繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

このプロトコルの全体的な目標は、平面細胞極性の表現型について毛様体変異マウス蝸牛を調べることです。これらの技術により、蝸牛の表現型を広範囲に詳細に調べることが可能になり、脊椎動物のPCPシグナル伝達の確立における毛様体の関与をより正確に理解することができます。このプロトコルの主な利点は、一度習得すると、解剖された蝸牛上皮をさまざまな種類の表現型分析に使用できることです。

実験動物から試薬と組織を調製した後、発生段階E16.5からp3で、メスの刃または小さなハサミを使用して、鼻から伸びるコタイルまで矢状正中線に沿って頭を解剖します。一対の鉗子で頭蓋骨の各半分から脳を取り出します。次に、内耳の発達中の骨迷路を含む側頭骨を特定します。

解剖顕微鏡でサンプルを操作している間、一対の鉗子を使用して、鉗子を骨迷路の下に穏やかに走らせることにより、頭蓋骨から骨の迷路を賞賛します。解剖後、解剖鉗子の先端を使用して楕円形と円形の窓をクリアし、蝸牛スパイラルの頂点に小さな穴を開けます。次に、骨の迷路を1.5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで氷上で5分間固定し、構造膜を簡単に除去できるようにします。

次に、骨の迷路をPBSを含む黒いシリコンエラストマーコーティングされた解剖皿に入れて、解剖を容易にします。5番の鉗子を使用して外側の軟骨を切除し、蝸牛管を露出させます。楕円形の窓から始めて、鉗子の底の先端を楕円形の窓に挿入し、軟骨をゆっくりとこじ開け、ゆっくりと頂点に向かって上に移動します。

次に、細い鉗子を使用して、蝸牛管の基部にあるライスナー膜をつまみ、上向きに剥がします。感覚上皮を含む蝸牛管の背側を視覚化します。次に、55番の鉗子を使用して、蝸牛の基部にある皮膚膜をつまみ、頂点に向かって上向きに剥がします。

免疫組織化学で最良の画像を得るためには、皮膚膜を完全に除去する必要があり、走査型電子顕微鏡には不可欠です。コルチの器官を露出させた後、組織をさらに固定し、免疫組織化学を行うか、またはプロトコルの書かれた部分に詳述されているように走査型電子顕微鏡検査の準備をします。組織を染色した後、PBSを含む黒色のシリコーンエラストマー皿にサンプルを置きます。

細い鉗子を使用して、蝸牛スパイラルから前庭領域を切除します。次に、蝸牛スパイラルから下にある軟骨と間葉を非常に慎重に取り除きます。残りの蝸牛螺旋には、内側の溝、コルチの器官、および外側の溝が含まれています。

蝸牛スパイラルを顕微鏡スライド上に置かれたPBSの滴に移します。吸収性ティッシュまたは濾紙でPBSを吸い取り、上皮がずれて重なっている場合は、蝸牛スパイラルをゆっくりと再配置します。蝸牛サンプルに封入剤を直接加え、気泡を避けながら、カバースリップを直接サンプルにそっと置きます。

高倍率と高開口数対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡またはレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、蝸牛有毛細胞の頂端表面の画像を撮影します。低い対物レンズを使用して蝸牛スパイラルの重なり合う画像を撮影し、蝸牛管の長さを定量化します。次の図は、出生後の1日目型蝸牛の基底回転の免疫蛍光染色を示しています。

ファロイジンは、立体繊毛の糸状アクチンを標識し、細胞末梢の皮質アクチンを標識します。ミオシンVIIAは、内有毛細胞と外有毛細胞のマーカーです。ZO_1は、セル間のタイトジャンクションにラベルを付けるため、セル境界を区別するための優れたマーカーになります。

アセチル化α-チューブリンは、白い矢印で示されているように、束の頂点でキノシリウムのマーカーとして使用されます。内部微小管は、白いアスタリスクで示されているように、柱細胞に特に豊富に存在するアセチル化α-チューブリンによっても標識されます。この画像は、E18.5 で解剖された蝸牛管をアセチル化チューブリンで染色したもので、対照と比較して IFT20 コンディショナルノックアウト蝸牛管が著しく短縮されていることを示しています。

次の図は、出生後ゼロ日目のBBS8ノックアウトマウスにおける基底蝸牛回転の全マウント調製です。BBS8ノックアウト蝸牛の立体線毛束は、右矢印で示されるように可変回転するか、中央矢印で示されるように平らになって誤って局在化します。左矢印で示されているように、キノシリアが誤って局在化しているか、軸索が欠落しています。

解析のために蝸牛の表現型を準備する際には、遺伝的背景の違いが蝸牛の表現型を変更する可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、分析には同腹仔コントロールを使用することが重要です。さらなる解析には、蝸牛外植片の聴力検査や培養などがあり、これによりさまざまなシグナル伝達活性化因子や阻害剤による治療が可能になり、関与する発生過程の機構的理解に貢献しています。

このビデオを見れば、繊毛成分の役割とPCPシグナル伝達に対するそれらの明確な影響を分析するための蝸牛組織の作り方について十分に理解できるはずです。