Name: 等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、インビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶ等電点脳状態誘導法による神経細胞の内因的性質の測定。シナプス入力なしでの単一ニューロンの応答性をin vivoで評価し、ネットワーク活動の影響を排除した神経生理学研究に貢献します。

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この作品は、財団・ド・フランス、研究所国立・デ・ラ・サンテエ・デ・ラ・RECHERCHEMédicale、ピエール＆マリー・キュリー大学とプログラムのINVESTISSEMENTSドールアベニール「ANR-10-IAIHU-06からの助成金によってサポートされていました。

すべての手順は、欧州連合（指令63分の2010 / EU）のガイドラインに沿って行われ、動物実験でのチャールズ・ダーウィン倫理委員会によって承認されました。我々は、しかし、ほとんどの手順は、すべての人の特定のニーズにマッチするように適合させることができ、ここで私たちは日常的に我々の研究室で使用する手順について説明します。 1.外科の準備注：すべての切開と圧力点を繰り返し局所麻酔薬（リドカインまたはブピバカイン）で浸透されるべきです。無菌製剤は、いくつかの修正が実施されるべき必要とされる場合、本手順は、端末です。 <ol><li>腹腔内（IP）注射を分離ローカル二つにペントバルビタールナトリウム（40mg / kg）およびケタミン（50mg / kg）でラットを麻酔。 </li><li>動物は全身麻酔下に行くと繰り返し麻酔の外科的平面が（つま先ピンチへの反応）が達成されていないことを確認してみましょう。 FEにラットを置きますedback加熱ブランケットとは、37°C​​の周囲のコア温度を維持するために、直腸プローブを挿入します。 </li><li>麻酔薬のその後の注入を容易にし、繰り返し針穿刺30で臓器を穿孔回避するために、腹腔内にカテーテルを配置します。 <ol><li>胃の右下または左象限内に位置する領域の上の領域 - 小（3ミリメートル〜2）の上に髪をクリップ。 注：脱毛クリームを使用することもできます。 </li><li>鋭いハサミやメスで皮膚上の3ミリメートル切開 - 2を行います。腹膜腔が観察されるまで鈍的切開を使用して、脂肪と筋肉層を除去。 </li><li>キャビティ内の小さなカテーテル2センチ、手術用接着剤で傷口を閉じます - 約1を挿入します。 注意：直径およびカテーテルの長さの合計が最小であるべきである（。 例えば 、2フランス語-内径0.043ミリメートルに相当）デッドボリュームを減らすために。ポリウレタンチューブが最も適しています。 </li><li>ループおよび縫合糸トンを作ります彼は、所定の位置に固定するために皮膚にカテーテル。 </li></ol></li><li>人工呼吸時の換気を制御するために気管チューブを取り付けます。 <ol><li>前のステップについては、関心領域の準備（1 - 右胸骨柄上記気管の上を2cm）、髪を除去し、皮膚を切開。 </li><li>脇唾液腺を移動し、静かに筋肉の最後の層を解剖することにより気管を露出させた後、脂肪と筋肉の最初の層を分析鈍いです。 </li><li>慎重に気管を介して組織を除去し、小さな鉗子を使用して、その下のスレッドをスライドさせます。スレッドと外科医の結び目を作るが、まだタイトません。 </li><li> 2軟骨環の間の気管の横方向を切開。気管内スワブの血液があれば。 </li><li>適切な直径の気管チューブを挿入し、安定したチューブを固定するために、スレッドの結び目を締めます。さらなる安定性のために、スレッドは、さらに、気管内チューブのより高い点で取り付けることができます。 </li><li> Sutur電子傷近いかは、外科用ステープルを使用しています。気管チューブを再利用することを意図している場合は、ここで手術用接着剤を避けてください。 </li></ol></li><li>定位フレームに動物をインストールして、慎重に次の生理的変数の監視：ECOG、のSpO 2、のEtCO 2、および内部温度（心電図、心電図を介して）心拍数を。麻酔や生理状態の適切な深さを保つためにこれらの変数を監視し、調整します。具体的には、ペントバルビタールナトリウムの小さい用量（10mg / kgの）必要に応じて麻酔を補います。 </li><li>乾燥を避けるために、両眼に眼軟膏を適用します。縦切開（約2センチ）作り、頭皮の上に髪をクリップし、メスまたはキューレットを使用して頭蓋骨を覆う結合組織を切除。 </li><li>歯科用ドリルで関心のある領域上に小さい（〜1.5ミリメートルの直径）開頭を行います。 注：ここでは、一次体性感覚野のバレルフィールドは（7対象としている - 耳線へ8ミリメートルの前方を、4.5-正中線31に対して横5.5ミリメートル）。熱を放散するために繰り返し洗浄します。 </li><li>優しく硬膜に小さな穴を作るために極細のピンセットを使用してください。 ECOG電極を配置する頭蓋穿孔内〜0.5ミリメートルの領域を確保（次のステップを参照）。永久に0.9％NaCl溶液（または人工脳脊髄液）との湿った皮質を保ちます。 </li><li>髄膜で覆われていない皮質領域を避け、硬膜上に低インピーダンス（〜60kΩの）銀電極（ECOG電極）を配置し、ヘッドの反対側の頭皮の筋肉に基準電極を配置します。 </li><li>この段階（最後のペントバルビタールナトリウム注射後30分）では、IPカテーテルを介してペントバルビタールナトリウム（10〜15ミリグラム/ kg /時）またはフェンタニル（3-6μgの/ kg /時）の反復注射によって麻酔を維持します。後者は非同期化、覚醒のような、皮質のプロファイルになります前者は遅い振動、睡眠のような、ECOGパターンになります。 </li><li>人工Vを調整します呼吸頻度および量は、ラットの自発呼吸（ - 115呼吸/分で32正常範囲70）と同様になるようentilationシステム。その後、気管チューブに機械的な換気を接続し、（両側の）適切な胸郭のインフレを確認します。そうでない場合、気管軸換気チューブの位置を調整します。必要に応じて、注射器または真空ポンプに接続されたカテーテルを用いて気管内に存在する分泌を吸います。 </li><li>全ての生理学的変数32-35とECOG 29,36のパターンが麻酔の安定した外科手術面を反映している場合、最初の注射のために、ラット、40mgの/キロを麻痺させる各脚にガラミンのtriethiodideの筋肉内注射を行い、その後は20mg / kgの、すべての2時間19,29,36,50。 </li></ol> 2.細胞内記録<ol><li> 〜0.2μmの先端を有するガラスマイクロピペット（シャープ微小電極を）引きなどの抵抗がbetwee範囲nは50と80MΩはかつて2​​ M酢酸カリウム（KAC）を充填しました。 </li><li> （ヘッドステージを介して）細胞内のアンプにピペット溶液を接続するには銀/塩化銀（銀/塩化銀）のワイヤを使用して特定のホルダーにピペットを置きます。ホルダーは、マイクロマニピュレータに接続する必要があります。ラットの首の筋肉にAg / AgCl参照電極を配置します。 </li><li>ゆっくりと関心領域まで脳内にピペットを挿入し、現在の段階に応じて電圧降下を監視することにより、その抵抗を確認。必要に応じてピペットをクリアする話題（またはザップ）アンプのボタンを使用します。 </li><li>脳の動きを低減するためにシリコーンエラストマーまたは4％アガロースでそれをカバーする前に（ECOGまたは細胞内の電極に触れないように注意してください）​​開頭術を乾燥させるために綿棒または合成吸収三角形を使用してください。 </li><li>セルに近づいたときに、その抵抗値が増加するまで、2ミクロンのステップ - 1でピペットを下げます。その後penetraにアンプの話題機能を使用ニューロンにTE。 </li></ol> 3.等電点電気泳動の状態を誘導します<ol><li>同時に、ニューロンの膜電位、ECOGおよび生理学的変数を監視しながら、この段階で（細胞内電流、電流-電圧の関係、感覚刺激応答を注入するための応答を発射など 、）適切な実験プロトコルを実行します。 </li><li>細胞内の電極は、記録セッション中膜電位と活動電位特性の両方の安定を分析することによって、細胞内で安定していることを確認してください。ない場合は、次のステップに進み、記録が安定するまで再び待つか、別のニューロンを検索しません。 </li><li>ペントバルビタールナトリウムの高いが赤外線致死量を注入IP回線を経由して（〜/ kgを90 mgのは、ペントバルビタール初期状態から35ミリグラム/キログラムなどとフェンタニル初期状態から155ミリグラム/キログラムまでと低くすることができます）。 注：15内 - 20分、細胞内およびECOG WAveformsは一過次第に完全な等電状態に崩壊するいわゆる「バースト抑制を「プロファイル37,38を 、到達するために断続的に電気無音でスローダウンする必要があります。しかしなSpO 2とのEtCO 2が比較的安定とどまるべきである-心拍数が大幅に（20％〜10で）遅くなることが期待されます。 </li><li>等電状態に達していない場合は、ペントバルビタールナトリウム（ステップ3.1投与量の約10％）の少量を注入。等電点電気泳動状態がまだ達成されていない場合はより多くの麻酔薬を追加する前に、15分待ってください。 </li><li>記録されたニューロンの統合的特性にネットワークダイナミクスの影響を比較するための実験プロトコルを繰り返します。 注：麻酔注射を中止した後、電気的な脳活動が完全に3〜4時間以内に回復する必要があります。 </li><li>実験の最後に、ペントバルビタールナトリウムの致死量を注入する（200ミリグラム/ kgのIP）にラットを安楽死させます。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、ネットワークと細胞レベルの両方で生体内自発的な脳の電気的活動に抑制するための新しい方法を説明します。この手順は、等電昏睡41として知られている極端な脳の状態をもたらします。臨床的観点からは、そのようなelectrocerebral非アクティブは、EEG上で見ることができる最も深刻な異常です。これは、主にどちらか死んまたは遷延性植物状態42に連続するすべての患者で、不可逆的昏睡に関連付けられていますが、（例えば、チオペンタールなど）は、中枢神経系抑制薬との中毒によって引き起こされたときに少なくとも部分的に、偶発性低体温を逆にすることができます42または仮死心停止43。我々の実験パラダイムでは、等電状態は徐々に最初急速ECOGの周波数成分の減少を誘導し、高用量でのペントバルビタールナトリウムの全身注射、「バーストサプレッション」モードによって達成されます。41,42、完全に平らECOGに最終的にリードします。細胞内レベルでは、自発的な活動の消失は、脱分極および過分極膜電位変動の同時減少と...

任意の環境刺激または行動作業の非存在下では、脳は、脳波（EEG）波として、頭皮の記録可能な電気活動の連続的なストリームを生成する「休止」。この内因性の脳活動の細胞内相関は、求心性のネットワーク1,2の継続的な活動を反映し、興奮性と抑制性シナプス電位の組み合わせで構成されている（また、「シナプスノイズ」として知られている）背景膜電圧の変動によって特徴付けられます。この自発的な活動は、警戒の異なる状態で周波数と振幅で変化します。単一ニューロンの興奮性と応答性にネットワーク活動の影響を解明することは神経科学3,4の主要な課題の一つです。 多くの実験と計算の研究では、統合propertie上の継続的なシナプス活性の機能的影響を検討していますニューロンの秒。しかし、背景シナプスノイズの影響を受け、異なる神経細胞のパラメータの役割は、とらえどころのないままになります。例えば、膜の脱分極の平均レベルは、正に5,6または負7-9活動電位を誘発する感覚入力の能力と相関が見出されました。また、いくつかの調査は他の人がいることを示し、求心性シナプス入力の連続的に変化する流れに起因する膜電位の変動は、強くその入出力関係3,10-13のゲインを調節することによって、単一ニューロンの応答性に影響を与えることを示唆しているのに対し、阻害シャントによって媒介される膜入力コンダクタンスの変化にかかわらず、膜変動14,15の大きさのニューロンの利得を調節するのに十分です。最後に、目を覚まし動物で行われた最近の研究では、単一ニューロンにおける感覚情報の処理が非常に警戒aの状態に依存してどのように強調しましたndは現在の行動の需要16,17。 高度に相互接続システム内の指定されたプロセスの機能的役割を解明する簡単な戦略は、その不在は、具体的にシステムの機能を変化させる方法を決定することです。この方法は、広く実験的病変または異なる脳領域18-21の不活性化、または特定のイオンチャネル22,23の薬理学的遮断を使用して、たとえば、神経科学の研究に用いられてきました。特に、機能的接続性とネットワークダイナミクスは、単一のセルの計算24-27にどのように影響するかを明らかにするために、in vivoで適用されています。しかし、今日まで、ニューロンの発火を阻止および/ ​​またはそれらの基本的な生物物理学的特性を摂動することを意図するものでローカル操作は部分的に有効であることができ、比較的小さな脳容積28に限定されています。 これらの制限を克服するために、我々は、新たなインビボ実験的アプローチを開発しました指定された脳の状態で記録された単一神経細胞の電気生理学的特性を比較するために、ラット、 すなわち、全脳のシナプス活動29の完全な抑制後に得られたものに、動的な特定のネットワークに埋め込 ​​まれました。制御条件において、二つの異なる皮質ダイナミクスを生成することができます。睡眠のようなelectrocorticographic（ECOG）のパターンは、ペントバルビタールナトリウムの適度な用量の注射によって誘発されました。また、覚醒状態（覚醒状パターン）を根底にある皮質の活動に匹敵する小振幅の高速ECOG波はフェンタニルの注入によって生成することができます。同じECOG細胞内記録を維持しながら、続いて、内因性の脳の電気的活動の完全なサイレンシングは、等電ECOGと細胞内活動によって特徴付けられる、ペントバルビタールナトリウムの高用量の全身注射によって得られました。このような極端な昏睡状態の誘導は、潜在的に致命的なconsequenを持っている可能性があるため生物学的機能上のCESは、生理学的変数の慎重かつ継続的な監視が不可欠でした。したがって、我々は細心の注意を払って実験を通じてハートビート周波数、呼気終末CO 2濃度（のEtCO 2）、O 2飽和度（SpO 2）およびラットの中心温度を追いました。 我々は、in vivoでの長期かつ安定した録音のために特に適している鋭い微小電極を使用して、これらの異なる状態の間に単一ニューロンの特性を評価します。ここで説明する手順は、他の電気生理学的およびイメージング手法と組み合わせることができ、他の動物モデルに拡張することができます。

<table><tbody><tr><td>ナトリウムペントバルビタール</td><td>セントラベット</td>ペン<td>トバルビタール</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン500</td><td>メリアル</td><td>Imalg&egrave;ne 500</td><td></td></tr><tr><td>フェンタニル&nbsp;</td><td>ヤンセン・チラグ</td><td>フェンタニル</td><td></td></tr><tr><td>キシロカイン</td><td>セントラベット</td><td>キシロベット</td><td></td></tr><tr><td>ガラミン トリエチオウ化物</td><td>シグマ</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>ECoGアンプ</td><td>A-Mシステム</td><td>ACアンプ、モデル1700</td><td></td></tr><tr><td>細胞内アンプ</td><td>分子デバイス</td><td>アクソクランプ900A</td><td></td></tr><tr><td>データ収集インターフェース</td><td>ケンブリッジ電子設計</td><td>CEDパワー1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>データ解析ソフト</td><td>ケンブリッジ エレクトロニックデザイン</td><td>Spike2 バージョン7</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サイエンティフィカ</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリープーラー</td><td>成重</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ハーバード製装置</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>銀線 0.125mm(細胞内記録)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Ag-AgCl リファレンス</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>銀線 0.25 mm (ECoG 記録)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>人工呼吸システム</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>生理学的パラメータのモニタリング</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Heating Blanket</td><td>ハーバード 装置</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン#5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン #5SF</td><td></td> FST11252-00IP<td></td><td></td></tr><tr><td>ポリウレタンカテーテル-0.43x0.69 mm&nbsp;&nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>シリコン エラストメア</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>デンタル ドリル</td><td>NSK</td><td>Y1001151 および P496</td><td></td></tr><tr><td>サージカル グルー</td><td>3M</td><td>ベットボンド</td><td></td></tr></tbody></table>

等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、<em&gt;インビボ</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

方法ニューロンのプロセス情報は、それらの固有の膜特性上および求心性シナプスのネットワークのダイナミクスの両方に依存します。特に、強い警戒の状態の関数として変化する内因的に生成されたネットワーク活動は、有意に神経の計算を調節します。自発的な脳のダイナミクスが単一ニューロン「統合的特性に与える影響を、異なる調査するために、我々は、ペントバルビタールナトリウムの高用量の全身注射によって、 生体内でのすべての脳の活性を抑制することからなるラットにおける新しい実験戦略を開発しました。継続的に組み合わせた皮質脳波（ECOG）と細胞内記録によって監視皮質の活動は、次第に安定した等電点電気泳動プロファイルにつながる、鈍化しています。深い昏睡状態にラットを入れ、この極端な脳の状態は、注意深く実験を通して動物の生理学的定数を測定することによってモニターしました。細胞内Recordingsは、私たちは、このような睡眠 - 覚醒サイクルに遭遇するなどの生理学的に関連する皮質ダイナミクス、中に埋め込まれた同じニューロンの統合的な性質を特徴づけると比較させ、脳は完全に沈黙していたとき。

等電脳の状態を誘導し、維持することは、インビボ実験手順で繊細です。直接神経細胞の興奮と伝達関数29に皮質ネットワーク活動の影響を研究するための強力なツールであることが証明されている。 図1は、ECOGと重要な定数を含むマルチパラメータモニタリングを示し、動物の生理的状態の（ 図1Aの前に等電状態の）及び後（ 図1B）の誘導。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53576/53576fig1.jpg" /> 制御および等電点電気泳動条件での生理的パラメータの1モニタリング図。 AとB、アクティブ皮質状態（A）</st...

この手順では、等電脳の状態で、その結果、生理学的に関連する脳の状態の間、継続的な電気的活動の完全な廃止後に単一ニューロンからの長期的なin vivoでの細胞内記録を行います。動物の生理学的定数は慎重に人工的な昏睡状態への移行中に監視されています。

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

本プロトコルの全体的な目的は、生体内で脳の全般的な不活性状態を誘導し、シナプス入力がない状態で単一ニューロンの統合的な特性を研究することです。ここで提示する方法は、ネットワーク活動が単一細胞の演算に与える影響の評価や、昏睡状態におけるニューロンの応答性の研究など、神経生理学における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、損傷のない生体準備において、ネットワークから切り離された状態でニューロンの特性を研究できることです。この手順を開始するには、十分に麻酔をかけたラットを電気毛布の上に置きます。深部体温を37°C前後に維持するため、動物の直腸にプローブを挿入します。その後の麻酔剤の注入を容易にするために腹腔内にカテーテルを留置するには、まず除毛クリームを使用して、胃の右下または左下の四分の一の狭い範囲の毛を除去します。局所麻酔薬を注射した後、手術部位を滅菌し、鋭い鋏で皮膚に2〜3 mmの切開を加えます。鈍端鋏を用いて、腹腔が見えるまで脂肪層と筋肉層を除去します。次に、小型カテーテルを腹腔内に約1〜2 cm挿入し、手術用接着剤で創傷部を閉鎖します。ループを作り、カテーテルを皮膚に縫合して固定します。人工呼吸時の換気を制御するために気管チューブを挿入するには、除毛して部位を滅菌し、胸骨柄の直上の気管上の皮膚を切開します。脂肪層と筋肉の第一層を鈍的に剥離します。唾液腺を脇に避け、筋肉の最後の層を慎重に剥離して気管を露出させます。ピンセットを用いて気管を注意深く分離し、その下に糸を滑り込ませます。その後、その糸で外科結紮結節を緩めに作製します。2つの軟骨環の間で気管を横方向に切開します。次に、適切な直径の気管チューブを挿入し、チューブを固定するために糸の結び目を締めます。さらに安定させるために、糸を気管チューブのより高い位置にさらに固定することができます。縫合または外科用ステープラーを用いて創傷部を閉鎖します。その後、動物をステレオタキシックフレームに固定し、乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。次に、心電図、血中酸素飽和度、および呼気終末二酸化炭素分圧などの生理学的変数をモニタリングするための適切なプローブを装着します。その後、頭皮の被毛を除去し、手術部位を滅菌します。メスを用いて2 cmの縦切開を行い、頭蓋骨上の結合組織を切除します。次に、処置を安定させるために、頭蓋骨と組織にサージカルグルーを塗布します。次に、歯科用ドリルを用いて、関心領域の上に直径1.5 millimeterの小さな開頭術を行います。その後、超極細鉗子と静脈剪刀を使用して、硬膜に小さな穴を慎重にあけます。皮質電図電極を配置するため、開頭部位の中に0.5 millimeterの領域を確保しておきます。皮質を0.9%塩化ナトリウム溶液またはaCSFで湿らせておくようにしてください。次に

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学ぶ等電点脳状態誘導法による神経細胞の内因的性質の測定。シナプス入力なしでの単一ニューロンの応答性をin vivoで評価し、ネットワーク活動の影響を排除した神経生理学研究に貢献します。

等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、

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