成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。

このホールマウント解剖法の全体的な目標は、石灰化した成体蝸牛の感覚領域を、頂点、中央、基部の 3 つの無傷のターンとして分離することです。この解剖法は、コルチ器官の三次元構造を保持し、免疫染色および共焦点顕微鏡法と組み合わせてZ軸の異なる平面で画像化することにより、すべての細胞を可視化することができます。従来の解剖法と比較して、免疫染色プロセスで失われたり損傷したりする可能性が低く、大きくなりにくい3つの蝸牛ターンを生成するという異なる戦略を使用しています。

この方法は、解剖を学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。コルチの臓器は壊れやすいため、らせん状靭帯を取り外すときに誤差がわずかにあります。承認された手順に従って動物を安楽死させ、脳を取り出した後、マウスの頭蓋骨の基部にある側頭骨を特定することから始めます。

次に、標準パターンの鉗子を使用して脳神経をこすり落とします。鉗子を耳嚢の先端に置き、反対側の手の親指を使用して後部半規管を押し下げ、カプセル化された蝸牛を取り除きます。側頭骨の下半分を親指と人差し指で手動で、または10.5センチメートルの細いはさみを使用して頭蓋骨から解放し、メタノール自由電子顕微鏡グレード4%パラホルムアルデヒドで固定します。

固定後、プロトコルの書かれた部分の指示に従って側頭骨を脱灰します。サンプルが適切に脱灰されているかどうかを判断するには、側頭骨をシリコンエラストマーでコーティングされた解剖皿に置き、鉗子をカタツムリの形をした蝸牛にそっと押し付けます。組織が海綿状であれば、脱灰は完了です。

解剖皿にPBSを加え、実体解剖顕微鏡で作業しながら、4番または5番の鉗子を使用して前庭部の側頭骨を保持し、5ミリリットルのVannas-Tubingenスプリングハサミを使用して、側面と頂点の上の余分な耳嚢組織を切り取ります。2.5ミリリットルのVannasスプリングハサミを使用して、楕円形の窓に1つのブレードを挿入し、基底回転のらせん状靭帯に沿っていくつかの小さな切り込みを入れます。次に、5ミリリットルのVannas-Tubingenスプリングハサミの片方の刃を切ったばかりの領域に挿入し、もう一方の刃を側頭骨の外側、楕円形の窓の内側に置きます。

このカットは、基底ターンを中央ターンとアピカルターンから分離します。次に、基底回転の解剖を完了するために、2.5ミリリットルのスプリングハサミを使用して、基底回転に接続するらせん状神経節神経線維を切断し、基底回転の緊張をほぐします。基底部のターンの下に切り込み、前庭器官から分離します。

鉗子を使用して組織をガイドし、らせん状神経節繊維をシリコーンエラストマーコーティングされた皿に固定します。コルチ器官の上下の両方かららせん状靭帯を取り除くために、一連の小さな切り込みを入れます。らせん状神経節繊維をシリコーンエラストマーコーティングされた皿に固定した状態で、鉗子を使用して、コルチ器官から残っているライスナー膜を取り除きます。

らせん状神経節軸索の厚さを減らすために、いくつかのカットを行います。次に、鉗子でらせん神経節の残りの軸索をつかみ、解剖した基底回転を約500マイクロリットルのPBSを含む48ウェルプレートに移します。次に、最初に蝸牛の残りの3分の2を下にして、中央ターンと頂端ターンを分離します。

次に、2.5ミリリットルのはさみの1つのブレードを、中央のターンが以前に基底ターンに接続されていたスカラメディアに挿入し、中央のターンのらせん状靭帯に沿っていくつかの切り込みを入れます。5ミリリットルのハサミを使用して、切り口に1つの刃を挿入し、中央のターンを刃の上に置きます。もう一方のブレードを骨の迷路の外側に、頂端の先端から90度の角度で配置します。

このカットは、中央のターンと頂端のターンを分離します。次に、コルチ器官から螺旋状靭帯を切除することにより、中回転の解剖を完了します。解剖したターンを前と同様に48ウェルプレートに移します。

次に、2.5ミリリットルのバンナススプリングハサミを使用して、頂端回転を覆うキャップを開き、コルチの器官から頂端回転スパイラル靭帯を取り外す手順を繰り返します。解剖したターンを前と同様に48ウェルプレートに移します。免疫染色手順を開始するには、まず各ウェルからPBSを吸引し、次に200〜300マイクロリットルのブロッキング溶液に交換し、3Dローテーター上で室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション時間が経過したら、ブロッキング溶液を取り出し、キャリア溶液で適切に希釈した100マイクロリットルの一次抗体と交換します。3Dローテーターで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を取り出し、各ウェルを500マイクロリットルのPBSで室温で毎回少なくとも5分間洗浄します。

洗濯を2回繰り返します。最後の洗浄後、PBSを吸引し、ピペットチップの解剖されたターンを吸い上げないように注意してください。1ウェルあたり100マイクロリットルの蛍光標識二次抗体をキャリア溶液で希釈したものと交換してください。

48ウェルプレートを光から保護するためにブラックボックスに入れ、3Dローテーターに置いて室温で2〜3時間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、前回と同様にPBSで3回洗浄します。最後の洗浄液を取り出した後、100マイクロリットルのHoechstを標識核に加えます。

光から保護し、3Dローテーター上で室温で15〜20分間インキュベートします。最後に、Hoechst溶液を取り出し、前回と同様にPBSで3回洗浄します。各スライドにラベルを貼った後、50マイクロリットルの封入剤を各スライドにピペットで貼り付けます。

次に、4番または5番のストレートジュエラーの鉗子を使用して、らせん状神経節の軸索をつかみ、48ウェルプレートから1つの蝸牛の回転をマウントメディアに静かに移します。顕微鏡を使用して、解剖されたターンが折りたたまれたりねじれたりしていないことを確認します。カバースリップの一方の端をスライドに置き、ゆっくりと放してカバースリップを落下させます。

実体解剖顕微鏡を使用して、蝸牛の回転が気泡の近くにないことを確認します。これが発生した場合は、カバースリップをゆっくりと前後に動かして、蝸牛の回転を再配置します。他の蝸牛ターンについてもこの手順を繰り返します。

スライドごとに1回転の蝸牛を取り付けて、イメージングプロセス中の光の露出や写真の退色を防ぎます。スライドをスライドフォルダーに入れて、平らになるようにします。光を避け、封入剤を室温で一晩硬化させます。

翌日、シールカバーを透明なマニキュアで滑り、画像が表示されるまで室温または摂氏20度で保管します。この共焦点スライス画像は、p15マウスから分離された蝸牛の中回転を示しています。420Xの画像を重ね合わせて、中央のターン全体を再構築しました。

ウサギ抗ミオシンVIIa一次抗体とAlexa 647標識二次抗体で標識された有毛細胞は、マゼンタ色に見えます。ヤギ抗SOX2一次抗体およびAlexa 568標識二次抗体で標識した支持細胞は緑色で表示されます。核はヘキスト染色により青色に見えます。

スケールバーは100ミクロンを表します。この画像は、X、Z平面で生後6週間のマウスから分離された中央ターンの光学断面を示しています。ここでも、有毛細胞はマゼンタの蛍光色素で標識され、支持細胞は緑色に見える蛍光色素で標識されます。

これは、前の画像の拡大率を上げたもので、十字線が取り除かれています。スケールバーは20ミクロンを表します。次の 4 つの画像は、マウント全体の解剖中、またはマウント蝸牛がスライドをオンにするときに発生する可能性のある問題の一部を示しています。

ここでは、画像の左側で、外側の有毛細胞の最後の列の隣で蝸牛組織が切断され、これらの細胞の多くがさまざまな角度で取り付けられています。この画像では、左側のコルティの臓器の一部が切り取られています。画像の中央にある外側の有毛細胞領域に穴が開けられています。

ここでは、コルティの臓器がいくつかの場所で折りたたまれています。一度習得すれば、マウント全体の解剖技術は20分から30分で完了することができます。この手順を実行するときは、鉗子をコルチの臓器に配置しないようにし、らせん靭帯を引っ張ったりつかんだりしないようにすることが重要です。

代わりに、鉗子を閉じて、らせん状神経節繊維をシリコーンエラストマーコーティングされた皿に固定します。生後1〜3週齢のマウスのサンプルは、解剖方法を学ぶのにより寛容で有用です。さらに、有毛細胞が損傷したサンプルは解剖が難しく、ノイズにさらされた組織は特に困難で壊れやすいです。

この解剖手順に続いて、走査型電子顕微鏡などの他の方法を実行することができます。ただし、別の固定剤が必要です。さらに、ラット蝸牛組織の解剖のためにこのプロトコルにわずかな変更を加えましたが、将来的には、チンチラ、スナネズミ、モルモットの蝸牛の解剖のためにさらに変更を加えたいと考えています。