Name: 成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ成体マウス蝸牛のホールマウント解剖法。コルティ器の三次元構造を保持し、免疫蛍光と共焦点顕微鏡で毛細胞と支持細胞を可視化する技術。聴覚研究と神経科学に応用可能です。

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この作業は、Office of Naval Research（N000141310569）からの助成金によって部分的に支援されました。南イリノイ大学医学部研究イメージング施設の機器は、National Center for Research Resources-Health(S10RR027716)の支援を受けました。

倫理の声明：動物を対象とする手順は、医学のサザンイリノイ大学での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 頭骨の1の抽出<ol><li>マウスの頭蓋骨13のベースに頭骨を識別し、標準パターン鉗子を使用して脳神経を削り取ります。 </li><li>カプセル化された蝸牛を取り除くために、耳のカプセルの先端に、下後部三半規管に反対ハンドプレスの親指で標準パターン鉗子を置きます。 </li><li>親指と人​​差し指で、または10.5センチメートル細かいハサミを使用して手動で頭蓋骨から頭骨の下半分を解放します。 </li></ol> 2.ポストフィックス頭骨<ol><li> 10mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4とincubで希釈し、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA） - 250を含む2 mlのマイクロ遠心チューブに頭骨を配置20時間 - 2 RTで食べました。 注：円形または楕円形のウィンドウにPFAの頂端キャップまたは注射のいかなる開口部は必要ありません。ガラスバイアル中に16％の濃度で購入することができ、メタノール無料、超純、電子顕微鏡（EM）グレードPFAを使用することをお勧めします。バイアルを開け、1に希釈された後：PBS中4 4 O C（いくつかの抗体は、短い固定等を必要とする/ O（O / Nを許容することができるで保存した場合、4％の溶液を作り、それは最大2週間のために使用することができますN）固定）。 </li></ol> 3.脱灰頭骨<ol><li>固定後、ピペットを用いてPFAを削除し、120 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、少し以上の2mlで交換してください。管が閉じているときに空気が気泡を防ぐために、全体の2ミリリットルのマイクロチューブを記入してください。 <ol><li>すぐに脱灰されていない場合は、4 O℃で10mMのpH7.4のPBSと店舗のサンプルでPFAを交換 注：固定した後、側頭骨はvariab保存することができます検査されている抗原に応じて脱灰前の時間のル量。 </li></ol></li><li>転倒型回転器の上に置い管、室温で4 rpmで回転させます。ピペットを用いて毎日EDTA溶液を変更します。脱灰の長さは、サンプルの年齢および解剖をやって科学者の好みに依存します。 <ol><li>インキュベーション時間については、次のガイドラインを使用して、EDTA中で頭骨をインキュベート： 8 P15のサンプル生後日（P）の場合：2から4時間。 P21のサンプルP15の場合：O / N。 P30のサンプルP21の場合：2 O / N。 3以上のO / N：P30より古いサンプルについて。 注：脱灰時間は、ユーザーの好みの対象となり、必要に応じて拡張することができます。脱灰時間は約8時間離れて、一日二回EDTA溶液を変化させることによって低減することができます。汚染を防止するために、より長い3日間脱灰すると、一部のラボでは、EDTA溶液に1％PFAを追加します。 </li></ol></li><li>サンプルが十分に脱灰であるかどうかを判断するには、側頭骨のOを配置シリコンエラストマーで被覆された解剖皿をNAと優しくカタツムリ状の蝸牛に鉗子を押してください。組織がspongeyである場合、脱灰は完了です。 </li><li>脱灰が完了すると、ピペットを用いて、EDTAを除去し、10mMのpH7.4のPBSの500 -1000μlを添加します。解剖準備ができるまで4 O Cで保存サンプル。 </li></ol> 4.シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿を作成します。 <ol><li>ベースとシリコーンエラストマー封止キットの硬化剤は、製造者の指示に従って結合し、十分に混合します。 </li><li>ソリューションが黒になるまで粉末木炭の大さじ3、よく混ぜる - 約2を追加します。 注：液体インクまたは液体木炭を溶液と混合せず、使用することはできません。シリコーンエラストマー封止キットは、ステップ4.2を省略することができるように、黒で購入することができます。 </li><li>被覆に十分な底部を充填し、60 mmのガラスまたはプラスチック製のペトリ皿に溶液を注ぎます。 BU場合bblesは、表面上の空気とパフ存在しています。設定するには、室温で少なくとも24時間放置し。 注：シリコーンエラストマーで被覆された料理は何年も繰り返し使用することができます。これはシリコーンエラストマーに亀裂が発生しますしかし、洗浄のためにエタノールを使用しないでください。 </li></ol> （P7と古いサンプル用）蝸牛の5ホールマウント解剖<ol><li>頂端/ミドルターンから基底回転を分離<ol><li> 10mMのpH7.4のPBSで三分の二のフル充填シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿に1脱灰頭骨を置き、次のステップのためのステレオ解剖顕微鏡を使用しています。 </li><li> ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を用いて前庭地域の頭骨を持ち、5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、側面に沿って頂点上記過剰耳のカプセル組織を切り取ります。 </li><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、楕円形のウィンドウに1ブレードを挿入し、スパイラル靭帯/横に沿っていくつかの小さなカットを作ります基底回転の壁。 </li><li> 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、ちょうど卵円窓に正中、側頭骨の外に他のブレードをカットし、配置領域に1ブレードを挿入します。このカットは、中間および頂端ターンから基底回転を分離します。 </li></ol></li><li>基底回転の完全解剖。 <ol><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、基底回転の緊張を解放し、前庭器官から分離するために基底回転の下にカットする蝸牛軸に接続し、螺旋神経節神経繊維をカット。 </li><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、コルチ器官の上および下の両方からスパイラル靭帯/側壁を除去するために、小さなカットのシリーズを作ります。組織を導くために、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子を使用してください。シリコーンエラストマー被覆解剖皿にらせん神経節神経線維をピンが、組織が裂けるように、この領域に保持していません。 </li><li>前の手順、ライスナーのmembranのいくつかの中にeは、多くの場合、削除されます。いずれかがまだ残っている場合は、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子でライスナーの膜を把握し、コルチ器官から引き離します。 注：被蓋膜がまれに表示され、一般的に除去するための具体的なステップを必要とせずに離れて浮きます。 </li><li>最後に、できるだけ平坦ターンを行い、スパイラル神経節の残りの軸索を把握することで、解剖基底回転を転送するために＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用するように、スパイラル神経節軸索の厚さを減らすためにいくつかのカットを作ります10mMのpH7.4のPBSの〜500μLを含む48ウェルプレート（またはチャンバースライド）。 </li></ol></li><li>個別の真ん中と頂端ターン<ol><li>蝸牛の残りの三分の二、頂端側を下に置きます。 </li><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、中間ターンは基底回転に接続するために使用される中央階に1ブレードを挿入して、目のスパイラル靭帯/側壁に沿っていくつかの小さなカットを作ります電子真ん中のターン。 </li><li> 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、単に刃の上に置かミドルターンで切断領域に1ブレードを挿入し、先端チップ部から90 Oの角度で、骨迷路の外に他のブレードを配置します。これは、頂回転の中からターンを分離します。 </li></ol></li><li>基底回転と同様に、中間ターンの完全な解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。 </li><li>頂回転の完全解剖。 <ol><li> 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、頂回転を覆うキャップを開きます。基底回転と同様に完全解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。 注：解剖蝸牛ターンは免疫染色の前に数週間4°Cの時に48ウェルプレート（またはチャンバースライド）に10mMのpH7.4のPBSに格納することができます。しかし、PBS長い2よりも蒸発し、定期的に補充する必要があり、記憶されます - 3週間で、細菌または真菌の増殖をもたらすことができます画像の品質を低下させることができる組織。我々はundissected頭骨などの試料の長期保存をお勧めします。 </li></ol></li></ol>蛍光タグ付き抗体による免疫染色6. <ol><li>解剖後、10mMのpH7.4のPBSの〜500μlの中に沈め、48ウェルプレート（またはチャンバースライド）で別々のウェル中の各蝸牛ターンを格納します。以下の各ステップについて蝸牛ターンは、液体中に浸漬されなければならない上に浮いていないか、ウェルの側面に付着しました。 注：各ウェルから液体を除去すると、それは蝸牛のターンを失うか、ピペットチップでそれを吸うのは簡単です。解剖スコープを使用して、200μlのピペットチップでソリューションを変更すると、これを防ぐことができます。 </li><li>ピペットを用いて、各ウェルからPBSを除去し、置き換える〜200と - /ブロッキング透過化溶液（ウェルあたり300μlの1％トリトンX-100、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、及び10％正常ヤギ血清（NGS） 10mMのPBS Pに希釈H 7.4）。 3D回転体に室温で1時間インキュベートします。 注：使用される任意の一次抗体は、ヤギのホストで行われた場合、二次抗ヤギ抗体が必要とされ、NGSは、ステップのいずれかに使用することはできません。正常ウマ血清をNGSの代替として使用することができます。 </li><li>ピペットを用いてブロッキング/透過処理溶液を除去し、一次抗体溶液をウェル当たり〜100μlで置き換える（0.1％トリトンX-100、10mMのPBS（pH7.4）中に希釈し、1％BSAおよび5％NGS）。各一次抗体のための希釈率が変化します。 3D回転体に4 O℃で O / N（最低14時間）インキュベートします。 注：複数の一次抗体を使用している場合は、すべてのインキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができ、ちょうど各一次抗体は、別のホストを持っていることを確認してください。 </li><li>ピペットを用いて、一次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。各洗浄は、3D回転体に室温で5分間の最小値をインキュベートします。 </li><li>最後のPを削除しますBSは、ピペットを用いて洗浄し、二次抗体溶液（0.1％トリトンX-100、1％BSAおよび5％の10mM PBS pH7.4中で希釈したNGS）のウェル当たり〜100μlで置き換えます。それぞれについて、希釈係数は、蛍光二次抗体をタグ付け、通常は1：500または1：1,000。光から蛍光タグ付き二次抗体を保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを置きます。 3D回転体に室温で3時間 - 2をインキュベートします。 注：複数の二次抗体を必要とする場合は、インキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができます。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギおよびニワトリ抗ヤギ二次抗体を用いて）は、クロス標識の可能性がないことを確認してください</li><li>ピペットを用いて、二次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 </li><li>ピペットを使用して、最後のPBS洗浄を外し、Hoecのウェル当たり〜100μlの置き換え核を標識する：HST 33342（10mMのpH7.4のPBSで2000倍に希釈）。 3D回転体に室温で20分 - 15インキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 20分以上インキュベートしないでください。 </li><li>ピペットを用いて、ヘキスト溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 </li><li>必要に応じて、すべてのステップは、数時間、ヘキストインキュベーション以外は、拡張することができます。 2日後に-ちょうど10mMのPBS pH7.4のの〜500 ulの中のサンプルを沈め、プロトコル時間を再開する準備または1まで4°Cの時に48型ウェルプレート（またはチャンバースライド）を保存、いずれかの段階で反応を一時停止するには。 </li></ol> 7.マウント蝸牛は、スライドをオンにします<ol><li>ラベルは、使用した試料と抗体に関する適切な情報を摺動します。 </li><li>ピペット取り付けメディアの〜50μlの各スライドの上にと注意してください気泡を防止します。任意の気泡を除去するために取り付けたメディアを含むチューブを遠心。 </li><li> ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用して、ゆっくりと取り付けメディアにスライドし、場所に48ウェルプレートから1蝸牛ターンを転送するために、螺旋神経節の軸索を把握。マウントイメージングプロセス中に露光し、光退色を防止するために、スライドごとに1蝸牛ターン。 </li><li>蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確実にするために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、＃4を使用するか、＃5ストレート宝石商の鉗子は、蝸牛ターンを再配置します。 </li><li>スライド上のカバーガラスの一端を置き、静かにカバーガラスの落下させるために解放します。 </li><li>蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確認するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、そっと蝸牛ターンを再配置するために、前後にカバースリップを移動します。 </li><li>場所スライドようにスライドフォルダにそれらが平らに横たわっていました。マウントしてみましょうメディア硬化O / RTでN（DARKておきます） </li><li> C O RTでマニキュアと店舗クリアまたは-20でシールしたカバー画像化まで。スライドは、スライドフォルダまたはスライドボックスに格納することができます。 注：スライドは、C O -20 O Cまたは -80で長期に保存することができ、蛍光は、数ヶ月のために維持されます。 </li><li>免疫染色の手順の間に使用される二次抗体に基づく適切な波長を有する共焦点顕微鏡を用いた画像スライド。明るさとコントラストの調整は、共焦点ベンダーによって提供イメージングソフトウェアを用いて行うことができます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

<html>成功した全体のマウント解剖および免疫染色のためにいくつかの重要なステップがあります。これらの方法のいずれかが実行される前に、しかし、蝸牛組織の適切な固定が必要とされています。我々は、超純粋な遊離メタノール、EMグレードPFAを使用することをお勧めします。 PFAは、メタノールおよび免疫蛍光の品質を低下させる不安定なpH値の痕跡を持つことができる粉末から作られました。他のグループも同様の解剖ホルムアルデヒド14-16を含まない固定剤を使用して可能であることを示しました。固定の長さも重要であり、特異的な抗体です。他の人がPFAでわずか1時間（ただし、これは稀である）とうまく動作しませんがいくつかの抗体は、O / Nの固定を許容することができます。組織が崩壊してしまうよう下で固定した組織は、解剖法に問題がある可能性があります。我々の経験では3から4時間の固定が十分な固定を提供し、一般的に聴覚分野で使用される一次抗体の大半を妨げることはありません。 jove_contentは &quot;&gt;これは、EDTAは一次抗体に干渉する可能性もある。このようにいくつかの抗体は、新生児組織ではなく、P7または...

側頭骨内に含まれている内耳の螺旋状の蝸牛は、コルティ、哺乳類における聴覚感覚終末器官の器官を収容します。蝸牛はtonotopically編成、一般頂端、中間に分割され、基礎ベースの高周波音検出と頂点1における低周波検出に異なる周波数領域に対応するオン。れます有毛細胞、コルチ器官の機械刺激細胞は、マウス2,3で約6mmの長さである蝸牛の長さを実行します。これらの細胞は、中枢聴覚構造によって処理された神経信号に、液体で満たされた膜迷路を介して送信された音波の機械的エネルギーを変換します。ここに記載された技術は、蝸牛の石灰化は、（1週齢から成人期までのサンプルのため）が完了した後にコルチ器官の全体のマウントを製造する方法を提供します。また、immunostaための方法を提示全体ining蝸牛組織を搭載しています。蝸牛全体のマウントは、その自然の空間配置内のすべての有毛細胞と周囲の支持細胞の可視化のために重要であると共焦点顕微鏡を用いた三次元で分析が可能。 博士。ハンス・エングストロームハーローアデスは、もともと彼らは急速に顕微鏡分析4のためにコルチ器官の短い無傷のセグメントを維持し、固定し、哺乳類の様々な液体に浸さ石灰化蝸牛を分析する手法を詳述し1966年に全体のマウント蝸牛切開法を説明しました。未固定、石灰化したラットの蝸牛の解剖も教育ビデオ5に示されています。博士。バーバラBohneとワシントン大学のゲーリー・ハーディングは、この方法にはいくつかの重要な修正を行いました。蝸牛全体のマウント方法の彼らのバージョンでは、側頭骨は、脱灰したプラスチックに埋め込まれ、5ハーフターンまたは10四半期ターンはdissecましたテッド6,7。プラスチック埋め込 ​​みが8を必要としていなかったように、イートンピーボディ研究所、マサチューセッツ州アイ、耳診療所での博士チャールズ・リーベルマンらは、この手法を変更しました。技術のさらなる変更はここに提示解剖法を知らさセントジュード小児研究病院9-12博士建祚の研究室で発生しました。我々は完全な頂端、中間、基底ターンの単離を可能にするBohneとリーベルマンよりコルチ器官へのアクセスを得るために異なる戦略を使用しています。したがって、解剖組織が大きく、解剖や免疫染色工程中に紛失または破損しにくくなります。さらに、現在の方法は、周波数領域を特定するために先端チップ部または基底フックとの距離の測定を容易にします。 多くのラボでは蝸牛組織の免疫染色を行うが、この方法は、元の場所、それは不明です。その結果、ブフェを遮断するための様々なレシピがあります個々の一次抗体の性能に影響を与える可能性のRSおよび抗体インキュベーションバッファー。ここでは、聴覚分野において最も一般的に使用される抗体に適用することができる蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための1つの方法を提示します。 蝸牛の複雑な形状、コルチ器官の繊細な構造、および骨の箱詰めは、組織学的および生化学分析のための課題を提供しています。種々の技術は、現在、これらの困難な特徴を克服し、それ自身の利点と欠点を有するコルチ、各技術の臓器内の細胞を可視化するために聴覚分野で使用されています。ここに提示されたプロトコルは、全体の成体マウス蝸牛の解剖マウントを可能にし、わずかな修正を加えて、潜在的な分野で使用される他のモデル生物の様々な蝸牛内の重要な構造を調べるために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>標準&nbsp;パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td>は他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>10.5cmの細かいはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-11</td><td>は他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>2mlの微量遠心チューブ</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>は他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>16%ホルムアルデヒド、メタノールフリー、超高純度、EMグレードの</td><td>ポリサイエンス</td><td>18814</td><td>TOXIC - 手袋を着用し、流しに捨てることはできません。他のベンダーから購入できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>PBSのpH 7.4&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P3813-10PAK</td><td>は他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP118-500</td><td>は他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>エンドオーバーエンドチューブローテーター</td><td>フィ</td><td>ッシャー05-450-127</td>は<td>他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>60mmペトリ皿</td><td>フィ</td><td>ッシャー50-202-037</td><td>は他のベンダーから購入することができます</td></tr><tr><td>ダウコーニングシルガード184シリコーン封止材キット</td><td>エルスワース 接着剤</td><td>184 SIL ELAST キット 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>フィッシャー</td><td>AC134372500</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>ステレオ解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ 2000</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>デュモン #4 宝石商の鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 宝石商の鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm バンナス スプリングはさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15001-08</td><td>湾曲&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Vannas-Tubingen スプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15003-08</td><td>ストレート</td></tr><tr><td>48 ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td>08-772-52</td><td>他のベンダーから購入可能</td></tr><tr><td>8 ウェルチャンバースライド</td><td>フィッシャー</td><td>1256518</td><td>他のベンダーから購入可能</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>X100-500</td><td>他のベンダーから購入可能</td></tr><tr><td>BSA、フラクション V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>3Dローテーター</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>Western blot incubation box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mounting media</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>は他のベンダーから購入できますが、マウントメディアは光退色から保護する能力が異なります</td></tr><tr><td>Superfrost Plus スライド</td><td>フィッシャー</td><td>12-550-15</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>カバースリップ 22 x 22 x 1</td><td>フィッシャー</td><td>12-548-B</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>クリアマニキュア</td><td>地元のドラッグストア</td><td></td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>段ボールスライドフォルダー</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-587-10</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>プラスチック製のスライドボックス</td><td>フィ</td><td>ッシャー03-448-10</td><td>は他のベンダーから購入できます</td></tr></tbody></table>

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

内耳の蝸牛に収容されているコルチの器官は、機械感覚有毛細胞と周囲の支持細胞を含み、それらはらせん状に組織化されており、音検出のためのトノトピック勾配を持っています。マウスの蝸牛の長さは約6mmで、分析のために3つのターン(頂点、中央、基部)に分割されることがよくあります。細胞の消失、細胞分裂、またはモザイク遺伝子の発現を調べるには、蝸牛の全体マウントまたは表面処理が有用です。この解剖法は、免疫染色および共焦点顕微鏡法と組み合わせてz軸の異なる平面で細胞を画像化することにより、コルチ器官内のすべての細胞を可視化することを可能にする。これらのzスタック画像から複数の光学断面積も取得できます。さらに、走査型電子顕微鏡法には、ホールマウント解剖法を使用できますが、別の固定方法が必要です。ここでは、コルチの臓器を無傷の3つの蝸牛ターン(頂点、中、基部)として分離する方法を紹介します。この方法は、生後1週間から成人期までのマウスに使用でき、蝸牛の石灰化が不完全な新生児サンプルに使用される手法とは異なります。わずかに変更されたバージョンは、ラット蝸牛の解剖に使用できます。また、蛍光標識付き抗体による免疫染色の手順も示しています。

我々は、開発の出生後第1週の間に。の石灰化を図1に示すキー解剖の手順で、石灰化である蝸牛組織から3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）とコルチ器官を単離するための方法を提示マウス蝸牛は不完全であり、より簡単な切開方法13を使用することができます。新生児全体を使用すると、P7から蝸牛と涙とコルチ器官の細断の高齢マウスの結果と解剖法をマウントします。スパイラル靭帯/側壁は今より強固に結合しており、ダメージを与えることなく、離れ感覚上皮から剥離することはできません。このように「大人」全体マウント解剖方法は、P6より古いサンプルのために必要とされます。我々は解剖し、有毛細胞と支持細胞のマーカー（ 図2）を用いて免疫染色されたP15マウス蝸牛のミドルターンの例を提示します。光クロスセクションCまた、全体のマウント技術（ 図3）で得られたこと。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

このホールマウント解剖法の全体的な目的は、石灰化した成体蝸牛の感覚領域を、頂端部、中部、底部という3つの完全な巻として分離することです。この解剖法では、コルチ器の三次元構造が維持されるため、免疫染色および共焦点顕微鏡を用いてZ軸の異なる平面で撮像することで、すべての細胞を可視化することが可能です。従来の解剖法と比較して、本手法では異なる戦略を採用しており、より大きく、免疫染色過程で紛失したり損傷したりしにくい3つの蝸牛巻を作製することができます。この解剖の手法を習得することは困難であるため、視覚的な実演が不可欠です。コルチ器は非常に脆弱であるため、らせん靭帯を除去する際の許容誤差はごくわずかです。承認された手順に従って動物を安楽死させ、脳を除去した後、マウスの頭蓋骨底部にある側頭骨を確認することから始めてください。次に、標準的なパターン鉗子を用いて脳神経を掻き出します。鉗子を耳蓋の先端に当て、反対側の手の親指で後半規管を押し下げて、包囲された蝸牛を脱落させます。側頭骨の下半分を、親指と人差し指で手動で、または10.5 cmの微細剪刀を用いて頭蓋骨から切り離し、固定のために電子顕微鏡グレードのメタノールフリー4%パラホルムアルデヒドに浸します。固定後、プロトコルの本文にある指示に従って側頭骨を脱灰します。サンプルが十分に脱灰されたかを確認するには、側頭骨をシリコンエラストマー塗装の解剖用ディッシュに置き、カタツムリ状の蝸牛をピンセットで軽く押さえます。組織が弾力のあるスポンジ状になっていれば、脱灰は完了しています。解剖皿にPBSを加え、実体顕微鏡下で、4番または5番のピンセットを用いて側頭骨の前庭領域を保持し、5 mLのVannas-Tubingenスプリング鋏で、側壁および頂点上の余分な耳 capsule 組織を切り除きます。2.5 mLのVannasスプリング鋏を用い、一方の刃を卵円窓に挿入し、基底回転のらせん靭帯に沿って数回小さく切り込みを入れます。次に、5 mLのVannas-Tubingenスプリング鋏の一方の刃を今切り込んだ領域に挿入し、もう一方の刃を側頭骨の外側、卵円窓の内側に配置します。この切断により、基底部回転を中部および頂部回転から分離します。次に、基底部回転の解剖を完了させるため、2.5 mLスプリング剪刀を用いて、モジオルス（軸蝸牛）に接続しているらせん神経節線維を切断し、基底部回転の緊張を緩和させます。基底部回転の下方を切断し、前庭器官から分離します。ピンセットを用いて組織を誘導し、らせん神経節線維をシリコンエラストマーコートディッシュに固定します。コルチ器の上部と下部の両側かららせん靭帯を除去するため、一連の小さな切開を加えます。らせん神経節線維をシリコンエラストマーコートディッシュに固定した状態で、ピンセットを用いてコルチ器から残っているライスネル膜を除去します。螺旋神経節軸索の厚みを減らすために、数回切開を行います。次に、螺旋神経節の残りの軸索をピンセットで掴み、解剖した基底回転を、約500 µLのPBSを含む48ウェルプレートに転写します。次に、蝸牛の残りの3分の2を頂端側を下にして置き、中間回転と頂端回転を分離します。次に、2.5 mLのハサミの片方の刃を、中回転が基底部回転と接続されていたscala mediaに挿入し、中回転の螺旋靱帯に沿って数回切り込みを入れます。5 mLのハサミを用い、中回転を刃の上に置いた状態で、片方の刃を切り込みを入れた領域に挿入します。もう一方の刃を、頂端側から90度の角度で骨迷路の外側に配置します。この切断により、中回転部と頂回転部が分離されます。次に、螺旋靭帯をコルチ器から取り除き、中回転部の解剖を完了させます。解剖した回転部を、前述と同様に48ウェルプレートに移します。次に、2.5 mmのVannasバネ鋏を用いて頂回転を覆っているキャップを開け、同様の手順を繰り返してコルチ器から頂回転のらせん靭帯を除去します。切り出した回転を、前と同様に48ウェルプレートに移します。免疫染色の手順を開始するには、まず各ウェルからPBSを吸引し、200～300 µLのブロッキング液に置き換えて、3Dローテーターを用いて室温で1時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、ブロッキング溶液を取り除き、キャリア溶液で適切に希釈した一次抗体 100 µL と置換します。3Dローテーターを用い、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を取り除き、室温で500 µLのPBSを用いて各ウェルを少なくとも5分間ずつ洗浄します。洗浄を2回繰り返します。最後の洗浄後、PBSを吸引しますが、その際、ピペットチップで解剖した部位を吸い込まないように注意してください。各ウェルに、キャリア溶液で希釈した蛍光標識二次抗体を100 µLずつ加えます。48ウェルプレートを遮光用の黒いボックスに入れ、3Dローテーターに設置して室温で2〜3時間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、前述と同様にPBSで3回洗浄します。最後の洗浄液を除去した後、核を染色するためにHoechstを100 µL添加します。遮光し、3Dローテーターを用いて室温で15〜20分間インキュベートします。最後に、Hoechst溶液を除去し、前述と同様にPBSで3回洗浄します。各スライドにラベルを貼った後、封入剤を50 µLずつ各スライドにピペッティングします。次に、4番または5番のストレート精密ピンセットを使用して、らせん神経節の軸索を掴み、48ウェルプレートからマウント液へ蝸牛の1回転分を慎重に移します。顕微鏡を用いて、切り出した回転部分が折れ曲がったりねじれたりしていないことを確認してください。カバーガラスの一端をスライドガラスの上に置き、ゆっくりと離してカバーガラスを自然に落とします。実体解剖顕微鏡を使用して、蝸牛の回転部が気泡の近くに位置していないことを確認します。気泡がある場合は、カバーガラスをゆっくりと前後に動かし、蝸牛の回転部の位置を調整してください。他の蝸牛の回転部についても同様の手順を繰り返します。イメージング中の光曝露および光退色を防ぐため、スライド1枚につき蝸牛1回転分を封入します。スライドをスライドフォルダに入れ、平らに置きます。遮光し、室温で一晩置いて封入剤を硬化させます。翌日、カバーガラスを透明なマニキュアで封印し、イメージングまで室温または20 °Cで保存します。この共焦点スライス画像は、p15マウスから単離した蝸牛の中回転を示しています。420倍の画像を重ね合わせることで、中回転全体を再構成しました。ウサギ抗myosin VIIa一次抗体とAlexa 647共役二次抗体で標識された有毛細胞はマゼンタ色に、ヤギ抗SOX2一次抗体とAlexa 568共役二次抗体で標識された支持細胞は緑色に染まっています。核はHoechst染色により青色に見えます。スケールバーは100 micronsを表しています。この画像は、6週齢のマウスから単離した中回転部のX, Z平面における光学断層像です。ここでも、有毛細胞はマゼンタ色の蛍光色素で、支持細胞は緑色に見える蛍光色素で標識されています。これは前回の画像を拡大し、十字線を削除したものです。スケールバーは20 micronsを示しています。続く4枚の画像は、全摘出解剖中または蝸牛の回転部分をスライドに封入する際に起こりうるいくつかの問題を示しています。ここでは、画像の左側において、外有毛細胞の最終列の隣で蝸牛組織が切断されており、その結果、これらの細胞の多くがさまざまな角度で固定されています。この画像では、左側のコルチ器の一部が切り取られています。また、画像中央の外有毛細胞領域に穴が開いています。ここでは、らせん器が数箇所で折りたたまれています。習得すれば、ホールマウント解剖の手技は20〜30分で完了できます。この操作を行う際は、ピンセットをらせん器に置かないこと、およびらせん靭帯を引っ張ったり掴んだりしないことが重要です。代わりに、鉗子を閉じ、らせん神経節繊維をシリコンエラストマーコーティング済みのディッシュにピンで固定します。1〜3週齢のマウスから採取したサンプルは、操作に余裕があり、解剖方法を習得するのに適しています。また、有毛細胞に損傷があるサンプルは解剖がより困難であり、特にノイズに曝露した組織は非常に扱いにくく脆弱です。この解剖手順の後、走査電子顕微鏡などの他の手法を行うことができます。ただし、その場合は異なる固定液が必要です。さらに、私たちはラットの蝸牛組織の解剖に向けてこのプロトコルにわずかな変更を加えており、将来的にはチンチラ、ジャービル、モルモットの蝸牛の解剖に向けてさらに改良したいと考えています。

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神経科学

免疫組織化学と共焦点顕微鏡に続くコルチ器官を、切片ビブラトームの簡単な手順が説明されています。この手順では、コルチ器の哺乳類器官の微細な細胞構築の改良保全を可能にし、その結果、細胞の種類を正確に定量することができます。...

ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

一次繊毛は、さまざまなシグナル伝達経路に影響を与えます。哺乳類の蝸牛は、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達を調べるのに理想的です。繊毛の機能障害は、蝸牛の成長、細胞パターン化、有毛細胞の配向、PCPの読み取りに影響を与えます。私たちの目標は、表現型解析、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡法を通じて、マウス蝸牛のPCPシグナル伝達を分析することです。...

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

このプロトコルの目的は、decellularize...

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。...

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。...

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、コルチの器官を含む人工内皮上皮を用いてex...

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

求心性シナプス構造および有毛細胞を免疫標識し、加齢組織における自己蛍光を消光し、蝸牛の長さを解剖および推定し、共焦点イメージングで得られた画像スタック中のシナプスを定量することによって、若年成人および加齢スナネズミ蝸牛を処理するためのプロトコールが提示される。...

若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数

ここでは、騒音性難聴(NIHL)のマウスモデルのプロトコルを提示します。NIHLを誘導するために、波形プラスチック、ラットトラップケージ、スピーカーを使用した新しいシンプルなデバイスを開発しました。聴覚脳幹反応と免疫蛍光イメージングを使用して、それぞれ聴覚機能と外有毛細胞の損傷を評価しました。...

マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価

蝸牛全体を画像化してデジタル化するために、ライトシート顕微鏡が開発されました。...

ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

脈管筋は内蝸牛電位の生成に不可欠です。ここでは、単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖を紹介します。...

単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖

このプロトコルは、マウス内耳組織の初心者ユーザーを対象としており、切片免疫染色のためのさまざまな発生段階でマウス内耳を処理する手順を包括的に詳しく説明しています。...

マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

学ぶ成体マウス蝸牛のホールマウント解剖法。コルティ器の三次元構造を保持し、免疫蛍光と共焦点顕微鏡で毛細胞と支持細胞を可視化する技術。聴覚研究と神経科学に応用可能です。

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

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