エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究

この手順の全体的な目標は、異なる反応化学量論の下で水銀ペプチドとジシステニルペプチドの錯体を調製し、エレクトロスプレーイオン化およびオリビトラップ質量分析によって形成されるさまざまな錯体を特徴づけることです。この方法は、水銀およびチオール化合物の錯化傾向に関する重要な質問に答えるのに役立ち、水銀イオンを隔離するためのキレート剤の合理的な設計を強化します。この手法の主な利点は、フラグメンテーションが無視できる金属イオン錯体の分析を容易にすることです。

その他には、明確な水銀同位体分布パターンが含まれます。タンデム質量分析による電荷の割り当てと重なり合うピークの分析が容易。この方法は水銀ペプチド錯体に関する洞察を提供しますが、他の錯体、特に異なる同位体形態で存在する金属イオンにも適用できます。

5ミリモルのギ酸アンモニウム緩衝液を真空システムで10分間脱気し、アルゴンでパージします。2回繰り返し、溶液をアルゴンの下に保存してください。使用日は、0.2ミクロンのフィルターで緩衝液をろ過してから使用してください。

塩化水銀溶液を調製するには、0.2375グラムの塩化水銀を量ります。25ミリリットルの5ミリモルギ酸アンモニウム緩衝液に溶解して、0.035モルの塩化水銀溶液を生成します。0.214ミリリットルの塩化水銀溶液を9.785ミリリットルの5ミリモルギ酸アンモニウム緩衝液に加えて、0.75ミリモル溶液を作成します。

得られた溶液をアルゴンガスで覆います。次に、225マイクロリットルの5ミリモルCGGCストック溶液を1.275ミリリットルの5ミリモルギ酸アンモニウムpH7.5緩衝液に加えて、0.75ミリモルのCGGC溶液を得ます。次に、255マイクロリットルの5ミリモルギ酸アンモニウムpH 7.5バッファーを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れて、水銀とCGGC溶液の1対0.5の比率を調製します。

次に、30マイクロリットルの0.75ミリモル塩化水銀溶液をチューブに加えます。溶液を10秒間ボルテックスします。次に、15マイクロリットルの0.75ミリモルCGGC溶液をチューブに加えます。

溶液をさらに10秒間ボルテックスし、溶液を10分間放置してから質量分析計に注入します。ESI質量分析計(MS)を調製するには、100マイクロリットルの校正標準を500マイクロリットルのガラスシリンジに引き込みます。シリンジをMSポンプのシリンジクレードルに置きます。.

チューブを取り付け、質量分析計に注入します。ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して、実行のファイル名を設定します。データ集録モジュールの集録ボタンを選択し、150回のスキャンを収集します。

クロマトグラムを解析し、ソフトウェアのデータ処理モジュールを開いてキャリブレーション標準を確認します。次に、ファイルメニューに移動し、[開く]を選択してから、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムのピークが、標準の質量電荷比と相関していることを確認します。

500マイクロリットルのHPLCグレードのメタノールを500マイクロリットル引き出し、ビーカーに分注して、500マイクロリットルのガラスシリンジを洗浄します。500マイクロリットルのHPLCグレードのメタノールをガラスシリンジに吸い込み、システムを洗い流します。ソフトウェアのメソッド設定モジュールを選択して、パラメータを設定します。

スキャンモードメニューを選択し、アナライザーFTMSを特定し、[OK]をクリックします。次に、リアルタイムビュースペクトラムページのさまざまなアイコンをクリックして、テキストプロトコルに詳述されているようにパラメータを設定します。バッファーを実行するには、500マイクロリットルの5ミリモルギ酸アンモニウムバッファーを500マイクロリットルのガラスシリンジに入れます。

MSポンプのシリンジクレードルに入れ、チューブを外します。バッファーをチューブに1〜2分間通します。ファイル アイコンを選択し、ファイル名を入力して、実行のファイル名を設定します。

モジュールの[データ集録]ボタンを選択し、150スキャンを収集します。「実行の停止」ボタンをクリックすると、150 回のスキャンが収集された後に収集が停止されます。次に、データブラウザモジュールを開き、ファイルメニューに移動して[開く]を選択し、次にダイアログボックスでファイルを選択します。

483、683、1163、1363 の質量過充電において、ペプチドまたは水銀イオンペプチド複合体に類似したピークが存在しないことを確認します。1対0.5水銀対CGGC比の溶液を、250マイクロリットルのサンプルをシリンジに入れて実行します。シリンジをMSポンプのシリンジクレードルに入れます。

チューブを取り付け、装置をプライミングします。150のデータスキャンを取得するには、ブラウザモジュールを開き、ファイルメニューに移動して、[開く]を選択します。次に、ダイアログボックスでファイルを選択します。

クロマトグラムに、CGGC ペプチドのみのピークを含むピークが含まれていることを確認します。この手順の重要な側面は、各反応混合物分析の前に、前回の分析から得られた分析物が完全に除去されていることを確認することです。キャリーオーバー分析種からのサンプル汚染は、注入ラインを徹底的に洗浄することで確実に行われます。

500マイクロリットルのギ酸アンモニウムバッファーで吸引してシリンジを洗浄し、バッファーをビーカーに分注します。.次に、MS の廃棄物ボタンを選択し、500 マイクロリットルのギ酸アンモニウムバッファーでチューブを 3 回フラッシュします。さらに、500マイクロリットルのメタノールを吸引し、ビーカーに分注することにより、シリンジを洗浄します。

チューブを500マイクロリットルのメタノールで1回洗い流します。次に、MS の負荷検出器ボタンを選択します。500マイクロリットルのギ酸アンモニウムバッファーをシリンジに追加した後、シリンジをMSポンプのシリンジクレードルに入れます。チューブを取り付け、装置をプライミングします。

前回と同様にバッファ実行のファイル名を選択し、実行の停止ボタンをクリックする前に150スキャンを取得します。データブラウザモジュールを開き、クロマトグラムに前回の水銀からCGGCへの分析のピークがないことを確認します。残りのCGGCサンプルについて、解析手順を繰り返します。

CEEC溶液に対する水銀の1対0.5の比率を調製するには、255マイクロリットルの5ミリモルギ酸アンモニウムpH7.5緩衝液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。30マイクロリットルの0.75ミリモル塩化水銀溶液をチューブに加えます。溶液を10秒間ボルテックスした後、15マイクロリットルの0.75ミリモルCEEC溶液をチューブに加えます。

溶液をさらに10秒間ボルテックスします。そして、溶液を10分間放置してから、質量分析計を注入します。CEECサンプルと水銀イオンとCEECの反応混合物を使用して、分析手順を繰り返します。

代表的な質量スペクトルが示されています。10分後、1〜0.5の水銀とCGGCの反応混合物について、ペプチドピークが339.08、ペプチドダイマーが677.15であるとともに、さまざまなタイプの水銀ペプチド複合体が見えます。前のスペクトルで観察されたように、1対1の水銀とCGGCの反応混合物には、いくつかの同様のピークが含まれています。

例えば、ピーク539.03は、水銀とペプチドの1対1の複合体を示す。拡大したビューは、7つの主要な天然水銀同位体に対応する特徴的な水銀同位体パターンを示しています。また、以前に報告された水銀ジシステニルトリペプチドについて報告されたように、1〜2個の水銀対CGGC複合体も観察されます。

この錯体は、水銀とCGGCの3つの反応混合物すべてに現れます。これは、モノアイソトピックピークが877である明確な水銀同位体パターンによって容易に分析されました。ただし、水銀が過剰である場合、1〜0.5の水銀とCGGCの反応混合物のように、さらに2〜2の水銀とCGGC複合体が検出されます。

この水銀同位体シグネチャは、化学プログラムを使用して計算された2つの水銀錯体に対応します。理論上のプロトン化モノアイソトピック質量は、観測された同位体クラスターの9番目のピークである1077の質量過充電値に対応します。CEEC錯体に対する種々の水銀を示す代表的なスペクトルが示されている。

興味深いのは、プラス1電荷のCEEC付加物への水銀に関連する重なり合うピークが、883でモノアイソトピックピークを示していることです。そして、プラス2電荷では、計算されたモノアイソトピックピーク値は1765です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2時間未満で完了できます。

この手順を試行する際は、分析種のキャリーオーバーを避けるために、バッファーのガスを抜き、ラインを徹底的にすすぐことを忘れないでください。この手順に続いて、陽子、炭素13、水銀-199核磁気共鳴分光法、またはポテンショメトリーなどの他の方法を利用して、溶液相の含有量複合体をより正確に測定できます。このビデオをご覧いただければ、エレクトロスプレーイオン化を伴う Orbitrap 質量分析を使用して、さまざまな水銀錯体とその異なる水銀同位体分布パターンおよび電荷形成を分析できるようになり、タンデム MS 分析により重なり合うピークを区別できるようになります。

水銀溶液の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。