毒性のための飲料水試料の迅速な評価のためのRTgill-W1細胞とのインピーダンスベースの流体バイオチップの製造および試験

この手順の全体的な目標は、バイオセンサーを使用して飲料水サンプルの毒性を評価する方法を実証することです。これは、ニジマスの鰓細胞の単層を含むバイオチップを作成し、それらをインピーダンスベースのバイオセンサーの一部として使用することによって達成されます。この手順は、人間の健康に関連するレベルで飲料水供給の化学的毒性を迅速に検出する方法を提供します。

この技術の主な利点は、バイオチップを現場条件下で使用できること、細胞の手入れやメンテナンスなしで最大9か月間冷蔵保存できること、およびテストの準備ができており、冷蔵から取り出した後の任意の時点で使用できることです。この手順を実演するのは、私たちの研究室の学部生であるJordan McNairnです。細胞播種の前日に、バイオチップをパッケージから取り出し、滅菌したプラスチック製の器具ケースに入れます。

チューブアセンブリの1つをシリンジに取り付け、20%漂白剤溶液を20ミリリットルのシリンジに吸い込みます。バイオチップの各チャネルに2ミリリットルの溶液を注入します。終了したら、バイオチップを漂白剤溶液と一緒に1時間放置します。

1時間後、真空ラインに取り付けられたオスのスリップルアーアセンブリを取り付けた滅菌1ミリリットルのシリンジを使用して、両方のチャネルから漂白剤溶液を吸引します。バイオチップから漂白剤を吸引した後、バイオチップの両端にオスのスリップルアーが付いた滅菌チューブアセンブリをバイオチップに取り付けて、バイオチップをすすぎながらドレーンとして使用します。次に、滅菌水を20ミリリットルの注射器に吸い込み、チップの各チャネルを5ミリリットルの水で洗い流します。

以前と同じように水を吸引します。そして、バイオチップをプラスチック製の器具ケースに戻します。バイオチップは翌日までバイオセーフティフードに入れておきます。

バイオチップを播種する1時間前に、バイオチップの各チャネルに10マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチン溶液を2ミリリットル注入します。バイオチップをバイオセーフティフード内で60分間インキュベートし、フィブロネクチン溶液を真空吸引します。最後に、2つの滅菌バイオチップチューブアセンブリをバイオチップのポートに置き、細胞が播種する準備ができるまでバイオチップを脇に置きます。

ニジマスギル上皮細胞を含むコンフルエントT-175フラスコを1つインキュベーターから取り出し、バイオセーフティフードに入れます。1つのコンフルエントT-175フラスコは、約16のバイオチップを播種することができます。細胞から培地を吸引します。

PBSですすぎ、PBSを吸引します。次に、6ミリリットルのトリプシン-EDTA溶液を細胞層に加えます。フラスコを室温で約5分間インキュベートします。

次に、15ミリリットルの完全L-15細胞培養培地を各フラスコに加え、トリプシンを不活性化します。細胞懸濁液から少量のアリコートを採取し、血球計算盤を使用して細胞の濃度を測定します。10倍対物レンズを装備した明視野顕微鏡で細胞を観察します。

次に、現在の細胞濃度を計算し、細胞懸濁液をミリリットルあたり25万個の細胞の濃度に調整します。次に、滅菌済みの20ミリリットルシリンジを使用して、2.5ミリリットルの細胞懸濁液をバイオチップの各チャネルの外側ポートに注入します。余分なセル懸濁液がチューブから廃棄物容器に流れ込むのを待ちます。

次に、各バイオチップチャネルの閉鎖ループを作成するには、ルアーフィッティング付きのホースの自由端を各チャネルの外側ポートに挿入します。次に、ペーパータオルを70%エタノールで湿らせ、それを使用して閉じたループから余分なメディアを拭き取ります。次に、バイオチップをプラスチックの箱に戻します。

4日目と7日目に、バイオチップをインキュベーターから取り出します。そして、バイオチップ内の培地を温度平衡化した完全L-15細胞培養培地と交換します。7日目の給餌後、チップからホースを取り外して廃棄し、オートクレーブのドレンプラグをバイオチップに挿入します。

バイオチップを6°Cのインキュベーターの箱に入れ、試験に使用するまで待ちます。ECIS テストリーダーと消耗品をキャリングケースから取り出し、リーダーの電源を入れます。また、準備したバイオチップの1つを摂氏6度のインキュベーターから取り出し、ペーパータオルの上に置きます。

10ミリリットルの注射器を使用して、10ミリリットルの制御水をラベル付きの0.5オンスの透明なプラスチック製制御ジャーに分配します。正確な測定のために、必ず気泡を取り除いてください。次に、別のシリンジを使用し、10ミリリットルの試験サンプルを0.5オンスの透明なプラスチック試験瓶に分注します。

次に、2つの粉末培地バイアルを取り出します。粉末培地バイアルの1つを開き、1つのバイアルの全内容物をコントロール水と一緒にジャーに注ぎ、バイアル全体も溶液に落とします。テスト jar でこの手順を繰り返します。

次に、瓶に蓋をして振って、粉末が完全に溶解していることを確認します。青色の10ミリリットルシリンジに9ミリリットルの制御溶液を入れます。そして、それぞれのバイアルから9ミリリットルの試験溶液が入った赤い10ミリリットルの注射器。

シリンジから既存の気泡をすべて取り除きます。次に、バイオチップポートからプラグを取り外し、ドレンを取り付けます。バイオチップをECISリーダーの取り外し可能なプラスチックトレイに入れ、蓋を閉めてから、充填されたシリンジを外側のバイオチップポートに取り付けます。

最後に、シリンジプランジャーを取り付けます。リーダーのメイン画面から、[次へ] を選択して事前テストを開始します。その後、ソフトウェアは初期インピーダンスをチェックします。

インピーダンスが範囲内にある場合、画面は「カートリッジに合格しました」と登録し、ユーザーに「次へ」を選択するように指示します。次に、ソフト キーボードを使用してサンプル情報を入力し、完了したら [同意する] を選択します。この時点で、挿入されたバイオチップから2分間のインピーダンスデータが収集され、画面上のタイマーが時間をカウントダウンします。

2分後、[次へ]をクリックします。緑色のボックスが点滅して「Injection samples now」に促されたら、取り付けられたシリンジからコントロールメディアとテストメディアを同時にバイオチップチャネルに注入します。終了したら、シリンジをバイオチップの所定の位置に置いておきます。

ECISリーダーソフトウェアが、試験中の任意の時点で治療チャネルが制御チャネルと統計的に異なると判断した場合、画面上のディスプレイにサンプルが汚染されていることを示します。それ以外の場合は、監視期間の終了時に汚染が検出されなかったことを示します。各サンプルについて、テスト結果を「汚染」または「汚染されていない」として記録します。

テスト実行の最後に、バイオチップを取り外して廃棄します。シリンジ、テストバイアル、およびテスト中にバイオチップを収納した取り外し可能なプラスチックトレイをすすぎ、風乾します。ここに示されている13の化学物質は、飲料水の汚染物質である可能性のある広範囲の有毒工業化合物の代表として、試験のために選択されました。

試験中、13個のうち9個が1時間以内に、人間の健康に関連する濃度で、電気セル基板インピーダンスセンシングによって検出されました。ここでは、電気セル基板のインピーダンス検出テスト後に見られる一般的な出力を示します。汚染されたサンプルは、対照のきれいな水のサンプルと比較すると、インピーダンスレベルが大幅に低くなります。

このビデオを見た後、ニジマス鰓上皮細胞の単層でバイオチップを調製し、その後、飲料水の毒性を評価するためのインピーダンスベースの毒性試験でそのバイオチップを使用する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、バイオチップの準備に無菌的に作業すること、およびバイオチップが使用されるまで冷蔵しておくことを覚えておくことが重要です。各バイオチップは一度しか使用できず、その後は廃棄する必要があります。

一度習得すれば、バイオチップの調製は約10分で完了します。チップはバッチで準備されるため、これは推定値です。サンプルのインピーダンステストは、適切に実施された場合、サンプル調製を含めて約1時間10分かかります。

この手順に続いて、汚染された結果をもたらしたサンプルに対して分析化学などの他の方法を実行して、疑わしい化学物質を特定することができます。この技術の開発により、水毒性センシングに関心のある研究者が、ニジマス、ギル上皮細胞、インピーダンスセンシングを用いた技術を活用する道が開かれます。これらの技術が役立つことを願っており、これらの新機能が促進するのに役立つ可能性のある将来のイノベーションに期待しています。

ありがとうございました、そして素晴らしい一日をお過ごしください。