メダカの卵を使用したシルバーナノコロイドの塩分依存毒性アッセイ

この実験の全体的な目標は、水生生物に対する化学物質の塩分依存性毒性をテストすることです。この方法は、淡水、汽水、海水の状態に対する毒性の評価など、生態毒性学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、メダカがさまざまな塩分濃度の化学物質の毒性をテストするように求められていないことです。

さらに、この技術の意味合いは、他の治療法や化学物質の毒性の診断にも及びます。溶液中での商業銀ナノコロイドの調製は、さまざまな塩分濃度で、テキストプロトコルでカバーされています。メダカの養殖や卵採集もそうです。

まず、ステージ21のメダカ卵の6つのコレクションを試験液で3回すすぎます。これは、ERMを使用して、卵のセットごとに異なる濃度で行います。次に、すすぎた各コレクションから、15個の卵を6ウェルのプラスチックプレートに入れた別のウェルの試験溶液に移します。

この実験を3回に分けて設定し、すべてのグループを別々に洗います。プレートをホイルで包み、暗闇の中で摂氏25度でインキュベートします。卵が孵化するまで、または14日間のいずれか早い方。

孵卵中は、生物学的な変化がないか毎日卵を観察してください。そして、死んだ卵のために。テスト解を毎日変更し、観察結果も作成してください。

観察の6日目に、各胚の心拍数を15秒以上数えます。また、6日目には、各実験条件で各胚の目の直径をマイクロメーターで測定します。胚が幼虫に孵化するたびに、マイクロメーターを使用して全身の長さを測定します。

また、14日間にわたって、孵化する卵の総数を数えてください。銀の生物蓄積を測定するには、6日目に、標準的な方法を使用して卵の絨毛を採取します。脱角化卵は、次のセクションで説明するように、SNC溶液を分析するのと同じように分析できます。

各SNC溶液から可溶性銀を単離するには、まず、3キロダルトンの膜を使用して、コロイドと可溶性銀の混合物をろ過します。次に、装填したフィルターを14, 000Gsで10分間、冷蔵遠心分離機で回転させます。

濾液50μLから、ICP-MS分析により銀濃度を測定します。アリコートを50ミリリットルのテフロンビーカーに入れ、ビーカーに2ミリリットルの超高純度硝酸を加えます。次に、混合物をホットプレート上で摂氏110度で加熱します。

約3時間の加熱で、溶液をほぼ乾かします。ビーカーが冷めたら、有機固形物を完全に溶解します。ビーカーに2ミリリットルの超高純度硝酸と0.5ミリリットルの過酸化水素を加えます。

次に、混合物が再びほぼ乾くまで、混合物を再度加熱します。次に、残りの残留物を超純水で作られた1パーセントの超高純度硝酸の4ミリリットルに溶解します。溶液を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

残りの固形物をテフロンビーカーに溶解するプロセスをさらに2回繰り返し、3つのコレクションを1つのチューブに冷却します。次に、ICP-MSを使用してサンプル中の銀濃度を測定します。メーカーが推奨するプロトコルを使用して、サンプルを分析します。

必ず内部標準と外部標準を使用してください。塩分がSNC毒性に及ぼす影響は容易に明らかであった。奇形または死亡の誘発は明らかに塩分に依存していました。

様々な生理学的測定を行った。心拍数は、塩分濃度が30 X ERMに達するまで影響を受けませんでした。体長は、塩分濃度が15倍と30倍のERMで有意に短かった。

目の直径も減少し、体の長さと一致しました。孵化は15 X ERMでは起こりにくく、30 X ERMでは卵の2%でしか発生しませんでした。実験溶液では、塩濃度が増加するにつれて、水溶性金属錯体がより容易に形成されました。

6日後の胚中の金属錯体の検査では、溶液中の濃度が上昇するにつれて、胚中の金属錯体濃度が上昇したことが示されました。この手順を試行する際には、酸性条件によって銀イオンの放出が促進されるため、試験条件のpHを調整することを忘れないでください。