Name: SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから Lysinibacillusスフェリカス JG-B53 - 生体分子金属研究のためのツールとして、QCM-D、ICP-MSおよびAFM (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぼう、SLP1タンパク質と金ナノ粒子の相互作用をQCM-D、ICP-MS、AFMを用いて解析する方法。Lysinibacillus sphaericus JG-B53のS層タンパク質を用いた生体分子金属研究の手法を理解できます。

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本研究の一部はBMWiとBMBFプロジェクト」Aptasens」（BMBF / DLR 01RB0805A）が資金を提供し、IGF-プロジェクト「S-ふるい」（490 ZBG / 1）によって資金を供給されました。英語のネイティブスピーカーとして原稿を読み取るためのAFM研究中およびエリックV.ジョンストンへの彼の貴重な助けのためのトビアス・J・ギュンターに感謝します。さらに、この論文の著者は、Manjaフォーゲル、ナンシーアンガー、カレンE. Viacavaとヘルムホルツ研究所のグループバイオテクノロジー（ICP-MS測定における支援のためのリソースエコロジー研究所から）アリーンリッターとサブリナGurlitに感謝したいと思います資源技術のためのフライベルク。

著者らは、開示することは何もありません。

この研究では、異なる分析方法の組み合わせを用いて調べたS層タンパク質の金の結合を研究しました。具体的には、金の結合は、例えば 、感覚面鉱業水またはプロセス溶液から金を回収するだけでなく、材料の建設のためだけでなく、非常に魅力的です。 Auの相互作用の研究のために金（Au（III）及びAu（0）-NPs）に懸濁し、SLP1の単層を再結晶化して、タンパク質が持っていたが単離されます。したがって、本研究では、グラム陽性菌株L.の成功した培養を示していますスフェリカス JG-B53と表層タンパク質SLP1の分離。それにもかかわらず、栽培やタンパク質の分離が困難なままであり、最適化されなければなりません。バイオマスとS層タンパク質の大規模生産は、金属選択フィルタ材料の製造のために、例えば 、両方の工業的応用のための前提条件です。その応用の可能性があるundoubtedl有毒金属の除去または処理水に溶解させた有価金属の回収、排水、または排水のための高Y。さらに、S-層の適用可能性は、このようなバイオセンサーおよび触媒として他の生体触発材料、での追加の可能性を考慮しても大きくなっ...

原因エレクトロニクス、触媒、バイオセンサ、または医療機器のようないくつかのアプリケーションのための金の使用の増加に、この貴金属の需要はここ数年の時間6-9かけて成長してきました。重鎖または貴金属、最も環境汚染は継続的なプロセスであるが、金だけでなく、他の多くの貴重な重金属は、鉱業活動を通じて、希薄濃度の工業排水を経て環境中に放出され、廃棄物処理7,8,10されています主に技術的な活動によって引き起こされます。これは、自然の生態系の重要な干渉につながり、潜在的に人間の健康9を脅かします。これらの負の結果を知ることは、工業廃水からの金属のリサイクルに汚染された生態系や改善点から金属を除去するための新しい技術の探索を推進しています。沈殿又はイオン交換のような十分に確立された物理化学的方法には、特に高で、それほど効果的ではありませんLYは、溶液7,8,11に希釈しました。バイオソープションは、いずれかの生きているか死んバイオマスで、廃水処理10,12のための魅力的な代替です。そのような生物学的材料の使用は、毒性化学物質の消費量を低減することができます。多くの微生物は、蓄積又は金属を固定するために記載されています。例えば、Lysinibacillusのスフェリカスの細胞が（L.スファエリカス ）JG-A12は、貴金属のための高い結合能力を示している、例えば、パラジウム（II）、白金（II）、金（III）、及びPbのような他の有毒金属（II）またはU（VI）4,13、クロム（VI）14のためのバチルス・メガテリウムの細胞、金のために白金（II）およびPd（II）15、及びクロレラ下品ためのサッカロマイセス・セレビシエの細胞（III）とU（VI）16 、17。金（III）、パラジウム（II）、およびPt（II）のような前の金属の結合はまた、 デスルホビブリオ18およびL.ためのdesulfuricansについて報告されていますスフェリカス JG-B53 19,20。それにもかかわらず、ではないアルリットルの微生物は、金属を大量に結合して、収着材料としての用途は限ら12,21です。また、容量の金属結合は、異なるパラメータ、 例えば、細胞組成物、使用されるバイオコンポーネント、または環境や実験条件（pH、イオン強度、温度など）に依存します。単離された細胞壁断片22,23の研究は、膜脂質、ペプチドグリカン、タンパク質、または他の構成要素と同様に、複雑な構築全細胞8,21のプロセスを結合金属を理解するのに役立ちます。 この研究に着目セル構成要素は、S層タンパク質です。 S層タンパク質は、多くの細菌及び古細菌の外側細胞エンベロープの一部であり、それらは、約15を構成する - これらの生物の全タンパク質質量の20％。環境への最初のインターフェイスとして、これらの細胞の化合物は、強く、細菌の吸着特性3に影響を与えます 。 40の範囲の分子量を有するS層タンパク質kDaでの数百の細胞内で生産され、それらは脂質膜または高分子の細胞壁成分に層を形成することができる場合に外部組み立てられます。一旦単離されると、ほぼ全てのS層タンパク質は自発的に界面で、または平面または管状の構造体3を形成する面に、懸濁液中で自己集合する固有の特性を有しています。タンパク質の単分子層の厚さは、細菌に依存し5の範囲内である- 25nmで24。一般に、形成されたS層タンパク質の構造は、35ナノメートル3,24に対して斜め（P1またはP2）、正方形（P4）、または六角形（P3またはP6）2.5の格子定数との対称性を有することができます。格子形成は、二価の陽イオンに依存して、主のCa 2+ 25,26、ラフ、Jらに多くのケースであるように思われます。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016（提出））。それにもかかわらず、特に例えば、Ca 2+およびMg 2+などの二価カチオンのモノマーの折り畳み、モノマー-モノマー相互作用、格子を形成し、異なる金属の役割の完全な反応カスケードは、まだ完全には理解されていません。 グラム陽性菌株L. 27（新系統発生的分類した後、バチルス・スファエリカスから改称） スフェリカス JG-B53はウラン鉱山廃棄物の山「ハーバーランド」（Johanngeorgenstadt、ザクセン、ドイツ）4,28,29から単離しました。その機能S層タンパク質（SLP1）は正方格子、116 kDaで30の分子量、および細菌細胞31生きに ​​≈10nmの厚さを有しています。以前の研究では、約10nmの厚さで閉じ、安定したタンパク質層のインビトロでの形成は10分未満19で達成されました。関連菌株L.スフェリカス JG-A12は、また「ハーバーランド &quot;パイルからの分離株は、高い金属結合能力を有し、その単離されたS層タンパク質は、Auのような貴金属のための高い化学的および機械的安定性と優れた吸着率を示した（III）、白金（II）、およびPd（II）4,32,33。貴金属のこの結合は、いくつかの金属について多かれ少なかれ特異的であり、ポリマーの外側及び内側タンパク質表面上及び細孔内の官能基、イオン強度、およびpH値の利用可能性に依存します。 、OH - 、PO 4 - - 、SO 4 - 、およびSO-タンパク質による金属相互作用に関連する官能基は、COOH-、NH 2です。原理的には、金属結合能力は、アプリケーション、 ラフ、Jらの広いスペクトルを開きます。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。 例えば、除去又は回復のためbiosorptiveコンポーネントとして溶解毒性または有価金属の、合成または触媒反応、およびバイオ感覚層3,5,18,33のような他の生体工学材料のため、定期的に構造化金属ナノ粒子（NPS）の定義された堆積のためのテンプレート。 Auのような規則的に配置されたNPアレイ（0）-NPsはCO酸化34-37ための分子エレクトロニクスやバイオセンサー、超高密度記憶装置、および触媒に至るまでの主要な用途のために使用することができます。このようなアプリケーションや、これらの材料のスマートなデザインの開発は、基礎となる金属結合メカニズムのより深い理解を必要とします。 このようなバイオベース材料の開発のための前提条件は、生体分子と技術面38,39との間の界面層の信頼できる実装です。例えば、高分子電解質は、S層タンパク質39の再結晶化のための界面層として使用されているレイヤー・バイ・レイヤー（のLbL）技術40,41に組み付け</SUP&gt;。このようなインタフェースは、再現可能かつ定量的な方法でタンパク質コーティングを実行するための比較的簡単な方法を提供しています。接着剤プロモーターと変更することなく、種々の実験を行うことで、コーティング速度、層の安定性、および生体分子19,42、ラフ、J.らと金属との相互作用に関する記述することが可能です。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。しかし、タンパク質吸着およびタンパク質 - 表面相互作用の複雑なメカニズムは完全に理解されていません。特に立体構造、パターンの向き、コーティング密度の情報がまだ不足しています。 消費モニタリング（QCM-D）技術で水晶マイクロバランスは、タンパク質吸着、コーティング速度を研究するためのツール、および対話プロとして近年注目を集めていますナノメートルスケール19,43-45上セス。この技術は、リアルタイムで大量の吸着の詳細な検出を可能にし、タンパク質格子19,20,42,46-48に機能性分子のタンパク質自己集合プロセスと結合するための指標として用いることができます。また、QCM-Dの測定は、天然の生物学的条件下でのタンパク質性の層と金属の相互作用の過程を研究する可能性を開きます。最近の研究において、Euのような選択された金属とS層タンパク質の相互作用（III）、金（III）、パラジウム（II）、およびPtは（II）QCM-D 19,20で検討されています。吸着したタンパク質層は、グラム陽性細菌の細胞壁の単純化モデルとしての役割を果たすことができます。この単一の成分の研究では、金属相互作用のより深い理解に寄与することができます。しかし、単にQCM-D実験は、タンパク質に金属の表面構造と影響に関する記述を許可していません。他の技術は、そのような情報を得るために必要です。 One POSイメージングバイオナノ構造のための任及び構造特性情報を取得するには、原子間力顕微鏡（AFM）です。 提示研究の目的は、特にL. SLP1に、S層タンパク質に金（Au（III）とAu（0）-NPs）の収着を調査することでしたスフェリカス JG-B53。 ICP-MSを使用して5.0とQCM-Dを使用して固定化されたS-層と - 実験は、2.0のpH範囲内のバッチスケールで懸濁タンパク質を用いて行きました。さらに、格子の安定性に対する金属塩溶液の影響は、その後のAFM研究で調査しました。これらの技術の組み合わせは、特定の金属親和性について細菌細胞全体のイベントを結合についての詳細を学ぶためのツールとして、in vitroでの金属相互作用プロセスのより良い理解に貢献しています。この知識だけでなく、環境保護のための金属の回収のために適用可能なフィルター材料の開発と再の保全のために重要です49だけでなく、様々な技術的なアプリケーションのための高度に秩序化された金属NPのアレイの開発のためのソース。

<table><tbody><tr><td>equiment and software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System</td><td>Applikon Biotechnology, Netherlands</td><td>Z6X</td><td>dO2, Applikon BiotechnologyのpHセンサーとBioXpertソフトウェア V2</td></tr><tr><td>非侵襲的バイオマスモニター BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>SpectrometerUltrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain</td><td>80-2109-10</td><td>Company now GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar micro centrifuge</td><td>VWR, Germany</td><td>521-2844</td><td>For centrifugation of cultivivation</td></tr> samples <tr><td>研究システム顕微鏡 BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Germany</td><td>037006</td><td>イメージングソフトウェアと組み合わせた顕微鏡</td></tr><tr><td>Cell^P (version 3.1)</td><td>オリンパスソフトイメージングソリューションズLLC、M&uuml;nster, Germany</td><td>---</td><td>with microscope</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, USA</td><td>9010PLT</td><td>バイオマス収穫用</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Germany</td><td>431-2601</td><td>べん毛の除去とサンプル均質化用</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>728411</td><td>タンパク質の分離に使用</td></tr><tr><td>移動式高せん断流体プロセッサ、M-110EH-30 パイロット</td><td>マイクロ流体工学、マサチューセッツ州、米国</td><td>M110EH30K</td><td>細胞破裂に使用</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC 凍結乾燥機</td><td>Martin Christ 凍結乾燥機LLC、オステロード、ドイツ</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>UV-VIS 分光光度法 (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>タンパク質の測定用濃度</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 縦型電気泳動チャンバー</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany</td><td>165-3322</td><td>For SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany</td><td>1708030</td><td>SDS-PAGEゲルのイメージングに使用</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), USA</td><td>N8120536</td><td>金属濃度</td></tr><tr><td>の測定に使用Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom</td><td>ZEN3600</td><td>ナノ粒子径測定用</td></tr><tr><td>Q-Sense E4デバイス&nbsp;</td><td>Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン</td><td>QS-E4</td><td>LOT quantum design で注文 (E4 プラットフォームに付属するソフトウェア)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (データ記録)</td><td>Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (データ評価とモデリング)</td><td>Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D フローモジュール QFM&nbsp;401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン</td><td>QS-QFM401</td><td>LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp;303 SiO2圧電ATカットクォーツセンサー</td><td>Q-Sense AB、ヨーテボリ、スウェーデン</td><td>QS-QSX303</td><td>LOT量子設計で注文</td></tr><tr><td>オゾン洗浄室</td><td>Bioforce Nanoscience、エイムズ(IA)、米国</td><td>QS-ESA006</td><td>LOTで注文 量子設計</td></tr><tr><td>原子間力顕微鏡 MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research、サンタバーバラ(CA)、米国</td><td>MFP-3DBio</td><td>AFM測定およびイメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td></td>---<td>イメージングソフトウェアがCatに含まれています。いいえ。MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 Software</td><td>WaveMetrics, Inc., USA---</td><td></td><td>イメージングソフト Cat.いいえ。MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Bioheater</td><td>AFM測定用サンプルヒーター</td></tr><tr><td>Biolever mini cantilever,&nbsp;BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Germany LLC, ドイツ</td><td>&nbsp;BL-AC40TS-C2</td><td>AFM測定用カンチレバー</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L. , Spain</td><td>フリーウェア</td><td>AFM解析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>洗剤およびその他の機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸性酸、100%、p.A.</td><td>カールロスGmbH + CO。KG</td><td>3738.5</td><td>危険、可燃性、腐食性の液体および蒸気。重度の皮膚や目の損傷を引き起こします。</td></tr><tr><td>消泡剤 204</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A6426</td><td>泡沫抑制用</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー、ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>クーマシーブリリアントブルーR (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>3862.1</td><td></td></tr><tr><td>---デオキシリボヌクレアーゼII 豚脾臓由来</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>D4138</td><td>Typ IV , 2,000 - 6,000 &nbsp;クニッツ単位/ mgタンパク質</td></tr><tr><td>エタノール、95%</td><td>VWR、ドイツ</td><td>20827.467</td><td>危険、可燃性</td></tr><tr><td>グリセリン、PA</td><td>カールロスGmbH + CO。KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩(GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH + CO。KG</td><td>0037.1</td><td></td></tr><tr><td>---Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>塩酸 (HCl) (37%)</td> <td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>4625.2</td><td>危険;腐食性、</td></tr><tr><td>鶏卵白のpH調整リゾチーム</td>に使用されます <td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>凍結乾燥粉末、タンパク質= 90%= 40,000単位/ mgタンパク質(シグマ)&nbsp;</td></tr><tr><td>加熱式マグネチックスターラー&nbsp;MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany</td><td>504.10100.00</td><td>実験中の標準攪拌機</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>硝酸 (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>HN50.1</td><td>危険;酸化性、腐食性</td></tr><tr><td>PageRuler 未染色タンパク質ラダー</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>ポリ(ナトリウム 4-スチレンスルホンナット) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>243051</td><td>平均 MW ~70,000</td></tr><tr><td>ポリエチレン (PEI)、分岐</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>警告;有害、刺激性、環境に危険;平均 MW ~25,000</td></tr><tr><td>無水炭酸カリウム (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>警告;</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来の有害なリボヌクレアーゼA&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ(株)</td><td>R5503</td><td>I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein&nbsp;</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>危険; 非常に有毒で環境に危険</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>L-5750</td><td>危険性;有毒</td></tr>な<tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>6771.1</td><td>危険;腐食性、栽培およびpH調整内のpH調節に使用</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000&nbsp;</td><td>カールロスGmbH + CO。KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>硫酸(H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH + CO.KG</td><td>HN52.2</td><td>危険;腐食性、栽培中のpH調節に使用される</td></tr><tr><td>タンニン酸(C 76H / 52O 46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC。</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>9090.2</td><td></td></tr><tr><td>---Triton X-100</td>カール<td>ロスGmbH + CO。KG</td><td>3051.3</td><td>警告;有害、環境に危険</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500、50,000 MWCO 限外ろ過チューブ</td><td>ザルトリウス AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>危険、有毒</td></tr></tbody></table>

slp1ポリマーと単層のauのインタラクションから<em&gt; lysinibacillusスフェリカス</em&gt; jg-b53 - 生体分子金属研究のためのツールと​​して、qcm-d、icp-msおよびafm

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

この出版物では、Lysinibacillus sphaericus JG-B53の表層(S層)タンパク質(Slp1)の金吸着挙動が記載されています。これらの生体分子は、表面上に常結晶性2次元配列に配置され、金属を結合するため、環境や工業プロセスからさまざまな元素を除去または回収するための生体吸着材料など、いくつかの生物工学的用途にとって興味深いものです。S層指向合成1またはナノ粒子の吸着のいずれかによって、S層上にAu(0)ナノ粒子を堆積させることは、多様な官能的応用のための新たな可能性を開きます。S層2-5の生体吸着特性については数多くの研究が述べられていますが、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-金属相互作用をより深く理解することは依然として困難です。以下の研究では、誘導結合質量分析(ICP-MS)を使用して、懸濁S層による金属吸着を検出しました。これは、たんぱく質単分子膜の形成と金属沈着のオンライン検出を可能にする散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)の測定と相関しており、したがって、金属結合に関するより詳細な理解が可能になりました。
ICP-MSの結果は、懸濁したS層ポリマーへのAu(III)の結合がpHに依存することを示しました。Au(III)の最大結合はpH 4.0で得られました。QCM-Dの調査により、in situ実験中にAu(III)の収着とAu(0)-NPの沈着をリアルタイムで検出することができました。さらに、この方法により、Slp1のタンパク質格子安定性に対する金属結合の影響を研究することができ、構造特性とタンパク質層の安定性は、原子間力顕微鏡(AFM)を使用してQCM-D実験の直後に視覚化することができました。結論として、これらの異なる方法を組み合わせることで、懸濁液中の細菌S層タンパク質、または細菌細胞または再結晶表面上の単層としての細菌S層タンパク質による金属結合についてより深い理解が得られます。

微生物およびSLP1キャラの育成 細菌増殖の記録されたデータは、約5時間で指数増殖期の終わりを示します。以前の研究は、それにもかかわらず、定義されたメディアコンポーネントを使用して、培養の最適化またはfed-。最大収率19 4.36グラム/ L（SLP1は収穫のこの時点から単離することができることを湿潤バイオマス（≈1.45グラム/ L（BDW））を示していますバッチ培養戦略これは産業用アプリケーションのためのバイオマスの大量の使用を不可分である。高いバイオマス収量につながる。 オンラインとオフラインの記録栽培パラメータは、図3（a）に要約されてからの値。顕微鏡制御（ 図3B）時L.スフェリカス JG-B53の収穫ショー非胞子形成細胞の。 <p class="jove...

水系からの金の収着とリサイクルに関する基本的な情報を得るために、S層タンパク質上のAu(III)とAu(0)ナノ粒子の相互作用を調査しました。タンパク質ポリマーの吸着はICP-MSで、タンパク質性単分子膜の吸着はQCM-Dで調べました。その後のAFMにより、ナノ構造のイメージングが可能になります。

SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから<em&gt; Lysinibacillusスフェリカス</em&gt; JG-B53 - 生体分子金属研究のためのツールと​​して、QCM-D、ICP-MSおよびAFM

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

この実験の全般的な目的は、提示された細菌株のS層タンパク質による金吸着挙動を、生態学的および技術的な観点から調査することです。これらの手法は、吸着プロセスや金属の除去および回収といった、環境科学に関連する分野における重要な疑問に答えることができます。これらの技術の主な利点は、金属の吸着とナノ粒子の吸着を異なるスケール範囲で検出できることです。QCM-Dを用いることで、これをリアルタイム測定で検出することが可能です。この手順を開始するには、流路セルにセンサーダミーを装着します。超純水で希釈した2%アルカリ性液体洗浄剤を、QCM-Dおよびチューブシステムに1モジュールあたり少なくとも20 millilitersポンプで注入します。次に、製造元のプロトコルに従い、モジュールあたり5倍量の超純水を、最大 300 microliters per minute の流速でシステム内にポンプ注入します。フローモジュールの外にある二酸化ケイ素センサーを、2% sodium dodecyl sulfate 溶液中で少なくとも 20 分間インキュベートして洗浄します。その後、センサーを超純水で数回すすぎます。ろ過された圧縮空気で結晶を乾燥させた後、オゾン洗浄室に20分間置きます。その後、洗浄手順を2回繰り返し、すべての有機物を除去します。センサー表面から結合した金属を除去するため、1 M 硝酸でセンサーを洗浄します。次に、センサーを超純水で数回すすぎます。続いて、layer by layer（LBL）法を用いたディップコーティングにより、3 g/Lのポリエチレンイミンとポリスチレンスルホネートの交互層でセンサーを修飾します。ディープウェルプレートに入れた適切なポリ電解質溶液にセンサーを浸し、室温で10分間インキュベートします。次に、センサーを電解質溶液から取り出し、ディップコーティングの各工程の間に超純水で十分に洗浄します。外部修飾が完了したら、センサーをフローモジュール内に設置します。実験を開始する前に、超純水で洗浄してセンサーを平衡化させてください。この時点で、ポリマーをモノマーに変換するため、あらかじめ単離・精製したSlp1を尿素溶液に溶解させます。モノマー化したタンパク質を15,000 ×g、4 °Cで1時間遠心分離し、大きなタンパク質凝集物を取り除きます。可溶化および遠心分離後のSlp1上清を、最終タンパク質濃度が0.2 g/Lとなるように再結晶化バッファーと混合します。フローモジュール内のポリエレクトロライト修飾センサー上でタンパク質の再結晶化が成功した後、周波数シフトおよび散逸シフトの値が安定するまで、再結晶化バッファーを用いて125 µL/minの流速でコーティング済みセンサーを十分に洗浄します。フローモジュール内でのSlp1コーティングが成功した後、得られたSlp1層を、周波数シフトおよび散逸シフトの値が安定するまで1.6 mM クエン酸バッファー（pH 5.0）で十分に洗浄します。次に、あらかじめ調製した1 mM ナノ粒子溶液を、125 µL/minの流速でフローモジュールに注入します。次に、Slp1層への質量吸着を追跡します。金属ナノ粒子の相互作用が完了した後、弱く結合した金属やナノ粒子を除去するために、ナノ粒子を含まないバッファーで層を洗浄します。倒立光学顕微鏡を備えた原子間力顕微鏡（AFM）を用い、超純水中でコーティングされたQCM-Dセンサー上の画像を直接記録します。QCM-D実験後、センサーを超純水で洗浄し、AFMフルイドセル内に設置します。水中での共振周波数が約25 kilohertzで、ばね定数が0.1 newton per meter未満のカンチレバーを使用してください。走査速度を2.5から10 micrometers per secondの間で調整します。カンチレバーをピエゾで共振周波数に励起させながら、ダイナミックコンタクトモードで画像を取得します。最後に、振動の減衰によってカンチレバーから表面までの距離を決定します。金表面に固定したSlp1の最大金属結合容量から、調査したpH範囲内の24時間のインキュベーション期間中、Slp1が安定して結合していたことが示されました。周波数の即時的な減少は、タンパク質がポリ電解質修飾表面に急速に吸着し、高い親和性を持つことを示しています。また、消散係数（ディシペーション）も即座に増加しており、これは粘弾性分子が表面に吸着したことで急速な減衰が起こり、消散値が上昇したことを示しています。あらかじめ合成した金ナノ粒子をSlp1とともにインキュベートし、SDS-PAGEで解析したところ、ナノ粒子がSlp1の構造を乱さないことが確認され、QCM-Dのデータが裏付けられました。あらかじめ合成された金ナノ粒子の吸着について、QCM-D実験におけるdelta F-delta Dプロット、および厚さと質量のプロファイルとして示します。ここでは、ポリ電解質で修飾されたセンサー上に再結晶化したSlp1のタンパク質格子を示しています。格子定数は13〜14 nmであり、層の厚さは10 ± 2 nmであることがわかりました。AFM解析により、金③の相互作用後もSlp1格子が完全に無傷であることが確認され、コーティングの安定性を予測したQCM-Dの結果が裏付けられました。AFMでは、Slp1格子への金⓪ナノ粒子の吸着が確認されましたが、粒子サイズのため、Slp1のp4対称性には従いません。この手法を習得すれば、適切に実施することで1営業日以内に完了させることができます。これらの手法に続き、赤外分光法やヘリウムイオン顕微鏡などの他の技術を用いることで、特定の結合部位や、金または金ナノ粒子との相互作用といったさらなる疑問を解消することが可能です。本手法は、生体分子と金属との相互作用や、例えば異なる種類の表面における吸着および脱離挙動を研究するための道を開きました。このビデオを視聴したことで、金属と生物学的溶媒との相互作用を調査する方法について十分に理解できたはずです。なお、本手法を使用する際は、保護メガネ、白衣、そしてもちろん手袋を着用することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

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サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

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動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

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学ぼう、SLP1タンパク質と金ナノ粒子の相互作用をQCM-D、ICP-MS、AFMを用いて解析する方法。Lysinibacillus sphaericus JG-B53のS層タンパク質を用いた生体分子金属研究の手法を理解できます。

SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから

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