Name: トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶカロース媒介プラスモデスマゲーティングの遺伝子スクリーニング法。Arabidopsis thaliana下胚軸を用いて、向性応答における細胞間シグナル伝達を制御する遺伝子を同定し、植物発生生物学の理解を深める実験手法です。

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本研究では、韓国の国立研究財団（NRF-2015R1A2A1A10053576）によってサポートされていました、そして次世代BioGreen 21プログラムからの助成金によって（SSACは、PJ01137901を付与）、農村振興庁、韓国。 RK、WS、ABBとDKは脳韓国21・プラス・プログラム（BK21 +）でサポートされていました。

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著者は何の開示を持っていません。

本稿では、戦略が原因したがって、PD SELが詳細に記載されている変更されたPDのカロースと、への屈光性や重力屈性応答の欠陥がある変異型/過剰発現株をスクリーニングします。 PDのカロース合成および分解は、主にカロース合成酵素とβ-1,3-グルカナーゼにより達成されるが、これらの酵素の調節は、多くの上流の因子によって制御されます。このような上流因子または直接PDの調節に関与する候補者を検索するには、我々は、スクリーニングのために、この方法を設定しています。これは、セットアップのPDカロース生合成（gsl8）を調節するいくつかの重要な酵素の変異体は15致死であり、これは設定によって制限されるような変異体を選別するようにいくつかの制限があります。候補遺伝子が速いか開いているか閉じてPDと一緒に遅く熱帯の応答を示したが、カロースのレベルが変わらない場合も、その後、詳細な解析は、さらに、そのような候補を特徴づけるために必要とされています。重要な要因とトラブルシューティングproce各ステップにおけるSSESも詳述されています。まず、培地調製において、植物の成長に影響を与えることができる重要な要因は、5.7...

植物は、固着生命体として、様々な環境刺激に対処するために、細胞から細胞へのシグナル伝達の高度に洗練されたネットワークを開発しました。トロピック応答は、植物が環境刺激に応答することにより、現象の一つです。植物は、主に2つの指向性応答、光屈性と重力屈性を示しています。光合成植物は、最大エネルギーを収穫する光屈性により光源に向かって曲がります。同様に、重力屈性は、植物が重力の中心に向かって成長することができます。このような熱帯の応答につながる基本的なメカニズムは、植物ホルモンのオーキシン1の非対称勾配の形成を伴います。地元のオーキシン勾配形成の行為は十分に特徴付けされています。このメカニズムに関与する遺伝子は、ホルモン作用2-8のためのロードマップを提供します。オーキシン例えばPIN形成（PIN）として排出される担体、およびP糖タンパク質の特定の位置は、ドナー細胞9,10の細胞壁への細胞質からオーキシンの移動を実行します。 Furthermore、このようなAUX1 / LAXファミリータンパク質としてオーキシン流入キャリアのアクティブH + / IAA共輸送活性により、オーキシンは、最終的には、隣接するレシーバセル2,11,12に配信されます。オーキシンのこの方向の動きは、極性オーキシン輸送（PAT）として知られています。 PATは、種々の発生段階の間に、別の環境刺激13,14に応答して、差動オーキシン分布につながります。また、これらのオーキシンの流入や流出担体のいずれかの局在または発現の破壊は、発達障害につながる、オーキシン勾配の破壊を引き起こすPATの深刻な変化をもたらします。近年、Han ら 。 plasmodesmal規制はオーキシン勾配15を維持するためにも必要であることを報告しました。今日まで、30以上のplasmodesmalタンパク質16が同定されています。これらのタンパク質のうち、AtGSL8は原形質連絡にカロース合成の鍵酵素（PD）として報告されているので、のmaintで重要な役割を果たしていますPDサイズ排除限界（SEL）をaining。抑制AtGSL8発現は、野生型苗15とは対照的に、無指向性応答につながる歪んだオーキシン勾配パターンが得られました。 本稿では、PDの調節に関与する新たな候補遺伝子を探索するための方法が提供されます。これはPDのカロース生合成に寄与する重要な酵素であるようAtGSL8は、これらの方法を試験するためのモデルタンパク質として使用しました。ノックアウトgsl8変異体17の苗-致死に、デキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAi線は以前に発表された報告書15に従って使用しました。ここで提供される戦略は、PD SELによって制御される胚軸指向性応答に関与する遺伝子をスクリーニングするために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>HPTS(8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム塩)</td><td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>共形トレーサーとしての蛍光色素</td></tr><tr><td>LEアガロース</td><td>ドンギン-ゲノム</td><td>GEL001-500G</td><td>HPTSアガロースブロックに使用</td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>LG-ゴールドスター</td><td></td><td>アガロースゲル沸騰機</td></tr><tr><td>100ml ガラス円錐フラスコ</td><td>ドンクァン</td><td>A0205</td><td>HPTSアガロースの沸騰に使用ゲル</td></tr><tr><td>ペトリ皿(35 mm x 10 mm)</td><td>SPLライフサイエンス</td><td>SPL10035</td><td>HPTSアガロースブロックの作成および植物サンプルの洗浄に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡カバースライドとスライドガラス(24mm×50mm)</td><td>マリエンフェルトラボラトリーガラス器具</td><td>101222</td><td>HPTSアガロースブロックや顕微鏡サンプル調製に使用</td></tr><tr><td>MSミディアムプレート 125mm×125mm×20mm</td><td>SPLライフサイエンスSPL11125</td><td></td><td>MS寒天培地を作るためのプレート</td></tr><tr><td></td><td>ドイツステンレス</td><td>HSB 942-11</td><td>植物サンプル</td></tr><tr><td>のフック領域を切除するために使用されますMurashigeとSkoog(MS)の基礎塩混合物</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS中毒ビタミンを含む。</td></tr><tr><td>(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)一水和物</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>MS培地を作るため。</td></tr><tr><td>植物寒天</td><td>Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>MS培地を固化します。</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>シェイカー</td><td>ワイズミックス</td><td>SHO-1D</td><td>アニリンブルー染色緩衝液とHPTS染料を穏やかに洗い流します。</td></tr><tr><td>1 ml ブルーチップ</td><td>ソレンソン</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>1 ml ピペット</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>ミクロポア</td><td>1530-0</td><td>MS プレートをシールする</td></tr><tr><td>アニリンブルー (メチルブルー)</td> <td>シグマ</td><td>M5528-25G</td><td>アニリンブルー染色緩衝液の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td>アニリンブルー染色バッファーの調製に使用します。</td></tr><tr><td>DDG</td><td>Sigma</td><td>D8375-1G</td><td>カロースシンターゼの阻害に使用されます。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>アニリンブルー染色とHPTS色素ローディング結果を確認します。</td></tr><tr><td>スターラー&nbsp;</td><td>私は研究室&nbsp;</td><td>K400</td><td>メディア溶液をミックスします。</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>SWクッキングホイル</td><td></td>暗い<td>状態でプレートを包みます。</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>三進工業</td><td></td><td>表面滅菌種子へ</td></tr></tbody></table>

トロピック応答におけるカロース媒介plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

植物ホルモンのオーキシンは、光と重力向性応答を含む多くの成長と発達の過程で重要な役割を果たしています。オーキシン勾配の確立は光屈性と重力屈性につながる重要なイベントです。以前に、極性オーキシン輸送（PAT）は、植物の異なる細胞ドメインでオーキシン勾配を確立することが示されました。しかし、Han らは 、最近、適切なオーキシン勾配形成のために、隣接するセル間plasmodesmalカロース媒介symplasmic接続性も重要な要素であることを実証しました。本稿では、plasmodesmalカロース合成を調節することを通じてsymplasmic接続を変更することによって光屈性と重力屈性に影響を与える可能性があり、特定の遺伝子の役割を解明するための戦略が議論されています。最初のステップは、野生型と一緒に突然変異体または遺伝子の過剰発現株の3日齢の黄化苗から異常な熱帯応答をスクリーニングすることです。この予備スクリーニングPATで機能やsymplasmicの接続を制御する遺伝子の範囲の同定につながることができます。二次スクリーニングはsymplasmic接続に影響することにより改変された指向性応答を示す候補の選別を伴います。このような候補者に対処するために、symplasmicトレーサーの動きとplasmodesmalカロースの沈着を調べました。この戦略は、熱帯応答や他の発達プロセスの間に直接的または間接的にsymplasmic接続性を調節することができる新たな候補遺伝子を探索するのに有用であろう。

ホモ接合gsl8 T-DNA挿入変異体は致死18苗されているように、現在の設定では、AtGSL8のデキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAiラインを使用した[（+ DEX / -dex）がdsGSL8を以後]。 dsGSL8と±デキサメタゾンと野生型苗の三日齢の黄化苗は屈光性や重力屈性刺激に曝露しました。我々はdsGSL8（+ DEX）苗は光屈性と重力屈性15で不良品であることがわかった。 図5明らかにdsGSL8（+ DEX）は光屈性と重力屈性の両方の影響を受けない曲げを示さないことを示しています。また、dsGSL8（+ DEX）とdsGSL8（-dex）またはCOL-0でsymplasmic動きの変化は、HPTSローディングアッセイによって分析しました。我々の以前の知見と一致して、HPTS色素dsGSL8の動き（+ ...

この記事では、指向性応答の間にplasmodesmal透過性、ひいてはオーキシン勾配を制御する遺伝子をスクリーニングするための方法を説明します。これは、胚軸における向性応答の程度の測定を含みます シロイヌナズナおよび8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）ロードし、最終的にカロースレベルの評価によりplasmodesmal透過性を確認します。

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

本手順の全体的な目的は、屈性反応におけるカローゼ介在性の原形質連絡ゲート制御に関与する遺伝子をスクリーニングすることです。この手法は、屈性反応中にどの未知の遺伝子が原形質連絡による細胞間シグナリングを制御しているかなど、植物発生生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、簡便であり、有効に機能し、再現性があることです。一般的に、この手法に慣れていない方は、全工程を通してArabidopsisの黄化した胚軸を損傷させることなく扱うことが困難であるため、苦労することがあります。私たちは、原形質連絡のゲート制御におけるグルコース合成酵素であるGSL8の役割を解明しようとしていた際に、初めてこの手法を考案しました。オーディオで言及されている手順だけでは、特別なセットアップや操作が必要で実行が難しい重要なステップについて十分に説明されていないため、この手法を視覚的に提示することが不可欠です。実験の前日に、Murashige and Skoog培地（MS培地）を調製します。オートクレーブ滅菌後、125 mm四方のプレートに1枚あたり50 mLずつ培地を分注します。翌日、1.1%次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した種子を、半凝固状態のプレート上に点在させます。1 mmのマイクロピペットチップを用い、200 µLの水で種子に滴下します。種子を1.8 cm間隔で5列に配置し、列内の種子間隔は最低0.1 cmとします。水をある程度蒸発させた後、プレートに蓋をしてサージカルテープで密封します。次に、プレートをアルミホイルで包み、ボックスに入れます。このボックスを4 °Cで3日間インキュベートします。3日間の低温処理後、種子の入ったボックスを22 °Cに移し、さらに3日間置きます。暗室でさらに3日間置いた後、緑色光の下で種子の発芽状況を確認します。通常、3日経過したCol-0の黄化苗は、長さ1.6 cmまで成長します。緑色光の下で、変化した光屈性と重力屈性反応を解析します。滅菌したピックを使用して、直立して垂直に成長した、大きさが揃っている苗を選択します。他の部分に触れないように、下胚軸の最も低い部分から苗をそっと持ち上げます。その後、選択した苗を新しいMS寒天プレートに注意深く移します。新しいプレート上で、苗のフックをすべて同じ方向に向けて配置します。各行を作成するために、各遺伝的背景から少なくとも20本の苗を選択し、すべてのプレートを二連（デュプリケート）で作成します。各プレートには2つの遺伝子型が2行にわたって含まれます。光屈性を確認するために、苗が垂直になるようにプレートをブラックボックス内に配置します。ボックスの片側をプレートの端に合うように開けておきます。その後、一方向から白色光が照射される植物育成チャンバー内でボックスをインキュベートします。重力応答を確認するため、プレートをアルミホイルで包み、苗が水平になるようにブラックボックスに入れます。通常は90分から開始し、12時間まで、いくつかのタイムポイントで低光量条件下でプレートの画像を撮影します。スキャナーを使用し、600 DPIのJPEG形式で画像を収集するように設定してください。苗の曲がり角度を測定するために、ImageJソフトウェアに画像を読み込みます。拡大ツールを使用してズームし、解析する苗までスクロールします。次に、角度測定ツールを使用して、苗が曲がっている角度を測定します。この操作を行うには、元の胚軸の成長方向である点Aをマウスでダブルクリックし、曲がり始めの点Bまでドラッグします。次に、左クリックして1本目の線を描画します。続いて、点Bから曲がりの終点である点Cまでマウスをドラッグし、左クリックして2本目の線を描画して、角Aを形成させます。実際の曲がり角は角Bであり、これは180度から角Aを引いた値に等しくなります。ここで、キーボードのMキーを押して角Aを測定し、記録します。結果ファイルが別途開きます。残りの苗を測定するために前述のステップを繰り返し、データセットのスプレッドシートファイルを用いて、2種類の異なる背景における平均角度を測定します。本アッセイに必要なHPTSアガロースブロックの作製については、テキストプロトコルに記載されています。まず、植物サンプルの調製から始めてください。本例では、原形質連絡のサイズ排除限界が変化した変異体を解析します。まず、アッセイ用のプラットフォームを作成します。新しいMS培地プレートの上に顕微鏡用カバーガラスを配置してください。次に、3日間の徒長させた苗が乗ったMSプレートから、鋭い外科用ハサミを用いてフックの基部から苗を慎重に切り出し、カバーガラスに移します。遺伝子型ごとに少なくとも5本の苗を移してください。切り出した位置から0.5 cmの胚軸のみがカバースライド上に残り、胚軸の残りの部分が培地に接するように苗を配置します。次に、切り出した苗の上にHPTSアガロースブロックを配置し、切り出した部位がHPTSブロックに接触するようにします。確実に接触していることを確認してください。そのまま5分間、下胚軸の上にブロックを置いておきます。次に、下胚軸を2回蒸留水を入れた10 mmのシャーレに移し、15分間振とうして洗浄します。続いて、洗浄した苗をスライドガラスに移します。直接比較ができるように、各変異体を対照群の隣に配置してください。下胚軸に100から150 µLの二回蒸留水を加え、カバーガラスを被せます。次に、テキストプロトコルに記載されている通り、共焦点顕微鏡を用いてスライドを解析します。このアッセイでは、調製から2日以内であり、遮光保存された新鮮な染料を使用してください。de novo カロース合成を阻害するために、1.5 millimolar の 2-Deoxy-D-glucose を染料に加えます。傾向応答がある、またはない、3日間の暗所で育てた黄白化した苗を選択して、カロース染色のためのアッセイを開始します。細い外科用ハサミを用いて、苗のフック領域から切断します。次に、爪楊枝の先を用いて、2 mLの染色バッファーを入れた小型ペトリ皿に苗を移します。染色バッファーに入れた苗を、30 RPMで絶えず振盪しながら、暗所で2時間インキュベートします。染色後、苗を2重量分二回蒸留水で2分間洗浄し、過剰な染色バッファーを除去します。洗浄後、共焦点解析用に各バックグラウンドから少なくとも5本の苗を選択します。ImageJソフトウェアを用いてカロースの信号強度を測定します。イメージングソフトウェアで、あらかじめJPEG形式で保存しておいた共焦点顕微鏡ファイルを開きます。次に、矩形選択ツールを使用してカーソルを画像上でドラッグし、解析する領域を選択します。その後、Mキーを押して信号強度の数値を測定し、記録します。結果ファイルが別途開きます。結果ファイル内の「Mean」という用語は、選択した領域の信号強度を示しており、複数の領域の平均値ではありません。各苗について、このように一つずつ信号を解析します。残りの苗の測定についても上記の手順を繰り返し、データセットのスプレッドシートファイルを用いて、2種類の異なる背景の平均角度を測定します。上述のプロトコルを用いて、デキサメタゾン誘導性AtGSL8 RNAi系統の解析を行いました。DsGSL8幼苗は、光屈性と重力屈性に明らかな欠陥を示しました。これらの幼苗は、いずれの力の影響下においても屈曲を示しませんでした。シンプラスト輸送の変化を調べたところ、HPTSA色素の移動は、対照群よりもdsGSL8 RNAiノックダウン個体において大幅に広範囲に及ぶことが示されました。カロスは原形質連絡のサイズ排除限界を制御する主要な因子の1つであり、AtGSL8は原形質連絡におけるカロス合成酵素であることが知られています。そこで、アニリンブルーを用いたカロスの染色を行いました。コントロールでは、黄色い矢印で示されるように、6時間後にカロスが蓄積しました。しかしながら、6時間後になっても、変異体では原形質連絡のカロースレベルが持続的に低いままでした。このカロース合成の欠如は、屈光性の発生からわずか3時間後には測定可能なレベルで確認されました。このビデオを視聴することで、カロースの調節のみを通じて屈性反応による原形質連絡のゲーティングを制御する変異体の遺伝子を、どのように迅速にスクリーニングするかについて十分に理解できるはずです。この手法に習熟すれば、シロイヌナズナの苗を3日間で発芽させた後、約6時間で完了させることができます。本手順を行う際は、苗を移す際に苗を傷つけないように注意することが重要です。また、ローディングアッセイにおいて、アガロースと胚軸を適切に接触させることが重要です。この展開を経て、本手法は、屈性におけるシンプラスト伝導の制御に関与する新たな遺伝子を探索するための、発生生物学への道を切り拓きました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ここでは、原形質膜受容体キナーゼの膜輸送イベントを研究するために、一般的に使用されるいくつかの方法を紹介します。この原稿では、植物材料の調製、薬理学的処理、共焦点イメージングのセットアップなど、詳細なプロトコルについて説明しています。...

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

ここでは、 シロイヌナズナの細菌侵入に対する気孔応答の直接観察と自動測定のための簡単な方法を紹介します。この方法では、ポータブル気孔イメージングデバイスと、デバイスによってキャプチャされた葉の画像用に設計された画像解析パイプラインを活用します。...

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

このプロトコルは、ウイルス-プラスモデスマタ相互作用またはプラスモデマーム輸送中にプラスモデスマタを標的とするタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のための最適なプラスモデスママーカーの選択を説明しています。...

Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

このプロトコルは、同じサンプル内で植物イオン漏れ、ペルオキシダーゼ活性、カロース生成を評価するためのハイスループットアプローチを記述しています。...

高スループット形式を用いた微生物二次代謝物に対する葉の応答評価

学ぶカロース媒介プラスモデスマゲーティングの遺伝子スクリーニング法。Arabidopsis thaliana下胚軸を用いて、向性応答における細胞間シグナル伝達を制御する遺伝子を同定し、植物発生生物学の理解を深める実験手法です。

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

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