網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光
2016年3月11日
網膜色素上皮(RPE)は、リポフスチンとして蓄積する視覚サイクル副産物のリサイクルを通じて感覚網膜をサポートします。これらの製品は自家蛍光性であり、in vivoで定性的にイメージングできます。ここでは、共焦点走査型レーザー検眼法を用いてRPEリポフスチンを定量的にイメージングする方法について述べます。
定量的自家蛍光法(qAF)の全体的な目標は、健康な眼と病気の眼の両方において、網膜の支持細胞である網膜色素上皮(RPE)におけるリポフスチンの全体的なレベルを評価することです。この手法は、網膜色素上皮の健康が加齢性黄斑変性症(AMD)の発症とどのように相互作用するかなど、網膜細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、眼底中のリポフスチン自家蛍光の絶対レベルを決定できるため、患者間、患者イメージングセッション間、および大規模な研究集団における定量的かつ再現性のあるフォローアップが可能になることです。
イメージングを行う前に、製造元の指示に従ってデータを取得するために、共焦点走査型レーザー光学法(CSLO)を適切にセットアップします。メーカーから購入した内部蛍光基準を取り付けるには、レンズをひねって取り外し、機械の金属リングを緩めて、基準を含む新しい金属リングと交換します。光が途切れることなく通過するためには、瞳孔を少なくとも6mmに拡張することが不可欠です。
0.5%トロピカミドと2.5%のフェニレフリンを使用して、患者の瞳孔を少なくとも6mm拡張します。これは、眼底を見て測定するための光の途切れない通過に不可欠です。あごをあご当てに乗せ、額を額当てに当て、外側のカンティをインジケーターに適切に位置合わせして、患者をCSLOに適切に配置します。ベースライン画像を取得するには、まず近赤外反射率(IR光)で眼底を画像化し、カメラを黄斑に集中させて大まかな焦点を合わせます。
患者が適切な位置にいたら、コントロールパネルのハードウェア設定をIRイメージングモードに切り替え、眼底が完全に焦点が合うまでカメラを手動で配置し、画像を撮影します。コントロールパネルの設定をIROCTに調整し、スペクトル領域光干渉断層撮影法(SDOCT)とIRイメージングを組み合わせて使用して、黄斑の基礎疾患を評価します。イメージングウィンドウにあるガイドを使用して、OCTを眼底のIR画像に正しく向けます。
最適なSDOCT品質を実現するには、OCT画像がイメージングウィンドウの上3分の1に来るようにカメラを配置します。中心窩を通り、イメージングフィールド全体にわたる水平線スキャンを少なくとも1回取得します。qAFイメージングを設定するには、高速画像取得を使用すると、患者の動きによる信号損失や、虹彩やまぶたによる光の遮断のリスクが軽減されます。
平均 9 フレームを使用すると、9 つの画像フレームを迅速かつ順次キャプチャし、平均化してノイズとアーティファクトを低減します。30 x 30 度の視野を選択します。これは、画像取得中にキャプチャされた網膜領域の角度を指します。ブルーライトについて患者に警告した後、AFモードをオンにし、画面の画面が眼底AFで最大限に満たされるようにカメラの軸を合わせ、画像の側面と角の暗さを最小限に抑えます。
患者が明るい青色光に耐えるのが難しい場合は、カメラを目から遠ざけてイメージングを開始し、眼底が完全に見えるようになるまでカメラをゆっくりと患者に向けます。手動またはオプタモスコープジョイスティックを使用して、CSLOを動かしてカメラの位置を変更し、AF信号が最も鮮明な画像を実現するのではなく、フィールド全体で最高レベルになるようにカメラの位置を変更します。画像取得中、内部基準または眼底に見える色付きのピクセルは、飽和が過剰であり、信号が失われていることを示しています。
イメージング中の感覚網膜でのロドプシンによる光の吸収を最小限に抑えるために、網膜を少なくとも20秒間AF光に完全露光します。この期間を使用して、カメラの位置合わせ、フォーカス、感度を最適化します。各画像取得の前に被写体をまばたきさせ、新鮮な涙液膜が信号品質を向上させます。
まぶたが取得面に入らないようにして、画像を撮ります。データ分析のために、イメージングセッションごとに少なくとも2つの高品質の画像を生成することが重要です。CSLOソフトウェアを使用してポストイメージ処理を実行し、9フレームスタックの平均を計算し、信号対雑音比を向上させます。
テキストプロトコルに従って画像解析を行います。このように、健康な眼では、RPEから発せられる心房細動は眼底全体に比較的均一に分布しています。強度の低下は、黄斑色素による光の遮断により黄斑中央部に見られ、眼とカメラの光学系により側面と角に見られます。
血管は暗く、焦点がはっきりしている必要があります。この図は、この図の qAF レベルの対応するヒート マップ表示を表しています。寒色系はAF強度の低い領域に対応し、暖色系はAF強度が高い領域に対応します。
最大強度は、一般に 2 番目の同心円状の 8 セグメント リングに見られ、この領域の平均強度はほとんどのデータ分析に使用されます。ここに示されているのは、AMDを使用した眼の代表的な分析であり、AMDの進行型である地理学的萎縮を示しています。この形態の AMD は、AF の著しい減少または欠如によって証明される RPE 損失の局所領域をもたらし、進行性の中心視力喪失を引き起こします。
この手順を試行する際には、候補となる患者を慎重に選択し、データ品質を最大化するために高品質の画像を再現可能に取得することを覚えておくことが重要です。この手順を使用すると、網膜の健康状態を縦断的に追跡して、網膜変性の進行を判断できます。その開発後、この技術は、光学学の分野の研究者が網膜変性を追跡し分析するための道を開きました。
このビデオを見た後、網膜変性症の患者を評価するために定量的自家蛍光を使用する方法をよく理解しているはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、網膜色素上皮（RPE）におけるリポフスチンを定量的にイメージングする方法について、共焦点走査レーザー眼底観察（CSLO）を使用して議論します。この技術は、健常および疾患のある眼の両方でリポフスチンレベルを評価することを目的としており、網膜細胞生物学の理解に貢献します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 眼科学
- 細胞生物学
背景
- RPEは、視覚サイクルの副産物をリサイクルすることで感覚網膜をサポートします。
- リポフスチンの蓄積は細胞の健康状態を示す可能性があります。
- リポフスチンレベルの理解は、年齢関連性黄斑変性症（AMD）の研究に不可欠です。
- 定量的イメージングにより、患者や研究間で再現可能な評価が可能になります。
研究の目的
- RPEにおけるリポフスチンレベルを定量的に評価すること。
- RPEの健康状態とAMDの発症との関係を探ること。
- 臨床および研究応用のための信頼できるイメージング技術を確立すること。
使用された方法
- 共焦点走査レーザー眼底観察（CSLO）のセットアップと校正。
- 正確な測定のための内部蛍光参照の使用。
- 最適な光の通過のために瞳孔を少なくとも6mmまで拡張すること。
- 眼底の定量的自己蛍光イメージング。
主な結果
- 様々な眼の状態下でのリポフスチンレベルの成功したイメージング。
- 比較のためのベースライン自己蛍光レベルの確立。
- イメージングセッション間での技術の再現性の実証。
- 網膜の健康と疾患におけるリポフスチンの役割への洞察。
結論
- リポフスチンの定量的イメージングは網膜研究において価値あるツールです。
- この方法はRPEの機能と病理学の理解を深めます。
- さらなる研究はこの技術を活用して、AMDやその他の網膜疾患を調査することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative fundus autofluorescence (qAF) enables reproducible, absolute measurement of retinal pigment epithelium (RPE) lipofuscin levels, providing a biomarker for cellular stress and degeneration in preclinical models of retinal disease. This approach supports target validation by correlating RPE functional status with sensory retina integrity, informing mechanistic de-risking in ophthalmology discovery programs. The technique enhances predictive confidence in lead identification by enabling longitudinal tracking of pathological progression in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying lipofuscin accumulation as a readout of RPE phagocytic and lysosomal function in disease models.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible assessment of RPE health across experimental conditions and timepoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking RPE lipofuscin levels to photoreceptor stress and degeneration, informing target confidence in preclinical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated retinal models for downstream compound screening by establishing baseline lipofuscin levels and detection thresholds.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal fluorescent reference calibration and controlled imaging parameters.
- Scalability Value: Facilitates high-throughput applicability through rapid frame averaging and standardized field-of-view acquisition for large study populations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by linking RPE lipofuscin patterns to outer retina structural changes, supporting biomarker-aligned disease modeling.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, longitudinal tracking of degeneration progression in preclinical studies.
- Predictive Value: Enhances mechanistic de-risking by providing objective, correlative data on RPE functional decline preceding photoreceptor loss.
Pipeline & Workflow Integration
Quantitative autofluorescence integrates into the ophthalmology discovery continuum from early target validation through preclinical efficacy assessment, enabling data-driven go/no-go decisions based on RPE health metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying lipofuscin as a functional readout of RPE metabolic and lysosomal activity.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, noise-reduced imaging via mean-of-9-frames acquisition and standardized 30x30 degree field imaging.
- Analytics: Generates quantitative lipofuscin intensity maps and regional mean values (e.g., second concentric ring) for comparative analysis across conditions and longitudinal studies.
- Translational Research: Connects RPE lipofuscin metrics to sensory retina integrity, enabling preclinical continuity when structural and functional biomarkers align.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across disease models (e.g., AMD, inherited retinopathies) due to standardized calibration and imaging protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RPE-photoreceptor crosstalk.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via internal reference use, pupil dilation control, and consistent image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on quantifiable RPE stress biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal, reproducible tracking of degeneration progression in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ophthalmic imaging and confocal scanning laser ophthalmoscopy operation.
- Dependent on CSLO instrumentation with autofluorescence mode and internal fluorescent reference compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for pupil dilation protocols (0.5% tropicamide, 2.5% phenylephrine) and imaging session consistency.
- Involves adaptation considerations across model species due to variations in fundus anatomy, lipofuscin fluorescence, and pupil size.
- Limited by signal saturation risk from prolonged blue light exposure and media opacity, requiring careful exposure timing and blink protocols.
