Name: 網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ網膜リボンシナプスにおける膜タンパク質の高分解能定量的イムノゴールド分析法。フリーズサブスティテューションと超薄切片法を用いて、グルタミン酸受容体などのシナプスタンパク質の局在と密度を正確に解析できます。

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この作品は、国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害に関する神経疾患・脳卒中研究所（NINDS）と国立研究所（NIDCD）、（NIH）の学内プログラムによってサポートされていました。私たちは、NINDS EM施設と支援のためのNIDCD高度なイメージングコア（コード＃ZIC DC 000081から03）をお願いいたします。

お手入れと動物の取り扱いは、NIH動物実験委員会のガイドラインに従いました。 12時間の明：暗サイクル上丘を介して、左右1から1.2パーセントCTBを注射生後日（P）15-21 Sprague-Dawleyラットは、12で維持しました。 1.網膜組織固定<ol><li>解剖顕微鏡、非常に微細な先端、はさみ、セルロース濾紙、プラスチックピペットと顕微鏡スライドと2鉗子：以下の材料と道具を組み立てます。 </li><li> 2.0ミリリットルハロタン（吸入麻酔薬）との密室でラットを麻酔。つま先のピンチの後に後足の撤退の欠如、または瞬目反射の欠如：これらの方法で十分な麻酔を決定します。そして、ギロチンですぐに首を切ります。 pH7.4の0.1Mリン酸緩衝液（PB）に4％パラホルムアルデヒドを含有するガラス皿の中アイリスハサミと場所で目を削除します。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、コーンを除去眼球の前部を切断することにより、EA。鉗子で内網膜面からレンズと硝子体を除去します。 </li><li>網膜は、眼杯から特定されるまで2鉗子で強膜を剥離。 </li><li>カミソリで厚さ200μmのストリップ、およびpHシフト固定の対象に - 100にすぐに網膜をカット。 </li><li>室温で20分 - 10のためのpH 10.5で30分間、その後、4％パラホルムアルデヒドを加えた0.01％のグルタルアルデヒド - 20のためのpH6.0の0.1 M PB中4％パラホルムアルデヒドで網膜ストリップを修正しました。 </li><li> （4℃でpH7.4）に0.15 mMのCaCl 2をPBで数回洗浄した後、0.1で（30％でO / N、次に、10％、20％、30％、各60分）Mグリセロール網膜ストリップcryoprotect PB置換を凍結する前に。 </li></ol> 2.凍結置換注：この凍結置換法は、以前公開されたプロトコル19,20から変更されています。また、機器が（手袋を着用）非常に冷たいことが重要です。 O楽器で触れたときtherwise、組織が部分的に解凍することがあります。これらの工程の全ては、AFSチャンバー内で行われ、器具は、チャンバの縁の上に移動することができることはありません。同様に、AFSで使用されるすべての化学物質の適切な冷却が必要です。 <ol><li> EMの凍結保存器（CPC）で-184℃の液体プロパンにおける網膜ストリップをプランジ凍結。細かいブラシを使用して、（ブラシを使用して、余分なバッファをオフに吸い上げる）急落棒の端に行く金属スタブに取り付けられた両面テープの小片にサンプルを置きます。 </li><li>液体プロパンにロッドを急落し、約5秒間そこに保持し、その後、液体窒素で満たされている小型の搬送室を使用した自動凍結置換楽器（AFS）に転送（ &#39;LN 2は、クライオ移送容器を冷却しました&#39;）。 </li><li> AFSに凍結サンプルおよび器具（鉗子やメス）を配置した後、それ自体のためにチャンバ内の機器を冷却しますveral組織に触れる前に、分、または（液体窒素を充填（） &#39;LN 2は、クライオ移送容器を冷却&#39;）小搬送チャンバ内に数秒間器具の先端を配置することによって、それらを冷却します。 </li><li> AFSでたら、細かいメスを使用して、スタブからのサンプルとテープを取り外します。また、窒素ガス流量制御を維持し、TFこれらの手順の間オープン（TFは「LN 2蒸発器のためのレギュレータ制御」と記載されています）。 </li><li> （AFSを設定する前に、 すなわち ）フラット埋め込 ​​みホルダーに凍結組織を配置する前に、透明なプラスチックシートから薄い円をカットし、各ウェルの底部を裏打ちするようにホルダーの底部に配置します。これが終わっ重合試料ブロックの比較的容易に除去することができます。 注：以前、私たちはフラット埋め込み所有者に別の方法を使用し、二重ライヘルト+ゼラチンカプセルを採用（ペトラリーアとWenthold、1999を参照してください）​​。&lt;SUP&gt; 20。 </li><li> = 4°C /時間（11.3時間）、T2によって32時間、S1は=上昇温度のためにT1 = -90°C〜-45°Cで50時間、S2のために：AFS（楽器の用語を使用して）で、次の自動シーケンスを使用します。 =、5°C /時間（9時間）で40時間（合計= 142.3時間）のためのT3 = 0°Cの温度を上昇させます。前時限シーケンスを開始する（-90℃で）AFS内のサンプルを配置するために4時間 - それは2を取ることができます。 </li><li> AFSで&gt; 32時間、-90℃でメタノール中1.5％酢酸ウラニルで凍結切片を浸し。フラット埋め込みアルミホルダー（AFSに3フィット）で7ウェルのそれぞれに組織の2個（一般的に）を配置します。 <ol><li>ウェル中の酢酸ウラニル/メタノールへの組織+テープを置き、テープから組織を除去することが非常に困難である場合、直前に浸潤（例えばLowicryl HM20など）先頭包埋媒体に、後でテープを取り外します。 </li></ol></li><li>次いで、時間当たり-45℃（+ 4℃の温度を段階的に増加させます;自動シーケンスで）。 </li><li>各フラット埋め込むホルダーから古い溶液を除去するために先の細いプラスチックピペットを使用して、その後、予備冷却新鮮なメタノールを追加するために、別の標準的なプラスチックピペットを使用することにより、予冷メタノール中のサンプルを3回洗浄します。 </li><li> 1および2：次に、同じ方法を使用して、例えば1で培地（HM20は/メタノールを埋め込むように、低温埋め込み樹脂と徐々にサンプルを浸透2時間、純粋な樹脂に続く2時間、1、それぞれ、その後樹脂を変更しますそして、）O / Nを保ちます。 </li><li>ただ、ウェルの上端に到達するために、樹脂のレベルを調整し、翌日再び樹脂を変更します。 </li><li>サンプルを重合（-45°C自動シーケンスで0℃まで、時間当たり+ 5℃）40時間、UV光で。 </li><li>その後、AFSからのサンプルを削除します。一般的に、サンプルブロックは、まだ色でいくつかのピンク色を示しています。 RT Oでの化学ヒュームフード内の蛍光灯に近いサンプルを、置き/ N以上彼らまでアプリ耳完全にクリア。 </li></ol> 3.包埋後のEMイムノゴールド免疫細胞化学 注：23,24,25 に記載のように包埋後の免疫細胞化学を行います。 <ol><li> 1％トルイジンブルーで1μmのウルトラミクロトームを持つセクション、染色切片を切断し、断面の向きのためにそれらを検討します。切片の最適な横断面を達成するために組織ブロックを向けます。 </li><li>ウルトラミクロトームで厚さ70nmの超薄切片をカットし、ホルムバール炭素でコーティングされたニッケルスロットグリッド上にそれらを収集。 </li><li>ウォッシュは、トリス緩衝食塩水3回（TBS、0.05 Mトリス緩衝液、0.7％のNaCl、pHは7.6）洗浄した蒸留H 2 Oで1時間をグリッド。 </li><li> 30分間、TBS中の5％BSAの20μlの滴でグリッドをインキュベートし、次いでヤギ抗CTB（1：3000）を含む混合物の20μlの滴内の1つのNMDARサブユニット（抗ウサギGluN2A 1時50分にし、抗体を、GluN2B 1：30）、または抗ウサギGluA2 / 3（1：30）2％BSAおよび0.02 MのNaN 3 O / NをRTで有するTBS-トリトン（TBST、0.01％トリトンX-100、pHが7.6）です。 </li><li> 5分間TBS（pHは8.2）、続いて10、10、および20分、のためのTBS（pHは7.6）の3つの別々の滴（20μlの）上のウォッシュグリッド。 </li><li> TBSTで18 nmの金粒子に結合された10 nmの金粒子とロバ抗ヤギIgG（1:20）に結合されたロバ抗ウサギIgG（1:20）を含有する混合物の液滴に2時間（20μL）のためのグリッドをインキュベート2％BSAおよび0.02 MのNaN 3で（pHは8.2）。 </li><li>超純水で、その後、5、5、および10分間、TBSの20μlの滴液（pH 7.6）でグリッドを洗浄し、それらを乾燥させます。 </li><li>対比は、それぞれ、暗条件下で8 5分間蒸留水で5％の酢酸ウラニルおよび0.3％クエン酸鉛で2 Oをグリッド。 </li><li>三重標識実験のために、グリッドをインキュベートO /抗ヤギCTBの混合物の20μlの滴（1：3,000）で、室温でN、抗マウスPSD-95（1：100）および抗ウサギGluN2A（1 ：50）。その後、2に2時間のグリッドをインキュベート2％BSAおよび0.02 MのNaN 3との TBSTで18、10、5 nmの金粒子に結合したIgGの混合液（pH 8.2）の0μlの低下。抗体インキュベーションの間および後の洗浄と対比のための二重標識と同じ手順を保管してください。 </li><li>コントロールは、二次抗体は、単独で適用された中で行いました。 </li><li>ビューグリッドEM上や画像をデジタル化。それが24必要な場合のみ、明るさとコントラストのためのAdobe Photoshopの6.0での最終的な数字を処理します。 </li></ol> 4.定量<ol><li>手動でランダムに25,000Xの倍率でIPLの全深さをフォトモンタージュ、8,000X倍率に穴や亀裂なし内網状層（IPL）の領域を選択します。 </li><li>彼らはa）は逆行性輸送CTB信号（大きな金粒子）を含有し、b）の展示、明確に定義された膜は、裂け目、およびシナプス後密度は、c）は、少なくとも二つの小さな金の一部が含まれている場合錐体双極ダイアドでRGCの樹状突起を特定PSD内icles、またはシナプス形質膜に沿って複数の小さな金粒子。 </li><li>定量分析のために、上記の基準に基づいて、55 RGCの樹状突起、 - 45を収集します。 </li><li> PSDおよびNIH ImageJソフトウェアを有する個々のRGCの樹状突起のシナプス形質膜の長さを測定します。形質膜26のための9ナノメートル- 7の平均厚さに基づいて、膜関連のような膜を10nm内の金の粒子をカウントします。 </li><li>リニアマイクロメートル当たりの金粒子の数（金/μm）と粒子密度を計算します。各金粒子の中心とPSDの真ん中（シナプス場所の場合）または（シナプス外の場所のための）PSDのエッジ間の距離を測定します。 </li><li>ソフトウェアにより統計分析を実行します。手段を比較するために両側t検定を使用してください。意義P &lt;0.05を締結。特に断りのない限り、報告値は、として±SEM 18を意味します 。 </li></ol>

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<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

著者は開示していません。

1）短いと弱い固定、2）、3）ポスト埋め込み免疫染色、および4）定量化置換をフリーズ：私たちは、埋め込み後イムノゴールドEM成功定量するための4つの技術を記載しています。 EMの免疫は、超薄組織切片中の特定のタンパク質の検出を可能にします。金粒子で標識された抗体は、直接EMを使用して可視化することができます。膜受容体のシナプス下局在を検出する際の強力な一方で、EMの免疫は、技術的に困難であること、および組織固定および処理方法の厳密な最適化を必要とすることができます。 膜の完全性及び抗原性の間の最適なバランスを取るために、我々は別の固定方法と時間をテストしました。例えば、中枢シナプス19,20で包埋後のEM NMDARに使用される成功したプロトコルは、網膜にNMDARの免疫反応性を検出することができませんでした。この研究は、に穏やかな固定と短いインキュベーション時間を採用しました強い、長期の固定16後NMDA受容体の抗原性の還元を避けます。 <p class="jove_c...

グルタミン酸は網膜1における主要な興奮性神経伝達物質です。双極細胞2からのグルタミン酸作動性シナプス入力を受けた網膜神経節細胞（RGCを）は、脳に視覚情報を送信する網膜の出力ニューロンです。生理学的研究は、RGCのシナプスの励起がNMDA受容体（NMDARを）およびAMPA受容体（AMPA受容体）3,4,5によってシナプス後部媒介されることを示しました。網膜神経節細胞における興奮性シナプス後電流（EPSCs）はAMPA受容体とNMDARを3,5,6,7,8によって媒介されるが、RGCを上の自発的なミニチュアEPSCs（mEPSCs）が唯一のAMPA受容体媒介成分4,5,9を示します 。しかし、グルタミン酸の取り込みを低減することがRGCの樹状突起上のNMDARをが興奮性シナプスの外側に位置することができることを示唆し、自発EPSCs 5 NMDAR成分を明らかにしました。膜関連グアニル酸キナーゼなどPSD-95など（MAGUKs）はグルタミン酸受容体およびイオンチャネルを含むクラスタの神経伝達物質受容体、シナプス部位でのsが、また明確なシナプス下発現パターン10,11,12,13,14を示します 。 最近の数十年にわたって、共焦点免疫組織化学およびプレ埋め込み電子顕微鏡（EM）免疫組織化学は、膜受容体の発現を研究するために使用されてきました。共焦点免疫染色は、受容体の発現の幅広いパターンを明らかにしているが、その低解像度は、それが不可能な細胞内位置を区別するために使用することができます。哺乳動物の網膜の前埋め込 ​​むEM研究は、NMDARサブユニットはコーン双極細胞のリボンシナプス15,16,17でのシナプス後要素に存在していることを示しています。これは、生理学的証拠には明らかとは対照的です。しかしながら、反応生成物の拡散は、プレ埋め込み免疫法における周知のアーチファクトです。したがって、このアプローチは、通常、統計的に信頼性の高いデータが得られていないとシナプス外膜18,19,20,21対シナプス膜への局在化との間の区別を除外することができます。に一方、生理学的および解剖学的データは、RGCを3,5,7,9,22上のAMPA受容体のシナプス局在と一致しています。したがって、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体とMAGUKsは、シナプス後にもperisynapticまたはシナプス外膜区画にだけでなく、ローカライズされています。しかし、網膜リボンシナプスにおけるこれらの膜タンパク質の高分解能定量分析が依然として必要とされています。 ここでは、NMDARサブユニットのシナプス下局在を調べるために、包埋後のEMの免疫技術を開発し、ラットのRGCにシナプスでのこれらのタンパク質の数、密度および変動性を推定することによって、続いAMPARサブユニットとPSD-95は、コレラ毒素サブユニットB（CTB）を用いて標識逆行性トレーシング方法。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Σ</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>σ</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>σ</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Σ</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Σ</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>ミリポア</td><td>AB1555P</td><td>希釈 1/50</td></tr><tr><td>抗GluN2B</td><td>ミリポア</td><td>AB1557P</td><td>希釈 1/30</td></tr><tr><td>抗GluA2/3</td><td>ミリポア</td><td>AB1506</td><td>希釈 1/30</td></tr><tr><td>アンチ PSD-95</td><td>ミリポア</td><td>MA1&ndash;046</td><td>希釈 1/100</td></tr><tr><td>ロバ反ウサギ IgG-10 nm 金粒子</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>希釈 1/20</td></tr><tr><td>ロバ反マウス IgG-10 nm 金粒子</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>希釈 1/20</td></tr><tr><td>ロバ反マウス IgG-5 nm 金粒子</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>希釈 1/20</td></tr><tr><td>ロバ反ヤギ IgG-18 nm 金粒子</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>705-215-147</td><td>希釈1/20</td></tr><tr><td>Formvar-カーボンコーティングされたニッケルスロットグリッド。</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ EM AFS</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ EM CPC</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>日本電子 1200 EM</td><td>日本電子液体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>窒素&nbsp;</td><td>ロバーツ酸素</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロパン</td><td>ロバーツ酸素</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>リスト生物研究所</td><td>104</td><td>1 - 1.2%</td></tr><tr><td>抗CTB</td><td>リスト生物研究所</td><td>703</td><td>希釈1/4,000</td></tr></tbody></table>

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

網膜神経節細胞(RGC)は、双極細胞から興奮性グルタミン酸作動性入力を受け取ります。RGCのシナプス興奮は、NMDA受容体(NMDAR)およびAMPA受容体(AMPAR)によってシナプス後に媒介されます。生理学的データは、RGCのグルタミン酸受容体がシナプス後だけでなく、シナプス周囲またはシナプス外膜コンパートメントでも発現することを示しています。しかし、RGCシナプスにおけるグルタミン酸受容体の正確な解剖学的位置は決定されていません。中央シナプスにおけるグルタミン酸受容体の高分解能定量分析は広く採用されていますが、このアプローチは網膜での成功は限られています。私たちは、膜受容体の分析のためのポストエンベッドイムノゴールド法を開発し、網膜リボンシナプスにおけるこれらの受容体の数、密度、および変動性を推定することを可能にしました。ここでは、1)網膜固定の調製の成功、2)凍結置換、3)埋め込み後の免疫金電子顕微鏡(EM)免疫細胞化学、および4)リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体の定量的可視化に必要なツール、試薬、および実践的な手順について説明します。

以前に24,25説明したように、ここで示された結果は、ラットの網膜におけるRGCの樹状突起上GluA 2/3とNMDARをの著しく異なるシナプス下局在パターンを示しています。 RGC樹状プロファイルでGluA 2/3免疫粒子の77％は、最も中心的なシナプスと同様に、PSD（ 図1A）内に位置していました。しかし、NMDARをは、いずれのシナプスまたはextrasynaptically位置していました。 GluN2Aの免疫金粒子の83％は、PSDに局在した（ 図1C、図2A、図2B）、優先OFFシナプス、及び金粒子でのPSD（ 図2C）の中心に、より濃縮しました。対照的に、GluN2B用粒子標識（96％）の大部分は、端から180 nmのピークの粒子密度と、主にシナプス形質膜に沿って分布PSD（ 図1B、2A、2B）の外側に配置されましたPSD（ 図2B）。特に、GluN2BはONのシナ...

ポストエンベッドイムノゴールド法は、特定の分子の細胞内局在を高解像度で分析するための最も効果的な方法の一つです。ここでは、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体を定量的に解析するためのプロトコールについて述べます。

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

本実験の全体的な目的は、網膜のリボンシナプスにおける膜タンパク質を定量的に解析するための新しいアプローチを開発することです。この手法は、回路内シナプスにおけるタンパク質の正確な位置など、網膜神経生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、網膜リボンシナプスにおける複数のタンパク質の数、密度、および速度を推定できることです。NIDCD Advanced Imaging CoreのRon Petralia博士とYa-Xian Wang博士により、フリーズサブスティテューション（凍結置換法）および超薄切片作製の手順を実演します。まず、顕微鏡下で眼球を解剖します。そのために、最初に角膜を除去してください。次に、ピンセットを用いて網膜間表面から水晶体と硝子体を除去します。その後、網膜が眼杯から分離されるまで強膜を剥離します。直ちにカミソリを用いて、網膜を100 200 µm厚のストリップ状に切断します。続いて、網膜ストリップを0.1 M PB中の4%パラホルムアルデヒドで混合します。次に、室温で4%パラホルムアルデヒドと0.01%グルタルアルデヒドの混合液で処理します。0.15 mM 塩化カルシウムを含むPBで数回洗浄した後、凍結置換に先立ち、0.1 M PB中のグリセロールで網膜ストリップを凍結保護します。凍結組織をフラット埋め込みホルダーに配置する前に、透明なプラスチックシートから薄い円形を切り出し、各ホルダーの底に配置します。これにより、完了後に重合した試料ボックスをより容易に取り出すことができます。次に、AFSの自動シーケンスを設定します。AFSに液体窒素を満たし、フラット埋め込みホルダーをAFS内に配置します。ホルダーにメタノール調製1.5%ウランアセテートを満たし、予冷します。184 °Cの液体プロパン中で網膜ストリップをプランジ凍結させるには、細筆を用いてサンプルをプランジングロッド先端のメタルスタブに貼られた小さな両面テープの上に配置します。その後、筆を使って余分なバッファーを吸い取ります。ロッドを液体プロパンの中に約5秒間プランジさせます。次に、液体窒素を満たした小型輸送チャンバーを用いて、それらをAFSに移動させます。凍結サンプルと器具（ピンセットおよびメス）をAFS内に配置した後、組織に触れる前に、チャンバー内で器具を数分間冷却します。または、器具の先端を液体窒素を満たした小型輸送チャンバーに数秒間浸して冷却します。その後、精密スカルペルを用いて、スタブから試料とテープを取り除きます。次に、メタノール溶液の1.5%尿酸酢酸を含むフラット埋め込み用アルミニウムホルダーの7つのウェルのそれぞれに、凍結切片を2枚ずつ配置します。これらをAFS内で90 °Cに、少なくとも32時間保持します。次に、自動シーケンスを用いて温度を45 °Cまで段階的に上げます。その後、サンプルをあらかじめ冷却したメタノールで3回洗浄します。続いて、包埋剤として低温包埋樹脂を用いてサンプルを段階的に浸透させます。翌日、再びレジンを交換し、レジンの液面がウェルの上端に達するように調整します。AFSのUVライトを設置し、自動シーケンスが終了するまで、AFS内でUVライトを用いてサンプルを重合させます。その後、サンプルをAFSから取り出します。通常、サンプルブロックにはまだわずかにピンク色や色みが残っています。化学フュームフード内の室温で、サンプルが完全に透明になるまで、または一晩、蛍光灯の近くに置いてください。このステップで、ウルトラミクロトームを用いて厚さ 70 nonometer の超薄切片を 70 枚作成し、formvar カーボンコートニッケルグリッド上に回収します。グリッドを蒸留水で1回洗浄し、続いてTBSで3回洗浄します。次に、TBSで調製した5%BSA溶液20 µL中でグリッドを30分間インキュベートし、その後、ヤギ抗CTB抗体とNMDARサブユニットの一つの抗体を含む混合液20 µL中で、室温で一晩インキュベートします。その後、pH 7.6のTBS 20 µLを用いて、グリッドを3回洗浄します。続いて、pH 8.2のTBSでグリッドを5分間、1回洗浄します。10 nm金粒子標識ドンキー抗ウサギ IgGおよび18 nm金粒子標識ドンキー抗ヤギ IgGを含む混合液20 µLを用いて、グリッドを2時間インキュベートします。2時間後、pH 7.6のTBS 20 µLでグリッドを3回洗浄し、続いて超純水で洗浄した後、グリッドを風乾させます。続いて、蒸留水で調製した5%酢酸ウラニルでグリッドを8分間対比染色し、次いで、蒸留水で調製した0.3%クエン酸鉛で暗所にて5分間染色します。3重標識実験の場合、抗ヤギCTB、抗マウスPSD-95、および抗ウサギUN2Aの混合液20 µLを用いて、グリッドを室温で一晩インキュベートします。その後、18 nm、10 nm、および5 nmの金粒子を結合させたIgGの混合液20 µLを用いて、グリッドを2時間インキュベートします。このセクションでは、まずスケールバーを設定します。次に、ImageJソフトウェアを使用して、個々のRGC樹状突起のPSDの長さを測定します。その後、細胞膜の平均厚さを7～9 nmとして、膜から10 nm以内に存在する金粒子をカウントします。1線形マイクロメートルあたりの金粒子の数として粒子密度を算出します。次に、各金粒子の中心から、シナプス部位の場合はPSDの中央まで、またはシナプス外部位の場合はPSDの端までの距離を測定します。この画像は、GluA2/3とCTBのダブル免疫金標識を示しています。これはシナプス前膜のリボンであり、小さな金粒子は RGC 突起の PSD に集積しています。この画像は、GluN2B と CTB の二重免疫金標識を示しています。小さな金粒子はシナプス外の細胞質膜上に位置しています。この画像は、GluN2AおよびCTBの二重免疫金標識を示しています。GluA2/3と同様に、小さな粒子がPSD内に集積しています。ここでは、GluN2A、PSD-95、およびCTBの三重免疫金標識を示します。GluN2A金粒子とPSD-95金粒子は、個々のCTB陽性RGC樹状突起上のPSD内で共局在しています。この手順を行う際は、組織を非常に緩やかに固定することが重要です。なぜなら、NMDA受容体などの一部のタンパク質の抗原性は、強力で長時間の固定によって著しく低下するためです。このビデオを視聴することで、網膜のリボンシナプスにおいて膜タンパク質を高精度に検出および解析する方法について、十分な理解が得られるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、我々は内部全反射蛍光（全反射）顕微鏡を使用して金魚網膜双極細胞における単一シナプス小胞のエキソサイトーシスと人身売買にラベルを付けたり、視覚化する方法を示しています。...

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。...

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

出典:Schönherr, S., et.al. は、マウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力特異的配置を調べるために、光遺伝学的免疫標識と凍結骨折レプリカ免疫標識を組み合わせました。J. Vis.

マウス脳組織の凍結破砕標本における神経膜タンパク質の免疫標識

出典:Zhang, J., et al.網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的免疫金分析。J. Vis.

網膜シナプスにおける神経伝達物質受容体の高解像度イメージング

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

この記事は、神経伝達物質受容体の発現を定量化する方法と、光遺伝学的ツールのウイルス形質導入と凍結骨折レプリカ免疫標識技術の組み合わせを使用して、シナプス前およびシナプス後要素が特定されたシナプスでのパターンを分析する方法を示しています。...

複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。...

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

このプロトコルでは、網膜のシナプス回路とタンパク質の局在の探索に焦点を当てて、免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みの詳細な手順を概説しています。...

免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みによる網膜回路と分子局在の研究

このプロトコールは、透過型電子顕微鏡用のレチナールオルガノイドサンプルの最適化された精巧な調製手順を提供します。成熟した網膜オルガノイドのシナプス分析を含むアプリケーションに適しています。...

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

学ぶ網膜リボンシナプスにおける膜タンパク質の高分解能定量的イムノゴールド分析法。フリーズサブスティテューションと超薄切片法を用いて、グルタミン酸受容体などのシナプスタンパク質の局在と密度を正確に解析できます。

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

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