網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

この実験の全体的な目標は、網膜リボンシナプスの膜タンパク質を定量的に分析するための新しいアプローチを開発することです。この方法は、回路内のシナプスにおけるタンパク質の正確な位置など、網膜神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、網膜リボンシナプスにおける複数のタンパク質の数、密度、および速度を推定できることです。

凍結置換の手順と超薄型切片化のデモンストレーションとして、NIDCD Advanced Imaging CoreのRon Petralia氏とYa-Xian Wang氏に博士をお招きします。この手順を開始するには、顕微鏡下で眼球を解剖します。これを行うには、まず角膜を取り外します。

次に、鉗子子で網膜間表面から水晶体と硝子体を取り除きます。その後、網膜がアイカップから分離されるまで強膜をはがします。網膜をすぐにかみそりで100 200マイクロメートルの厚さのストリップに切ります。

続いて、網膜ストリップを 0.1 モル PB の 4% パラホルムアルデヒドに混合します。次に、室温で4%パラホルムアルデヒドと0.01%グルタルアルデヒドを添加します。0.15ミリモルの塩化カルシウムを使用してPBで数回洗浄した後、凍結置換の前に、0.1モルPBのグリセロールで網膜ストリップを凍結保護します。.凍結した組織を平らな包埋ホルダーに入れる前に、透明なプラスチックシートから細い円を切り取り、各ホルダーの底に置きます。

次に、AFS で自動シーケンスを設定します。AFSに液体窒素を充填し、フラットエンベディングホルダーをAFSに置きます。それらをメタノール中の1.5%酢酸ウラニルで満たし、それらを予冷します。

レチナールストリップを液体プロパンで摂氏184度で急降下凍結するには、細いブラシを使用して、プランジロッドの端にある金属スタブに取り付けられた両面テープの小片にサンプルを置きます。その後、ブラシを使用して余分なバッファーを芯で取り除きます。ロッドを液体プロパンに約5秒間突っ込みます。

次に、液体窒素で満たされた小さな輸送チャンバーを使用して、それらをAFSに移します。凍結したサンプルと器具、鉗子とメスをAFSに入れた後、チャンバー内の器具を数分間冷却してから組織に触れます。または、液体窒素で満たされた小さな輸送チャンバーに器具の先端を数秒間入れて冷却します。

その後、細いメスを使用してサンプルとテープをスタブから取り出します。次に、メタノール中の1.5%酢酸ウラニルを含むフラットエンベデッドアルミニウムホルダーの7つのウェルのそれぞれに2つの凍結切片を配置します。AFSで少なくとも32時間、摂氏90度に保ちます。

次に、自動シーケンスで温度を摂氏45度まで段階的に上げます。その後、予冷したメタノールでサンプルを3回洗浄します。次に、包埋媒体として低温包埋樹脂を試料に徐々に浸透させます。

翌日、再度樹脂を交換し、ウェルの上端まで樹脂のレベルを調整します。AFSにUVライトをセットし、自動シーケンスが終了するまでAFSでサンプルをUVライトと重合します。次に、サンプルを AFS から取り出します。

通常、サンプル ブロックにはまだピンク色と色が見られます。サンプルを室温で一晩、または完全に透明になるまで、化学ドラフト内の蛍光灯の近くに置きます。このステップでは、厚さ70個のノノメーターの超薄切片をウルトラミクロトームで切断し、カーボンコーティングされたニッケルグリッドに集めます。

グリッドを蒸留水で1回洗い、続いてTBSを3回洗います。次に、TBS中の5%BSAの20マイクロリットルで30分間グリッドをインキュベートし、次にヤギ抗CTBと1つのNMDARサブユニットに対する抗体を含む混合物の20マイクロリットルで室温で一晩インキュベートします。その後、グリッドを20マイクロリットルのTBSで毎回ph7.6で3回洗浄します。

その後、グリッドをTBSでph 8.2で5分間一度洗浄します。10ナノメートルの金粒子に結合したロバ抗ウサギIGGと、18ナノメートルの金粒子に結合したロバ抗ヤギIGGを含む混合物20マイクロリットルでグリッドを2時間インキュベートします。2時間後、20マイクロリットルのTBSでph 7.6でグリッドを3回洗浄し、続いて超純水で洗浄し、グリッドを風乾します。

その後、蒸留水に5%酢酸ウラニルでグリッドを8分間対比染色し、続いて蒸留水に0.3%クエン酸鉛を暗所で5分間対比します。トリプルラベリング実験では、抗ヤギCTB、抗マウスPSD-95、および抗ウサギUN2Aの混合物20μLでグリッドを室温で一晩インキュベートします。次に、18、10、および5ナノメートルの金粒子に結合した20マイクロリットルのIGG混合物でグリッドを2時間インキュベートします。

このセクションでは、最初にスケールバーを設定します。次に、ImageJソフトウェアを使用して、個々のRGC樹状突起のPSDの長さを測定します。次に、原形質膜の平均厚さ7〜9ナノメートルに基づいて、膜から10ナノメートル以内の金粒子を数えます。

粒子密度を線形マイクロメートルあたりの金粒子の数として計算します。次に、各金粒子の中心とPSDの中央との間の距離をシナプス位置として測定し、PSDの端との距離をシナプス外位置として測定します。この画像は、GluA2/3とCTBの二重免疫金標識を示しています。

これがシナプス前リボンであり、小さな金粒子はRGCプロセスのPSDに集まっています。この画像は、GluN2BとCTBの二重免疫金標識を示しています。小さな金の粒子は、シナプス外原形質膜上にあります。

そして、この画像は、GluN2AとCTBの二重免疫金標識を示しています。GluA2/3と同様に、小さな粒子はPSD内に集まっています。ここには、GluN2A、PSD-95、およびCTBのトリプルイムノゴールド標識が示されています。

GluN2A金粒子とPSD-95金粒子は、個々のCTB陽性RGC樹状突起上のPSD内に共局在しています。この手順を試みるときは、NMDA受容体などの一部のタンパク質抗原性が強く長時間固定すると著しく減少するため、組織を非常に穏やかに固定することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、網膜リボンシナプスで膜タンパク質を高い精度で検出および分析する方法を十分に理解できるはずです。