化した胚軸を損傷させることなく扱うことが困難であるため、苦労することがあります。私たちは、原形質連絡のゲート制御におけるグルコース合成酵素であるGSL8の役割を解明しようとしていた際に、初めてこの手法を考案しました。オーディオで言及されている手順だけでは、特別なセットアップや操作が必要で実行が難しい重要なステップについて十分に説明されていないため、この手法を視覚的に提示することが不可欠です。実験の前日に、Murashige and Skoog培地（MS培地）を調製します。オートクレーブ滅菌後、125 mm四方のプレートに1枚あたり50 mLずつ培地を分注します。翌日、1.1%次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した種子を、半凝固状態のプレート上に点在させます。1 mmのマイクロピペットチップを用い、200 µLの水で種子に滴下します。種子を1.8 cm間隔で5列に配置し、列内の種子間隔は最低0.1 cmとします。水をある程度蒸発させた後、プレートに蓋をしてサージカルテープで密封します。次に、プレートをアルミホイルで包み、ボックスに入れます。このボックスを4 °Cで3日間インキュベートします。3日間の低温処理後、種子の入ったボックスを22 °Cに移し、さらに3日間置きます。暗室でさらに3日間置いた後、緑色光の下で種子の発芽状況を確認します。通常、3日経過したCol-0の黄化苗は、長さ1.6 cmまで成長します。緑色光の下で、変化した光屈性と重力屈性反応を解析します。滅菌したピックを使用して、直立して垂直に成長した、大きさが揃っている苗を選択します。他の部分に触れないように、下胚軸の最も低い部分から苗をそっと持ち上げます。その後、選択した苗を新しいMS寒天プレートに注意深く移します。新しいプレート上で、苗のフックをすべて同じ方向に向けて配置します。各行を作成するために、各遺伝的背景から少なくとも20本の苗を選択し、すべてのプレートを二連（デュプリケート）で作成します。各プレートには2つの遺伝子型が2行にわたって含まれます。光屈性を確認するために、苗が垂直になるようにプレートをブラックボックス内に配置します。ボックスの片側をプレートの端に合うように開けておきます。その後、一方向から白色光が照射される植物育成チャンバー内でボックスをインキュベートします。重力応

a-strategy-to-validate-role-callose-mediated-plasmodesmal-gating

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