Name: エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学ぶエレクトロスプレーイオン化オービトラップ質量分析法による水銀（II）とジシステイニルテトラペプチドの錯体解析。タンデムMSで重なりピークを分析し、キレート剤設計に有用な知見を得る方法です。

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MN-Sは全米科学財団からの支援を承認、RUIは、著者は感謝してサーモフィッシャーサイエンティフィックLTQオービトラップXL質量分析計を使用するためにノースカロライナ大学グリーンズボロ校でトライアド質量分析施設を承認CHE 1011859.を付与します。作者はこの作品に関する有用な提案やコメントのためにノースカロライナ大学グリーンズボロ校でダニエル・トッド、ヴィンセントシーカ、およびBrandie Erhmannに感謝します。

注：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。塩化水銀は有毒化学物質です。それと関連するすべてのソリューションを渡す際に個人用保護具（手袋、安全ゴーグル、および白衣）を着用しなければなりません。重金属のために指定された明確に表示化学廃液ボトル内のソリューションを処分。 5 mMの脱気したギ酸アンモニウム緩衝液（pH7.5）の調製<ol><li> HPLCグレードの水450ミリリットルにギ酸アンモニウム緩衝液の0.1576グラムを溶解します。 1 Mギ酸および7.5から1 M水酸化アンモニウムで上記溶液のpHを調整します。 500ミリリットルのメスフラスコに、このソリューションを移し、5 mMのギ酸アンモニウム溶液を作製するために検量線にHPLC水を追加します。 </li><li>アルゴンで10分間パージするための真空システムの下で5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液を脱気。アルゴン下で二回繰り返して、ストア・ソリューション。使用の日に、血友病0.2ミクロンフィルターを通して緩衝液をフィルタE使用。 </li></ol>水銀（II）塩化物溶液の調製<ol><li> 0.2375グラムの水銀（II）塩化物を秤量。 0.035 M水銀（II）塩化物溶液を生成するために5mMのギ酸アンモニウム緩衝液25ml中に溶解します。 </li><li> 7.5×10 -4 Mのソリューションを作成するために、9.785ミリリットルの5mMのギ酸アンモニウムバッファーに0.214ミリリットル0.035 M水銀（II）塩化物溶液を追加します。アルゴンガスを7.5×10 -4 Mの水銀（II）溶液をブランケット。 </li></ol> CGGCストック溶液の調製<ol><li> HPLCグレードのアセトニトリルの0.118ミリリットルで、dicysteinylテトラペプチド、CGGC 2.0mgのを溶解した後、5 mMのギ酸アンモニウム、5mMのCGGC原液を得アルゴンで脱気されたpHが7.5の緩衝液1.0647ミリリットルを追加します。 </li><li> 7.5×10 -4 M CGGC溶液を得5mMのアンモニウム形成のpHの1,275μlの7.5バッファに5 mMのCGGC原液の225μLを加えます。 </li></ol> 4.準備水銀（II）とCGGCの種々の反応混合物<ol><li>水銀の0.5比（II）：CGGC液1の調製<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を255μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小に7.5×10 -4 M CGGC溶液を15μlを添加します。 10秒のためのソリューションをVORTEX。ソリューションは、質量分析計に注入前に10分間放置してみましょう。 </li></ol></li><li>水銀の1の比率（II）：CGGC液1の調製<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を240μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。そして、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに7.5×10 -4 M CGGC溶液を30μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li><li>水銀の2比（II）：CGGC液1の調製<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を210μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CGGC溶液を60μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li></ol> CEEC原液の5準備<ol><li>ペプチドを溶解させ、HPLCグレードのアセトニトリルの0.145ミリリットルで、dicysteinylテトラペプチド、CEECの3.5 mgの溶解。その後5mMのギ酸アンモニウム、0.5メートルを生成するためにアルゴンで脱ガスされたpHが7.5の緩衝液13.067ミリリットルを加えますM CEECソリューション。 </li><li>すべてのペプチドが溶解するまで溶液をボルテックス。 7.5×10 -5 M CEEC溶液を得、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、1.125ミリリットル0.5 mMのをpH7.5のバッファーをCEEC液および5mMのギ酸アンモニウムの0.375ミリリットルを追加します。ボルテックス混合されるまで。 </li></ol>水銀（II）とCEECソリューションの様々な反応混合物の調製6。 <ol><li> 1の調製：水銀（II）の比は0.5：CEEC溶液<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を255μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を15μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li><li>水銀（II）の1：1の比：1の調製CEECソリューション<ol><li> 240を配置81; 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液のリットル。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を30μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li><li>水銀（II）の2比：1の調製CEECソリューション<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を210μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を60μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li></ol> 7. ANALYオービトラップESI質量分析による水銀（II）とCGGCサンプルの反応混合物をシュッ<ol><li> ESI質量分析計16の準備 <ol><li> 500μlのガラスシリンジに校正標準の100μLを描画します。 </li><li> 、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置き、チューブを取り付け、質量分光光度計の中に注入します。 </li><li>ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行するためのファイル名を設定します。 </li><li>データ取得モジュールで取得するデータボタンを選択し、150スキャンを収集します。 </li><li>ソフトウェアのデータ処理モジュールを開くことによって、較正基準を検証するクロマトグラムを分析します。モジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムのピークが基準の比率を質量電荷に相関していることを確認します。 </li><li> 500μlのHPLCグレードのメタノールを描画することにより500μlのガラスシリンジをきれいにして、Mを分配ビーカーにエタノール。 </li><li>ガラスシリンジにHPLCグレードのメタノール500μlのを描画し、ステップ7.1.2のとおりにシステムをフラッシュします。 </li><li>パラメータを設定するためのソフトウェアの方法のセットアップ・モジュールを選択します。スキャンモードメニューを選択し、FTMSなどの分析器を特定し、「OK」をクリックしてください。シースガス流量：10、ソース温度：0、キャピラリー電圧：37 V、チューブレンズ：95 V、スプレー電圧：4.20 kVのその後のリアルタイムビュースペクトルページのさまざまなアイコンをクリックすることで、以下のパラメータを設定します、フローは10.00μL/ minで、アナライザを評価：FTMS、スキャン数：150。 </li></ol></li><li> ESI質量分析計でCGGCサンプルを実行します<ol><li> 5 mMのギ酸アンモニウムpH7.5のバッファーを実行します。 <ol><li> 、500μlのガラスシリンジに5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液500μlを置き、MSポンプのシリンジクレードルにそれを置き、チューブを取り付けます。 </li><li> 1-2分間チューブを介してバッファを実行します。 </li><li>ランのファイル名を設定しますファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して。 </li><li>モジュール内の取得データ]ボタンを選択し、150スキャンを収集します。 </li><li> 150スキャンを収集した後に収集を停止するには[実行]ボタンをクリックします。 </li><li>データブラウザモジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。ペプチドまたは水銀（II） - ペプチド複合体に似ていることに何の483、683、1163および1363のピークのm / zが存在しないことを確認します。 </li></ol></li><li> 0.5水銀（II）：CGGC比液1を実行します。 <ol><li> 0.5水銀（II）：注射器への試料のCGGC比1の250μLを入れます。 </li><li>チューブ、および素数装置を取り付け、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置きます。 </li><li>ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行するためのファイル名を選択します。 </li><li>データ取得モジュールで取得するデータボタンを押して、150スキャンを収集し、収集を停止するには[実行]ボタンをクリックします。 </li><li>モジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムは、単独でCGGCペプチドのための1つを含むピークが含まれていることを確認します。 </li><li> 500μlのギ酸アンモニウム緩衝液で吸引した後、ビーカーにギ酸アンモニウムバッファーを分配することによって、注射器を洗浄します。 </li><li> MSの廃棄物のボタンを選択し、チューブに500μlのギ酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄します。 </li><li> 500μlのメタノールで吸引した後、ビーカーにメタノールを分配することによって、注射器を洗浄します。 </li><li> 500μlのメタノールでチューブ1時間をフラッシュします。 </li><li> MSの負荷検出器のボタンを選択します。 </li><li>シリンジにギ酸アンモニウム緩衝液500μlを追加します。 </li><li>チューブ、および素数装置を取り付け、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置きます。 </li><li>ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行し、バッファのファイル名を選択します。 </li><li>押す取得データボタンと150スキャンを収集した後、停止実行ボタンをクリックします。 </li><li>データブラウザモジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。 CGGCラン：クロマトグラムは、前水銀からのピークの空隙であることを確認します。 </li></ol></li><li> 1水銀（II）：CGGC比液1を実行します。 <ol><li>シリンジにCGGC比サンプル：1の水銀（II）：1の250μLを入れます。 </li><li> 7.2.2.15までの流れ7.2.2.2で説明したように、同様に繰り返します。 </li></ol></li><li> 2水銀（II）：CGGC比液1を実行します。 <ol><li>シリンジにCGGC濃度サンプル：2水銀（II）：1の250μLを入れます。 </li><li> 7.2.2.15までの流れ7.2.2.2で説明したように、同様に繰り返します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 8.オービトラップESI質量分析法による水銀およびCEECサンプルの反応混合物の分析<ol><li> ESI質量分析計でCEECサンプルを実行します<ol><li>繰り返し分析手順（ステップ7.1〜7.2）CEECサンプルや様々な化学量論比での水銀（II）とCEECの反応混合物を使用。 </li></ol></li></ol>

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報告された作品については開示されていません。

疎水dicysteinylテトラペプチドCGGC（C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; = 338 MW）は、図2 及び表1に示すように（ 図1）は 、水銀（II）と複合体を形成しさらに、ペプチド二量体および三量体を形成します。増分反応混合物中のペプチドの量が増加します。 [+ = 1015（3M + H）]のm / z関連する二量体の値[（2M + H）+ = 677]とトリマーによって示されるように、CGGCのチオール基は、実験条件下でジスルフィドを形成するために酸化されませんでした。これらの関連CGGC種の形成は、このテトラペプチドの疎水性によるものである可能性があります。以前dicysteinylトリペプチド7について報告されているように2水銀（II）:(ペプチド）2</...

現在の臨床薬は、水銀中毒1のキレーション療法のために処方されたチオール基を含み、これは水銀イオン2,3の結合と隔離に関与しています。 しかし、これらの小さなチオール化合物[ジメルカプトコハク酸(DMSA)およびジメルカプトプロパン-スルホン酸(DMPS)]は、水銀キレート療法には最適ではないことが研究で示されています4-6。 したがって、水銀キレート化のためのチオール化合物の合理的な薬物設計を強化するために、水銀とチオールとの関連と複雑な形成傾向を理解する必要があります。 最近、我々は、ジチオール基を有するn-アルキルおよびアリールジシステニルトリペプチドが、水銀(II)の配位部位を収容する効果的な「ダブルアンカー」として機能し、1:1の水銀(II):pエプチドおよび1:2の水銀(II):(ペプチド)2複合体を形成することを報告した7。 さらに、システイン残基の増加が複合体型の形成に及ぼす影響を検討しました8。 本研究では、水銀(II)と2つのジシステニルテトラペプチドとの関連について、システイン残基が2つのアミノ酸残基によって分離されていることを確認した。 水銀の補助結合基の影響を評価するために、介在するアミノ酸は、2つのグリシン(非置換)残基または2つのグルタミン酸(γ-カルボキシル化)残基のいずれかです。 
システインペプチドと水銀(II)との反応には、システインイルチオール基の酸化がジスルフィド結合を形成するのを防ぐ条件が必要です9。 さらに、水銀(II)とシステインペプチドとの会合がさまざまな種類の水銀-ペプチド複合体を形成することは、反応混合物中の水銀(II):ペプチドの初期比率に依存します7,8。 これらの反応混合物で形成される水銀-ペプチド錯体の種類は、金属イオンとペプチドとの間の種相互作用を決定するための高感度分析ツールである軟イオン化質量分析法で分析できます10-14。 したがって、特定のエレクトロスプレーイオン化条件下で形成されるさまざまなタイプの水銀化ペプチド付加体のプロファイルを提供します。 ここでは、システニルペプチドと塩化水銀(II)溶液を、アルゴンで覆った脱気ギ酸アンモニウム緩衝液で調製して酸化を最小限に抑える方法を示します。 水銀(II)のさまざまなモル当量をジシステニルテトラペプチドと反応させることにより、水銀(II):pエプチドの初期比率が形成される錯体の種類にどのように影響するかを示します。 また、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析を特性評価ツールとして使用して、形成された複合体中の水銀とペプチドの正確な化学量論を提供する方法も示します。 関連するビデオプロトコルは、水銀錯体を調製するための実験条件、指定されたエレクトロスプレーイオン化条件下での反応混合物を分析する手順、およびChemCalプログラム15を使用して、明確な水銀同位体分布パターンに基づく水銀(II)-ジシステニルテトラペプチド錯体の化学量論の特性評価を示します. ESI orbitrap質量分析を使用して、異なる同位体形態で存在する金属イオンによって形成されるさまざまな錯体を分析することに関心のある方を支援することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>塩化水銀(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>毒性の高い</td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>フィッシャー</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC水</td><td>フィ</td><td>ッシャーW5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC アセトニトリルフィ</td><td>ッシャー</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLCメタノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーA452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるdicysteinylテトラペプチドと水銀（ii）の錯体の研究

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

この研究では、エレクトロスプレーイオン化Orbitrap質量分析法により、水銀(II)とジシステニルテトラペプチドの異なる相対比で形成された複合体の特性評価の方法を評価しました。 この戦略は、質量分析などの手法を利用して、トリペプチドが関与する水銀-ジシステニル錯体の特性評価にこれまでに成功したことに基づいています。 塩化水銀(II)とジシステニルテトラペプチドを、脱気緩衝培地中でさまざまな化学量論的比率でインキュベートしました。 形成された錯体は、その後、ハイブリッドリニアイオントラップ質量分析計とオービトラップ質量分析計からなるエレクトロスプレー質量分析計で分析されました。 エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)スペクトルをポジティブモードで取得し、観察されたピークを明確な水銀同位体分布パターンと関連するモノアイソトピックピークについて分析しました。 この研究は、特定のエレクトロスプレーイオン化条件下で形成された錯体中の水銀とペプチドの正確な化学量論が、明確な水銀同位体分布パターンに基づく高分解能ESI MSを使用して決定できることを示しています。

<html>研究は、ESI質量分析により2テ ​​トラペプチド、CGGC及びCEEC（ 図1）のための可能な水銀-ペプチド複合体組成物を特徴づけるために実施しました。 1：0.5、1：1、及び1：2（水銀（II）：ペプチド）CGGCまたはCEECと水銀の複合体（II）は、三つの異なるモル比での水銀の混合物（II）とペプチド溶液を反応させて調べました。水銀の濃度（II）が7.5×10 -6 Mとに応じて変化させるペプチド濃度でした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig1.jpg" /> 図1. Dicysteinylペプチド構造。dicysteinylテトラペプチドの化学構造、CGGCとCEEC。 <a href="https://www.jove.co...

エレクトロスプレーイオン化Orbitrap質量分析による、水銀(II)とジシステニルテトラペプチドの異なる相対比で形成された複合体の特性評価が提示されます。

エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

本手順の全体的な目的は、異なる反応化学量論条件下で水銀とジシステイニルペプチドの錯体を調製し、エレクトロスプレーイオン化およびオービトラップ質量分析法を用いて、形成されたさまざまな錯体を特性評価することである。この手法は、水銀とチオール化合物の錯形成傾向に関する重要な疑問の解決に寄与し、水銀イオンを捕捉するためのキレート剤の合理的な設計を促進させることができる。本技術の主な利点は、断片化をほとんど伴わずに金属イオン錯体の分析を容易にできる点にある。その他には、水銀特有の同位体分布パターンが挙げられます。タンデム質量分析を用いることで、電荷の割り当てや重複ピークの解析が容易になります。この手法は水銀ペプチド錯体に関する知見を提供しますが、他の錯体、特に異なる同位体形式で存在する金属イオンを含む錯体にも適用可能です。真空システムを用いて5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液を10分間脱気し、アルゴンでパージします。この操作を2回繰り返し、溶液をアルゴン雰囲気下で保存します。使用当日に、0.2 µmのフィルターで緩衝液をろ過して使用します。塩化水銀溶液を調製するには、0.2375 gの塩化水銀を量り取ります。これを25 mLの5 mMギ酸アンモニウム緩衝液に溶解し、0.035 Mの塩化水銀溶液を作成します。この塩化水銀溶液0.214 mLを9.785 mLの5 mMギ酸アンモニウム緩衝液に加えることで、0.75 mM溶液を作成します。得られた溶液をアルゴンガスで置換します。次に、5 mMのCGGCストック溶液225 µLを、5 mMギ酸アンモニウムpH 7.5緩衝液1.275 mLに加え、0.75 mMのCGGC溶液を作成します。続いて、1.5 mLマイクロ遠心チューブに5 mMギ酸アンモニウムpH 7.5緩衝液255 µLを入れ、水銀とCGGC溶液の比率が1:0.5となるように調製します。次に、0.75 millimolar 塩化水銀溶液を 30 microliters チューブに加えます。溶液を 10 seconds 間ボルテックスします。その後、0.75 millimolar CGGC 溶液を 15 microliters チューブに加えます。溶液をさらに10秒間ボルテックスし、質量分析計に注入する前に10分間静置します。ESI質量分析計（MS）の準備として、100 µLの校正標準液を500 µLガラスシリンジに吸引します。シリンジをMSポンプのシリンジホルダーにセットします。チューブを接続し、質量分析計に注入します。ファイルアイコンを選択し、ファイル名を入力して、分析用のファイル名を設定します。データ収集モジュールのデータ収集ボタンを選択し、150スキャンを収集します。ソフトウェアのデータ処理モジュールを開き、クロマトグラムを分析して校正標準物質を確認します。次に、ファイルメニューから「開く」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムのピークが、標準物質の質量電荷比と相関していることを確認してください。HPLCグレードのメタノールを500 µL吸引し、ビーカーに排出して、500 µLガラスシリンジを洗浄します。再びHPLCグレードのメタノールを500 µLガラスシリンジに吸引し、システムをフラッシュします。ソフトウェアのメソッドセットアップモジュールを選択し、パラメータを設定します。スキャンモードメニューを選択し、アナライザーとしてFTMSを指定してOKをクリックします。次に、リアルタイムビュー・スペクトルページの各種アイコンをクリックし、テキストプロトコルに詳細に記載されている通りにパラメータを設定します。バッファーを流すには、5 mM ギ酸アンモニウムバッファーを 500 µL ガラスシリンジに 500 µL 分注してください。MSポンプのシリンジクレードに設置し、チューブを取り外します。1〜2分間、チューブ内にバッファーを流します。ファイルアイコンを選択してファイル名を入力し、分析のファイル名を決定します。モジュールのデータ収集（acquire data）ボタンを選択し、150回のスキャンを収集します。150回のスキャンが完了したら、ラン停止（stop run）ボタンをクリックして収集を停止します。次に、データブラウザモジュールを開き、ファイルメニューから「開く（open）」を選択し、ダイアログボックスで該当するファイルを選択します。ペプチドまたは水銀イオン・ペプチド複合体に類似したピークが、質量電荷比 483、683、1163、および 1363 に存在しないことを確認します。サンプル 250 µLをシリンジに入れ、水銀とCGGCの比率が 1:0.5 の溶液を分析します。シリンジをMSポンプのシリンジホルダーにセットしてください。チューブを取り付け、装置のプライミングを行います。150回のデータスキャンを取得し、ブラウザモジュールを開いてファイルメニューから「開く」を選択します。次に、ダイアログボックスでファイルを選択してください。クロマトグラムに、CGGCペプチド単独のピークを含むピークが含まれていることを確認します。この手順において極めて重要な点は、各反応混合物の分析前に、前回のランの分析物が完全に除去されていることを確認することです。注入ラインを徹底的に洗浄することで、キャリーオーバー分析物による試料汚染を最小限に抑えることができます。500 µLのギ酸アンモニウム緩衝液を吸引し、それをビーカーに吐出することでシリンジを洗浄します。次に、MSの廃棄ボタンを選択し、500 µLのギ酸アンモニウム緩衝液でチューブを3回フラッシュします。さらに、500 µLのメタノールを吸引してビーカーに吐出し、シリンジを洗浄します。チューブを500 µLのメタノールで1回洗浄します。次に、MSのロード検出器ボタンを選択します。シリンジに500 µLのギ酸アンモニウム緩衝液を加えた後、シリンジをMSポンプのシリンジクレードに設置します。チューブを接続し、装置のプライミングを行ってください。前と同様にバッファーランのファイル名を選択し、停止ボタンをクリックする前に150回のスキャンを取得します。データブラウザモジュールを開き、クロマトグラムに前回の水銀CGGCランに由来するピークがないことを確認してください。残りのCGGCサンプルについても、同様に分析手順を繰り返します。水銀とCEEC溶液の比率を1:0.5にするため、5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液（pH 7.5）255 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。そこに0.75 mMの塩化水銀溶液30 µLを加えます。溶液を10秒間ボルテックスした後、0.75 mMのCEEC溶液15 µLをチューブに加えます。溶液をさらに10秒間ボルテックスします。その後、質量分析計に注入する前に10分間静置させます。CEECサンプル、および水銀イオンとCEECの反応混合物を用いて、分析手順を繰り返します。代表的なマススペクトルを示す。10分後、水銀とCGGCの反応比が1:0.5の反応混合物において、さまざまな種類の水銀ペプチド錯体が、ペプチドピークの339.08およびペプチドダイマーの677.15とともに観察される。前のスペクトルで観察されたように、水銀とCGGCの反応比が1:1の反応混合物にも、同様のいくつかのピークが含まれている。例えば、ピーク539.03は水銀とペプチドの1:1複合体を示しています。拡大図では、天然に存在する主要な7つの水銀同位体に対応する、特徴的な水銀同位体パターンが見て取れます。また、水銀ジシステイニルトリペプチドについて以前に報告されているのと同様に、水銀とCGGCの1:2複合体も観察されました。この錯体は、水銀とCGGCの3つの反応混合物すべてに現れます。これは、877にモノアイソトピックピークを持つ特有の水銀同位体パターンによって容易に分析されました。しかし、1:0.5の水銀対CGGC反応混合物のように水銀が過剰である場合、追加の2:2水銀対CGGC錯体が検出されます。この水銀の同位体シグネチャーは、chem calプログラムを用いて計算された2つの水銀錯体に対応しています。理論的なプロトン化モノアイソトピック質量は、観測された同位体クラスターの9番目のピークである質量オーバーチャージ値1077に対応します。さまざまな水銀-CEEC錯体を示す代表的なスペクトルを以下に示します。注目すべきは、1価の電荷において883に単一同位体ピークを示し、2価の電荷において計算上の単一同位体ピーク値が1765となる、水銀とCEEC付加体に関連する重複ピークである。この手法を習得し、適切に実施すれば、2時間以内に完了させることができる。この手順を行う際は、キャリーオーバーによる分析物の混入を避けるため、緩衝液を脱気し、ラインを十分に洗浄することを忘れないでください。本手順の後、溶液相中の錯体含有量をより正確に決定するために、プロトン、炭素-13、水銀-199の核磁気共鳴（NMR）分光法や電位差測定などの他の手法を利用することができます。このビデオを視聴することで、エレクトロスプレーイオン化を用いたOrbitrap質量分析法により、さまざまな水銀錯体とその特有の水銀同位体分布パターンおよび電荷形成を分析し、さらにタンデムMS分析によって重複するピークを区別できるようになります。水銀溶液を取り扱う際は非常に危険であるため、本手順の実施中は、個人用保護具の着用などの予防策を常に講じてください。

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