三次元バイオミメティック・テクノロジー：小説Biorubberはコラーゲンハイドロゲルで定義されたマイクロ・マクロスケールのアーキテクチャを作成します。
2016年2月12日
革新的なバイオファブリケーション技術が開発されました。これは、生体内の組織の建築的特徴、構成要素、機械的特性に似た3次元の構築物を設計するためです。この技術は、新開発の犠牲材料であるBSAゴムを特徴としており、詳細な空間的特徴を転写することで、さまざまな組織の生体内構造を再現します。
このプロトコルの全体的な目標は、生体内組織の構造的特徴、組成、および機械的特性に類似した3次元コラーゲン足場を設計することです。この方法は、ECM細胞の相互作用、人工組織の作成における構造的特徴の影響、組織置換の開発など、組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生分解性材料で内部の流路と経路の微細形状を高い忠実度で再現するための実行可能な手順を提供することです。
その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるVeronica Rodriguez-Riveraです。BSAゴムの調製に使用される材料は、BSAゴムが時期尚早に固まらないように、使用する準備ができるまで保管し、冷蔵する必要があります。この手順では、無菌性も非常に重要です。
まず、ディスペンサーを滅菌します。非細胞培養フードに、Oリング、シリンジ、キャップ、ミックスチップ、および4対1のディスペンサーをレイアウトします。これらの材料を30分間UV滅菌します。
まず、2つのステンレス製モールドピースをネジ止めし、ルアーロックを取り付けます。ディスペンサーを組み立てる前に、ピペットと試薬を70%エタノールでフードに導入する前にスプレーしてください。まず、チップキャップを溶液ホルダーに取り付けます。
次に、30%BSA溶液をもう一方のチャンバーを汚染することなく、より大きなチャンバーにロードします。Oリングを取り付けるのに十分なスペースを残してください。次に、小さい方のディスペンサーチャンバーに3%のグルタルアルデヒドをロードし、別のOリングを取り付けます。
次に、シリンジをディスペンサーに取り付けます。次に、キャップが上にくるようにアセンブリを傾け、キャップをミキシングチップと交換します。次に、側面を軽くたたいて、気泡が上に移動するようにします。
次に、オートクレーブ滅菌されたバッグの内側にディスペンサーを置き、排気液を封じ込めます。バッグ内で、ディスペンサーを直立させた状態で、少量の溶液を分注して、シリンジからすべての空気を取り除きます。空気を抜くことは非常に重要です。
次に、すぐに、ステンレス鋼のY型のルアーロックをシリンジの先端に取り付けます。次に、金型を利き手ではない手で、流出チャネルの左右の排気口に交互に噴射します。排気口を押して、内部の空隙を溶液で満たします。
次に、金型を水平に配置し、ディスペンサー容量の半分が使用されるまで、より多くの溶液を注入します。次に、型を皿に入れ、パラフィルムで包み、摂氏4度で一晩保管する必要があります。この手順は、4グラムの酸性化コラーゲンにスケーリングされます。
使用するまで冷やしてください。コラーゲンを重み付けした後、ガンマ線による溶液の滅菌に進みます。準備として、水に新鮮な0.2の通常のHEPES溶液を作ります。
次に、内容物を50ミリリットルの円錐管に移します。濃水酸化ナトリウムを使用してpHを9に調整します。フードをUV滅菌し、鉗子、へら、メスをオートクレーブしてください。
ボンネット内で、1.5ミリリットルのHEPES溶液と1.5ミリリットルの10xMEMを混合します。この混合物を氷上に保存します。また、12ウェルプレートと20ミリリットルのシリンジを冷凍庫で10分間冷やします。
無菌性を高めるには、フードに入れる前に、70%エタノールを関与させるチューブとプレートをスプレーします。モールドプレートをスプレーし、フードに入れます。次に、鉗子でBSAゴム型を取り外します。
次に、メスを使用して金型から排気チャネルを切り取ります。次に、HEPES-MEM混合物を短時間ボルテックスし、コラーゲンに1ミリリットルを加えます。次に、滅菌ヘラで溶液を完全に混合します。
短い渦巻きで続き、溶液を冷たい20ミリリットルの注射器にすばやく移します。次に、BSAゴムをウェルの内側に固定しながら、コラーゲンハイドロゲル溶液の半分をウェル底に分注します。次に、ピンセットを使用して、ゴムの流入と流出の端がウェルの壁に接触するように型を配置します。
次に、型をコラーゲンハイドロゲルで覆います。次に、ウェルをパラフィルムで密封し、プレートを摂氏37度のインキュベーターにロードします。コラーゲンが重合するまで1時間待ちます。
この間、フード内のUVライトをONにしてください。また、UV架橋装置を平方センチメートルあたり630、000マイクロジュールを提供するように設定します。次に、手袋をはめた手に70%エタノールをスプレーし、コラーゲンで覆われた型をプレートに架橋剤に充填し、照射プロセスを開始します。
照射後、再度手袋をスプレーし、プレートを架橋剤から取り出します。次に、滅菌ヘラを使用して、ゲルをウェルから取り出し、裏返し、ヒドロゲルの底を架橋します。最終的な架橋サイクルの後、酵素消化を進めます。
コラーゲン足場を乱さずにBSAゴムを取り外すには、pH 7.8の滅菌0.25%トリプシン溶液を使用し、0.20ミクロンのフィルターに押し込みます。十分なろ過されたトリプシン溶液を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。次に、コラーゲンハイドロゲルを酵素溶液を含む円錐管に移します。
ヒドロゲルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。チューブをパラフィルムで密封し、約1分間静かにボルテックスします。次に、チューブを摂氏30度でインキュベートし、消化を15〜24時間放置します。
最初の4時間は、15〜30分ごとにチューブを取り外し、穏やかにボルテックスしてBSAゴムの消化を完了させます。翌日、溶液中にゴムが浮かばないか、ハイドロゲル中にゴムの分解片がない場合、消化は完了したと見なされます。次に、トリプシン溶液を滅菌モスコナス溶液に交換し、チューブを摂氏4度で30分間振とうします。
その後、モスコナス溶液を吸引し、この手順をさらに2回繰り返して、コラーゲン足場を完全に洗浄します。バイオラバーの使用を最適化するために、広範な数の試験が使用され、テキストプロトコルに詳細に説明されています。最適化されたプロトコールと3つの固体モールドピースを用いて、コラーゲンハイドロゲルを作製し、詳細に検討しました。
必要なY型は、Microlutionマシンで作成しました。Y型に30%のBSAと3%のグルタルアルデヒドを注入し、摂氏4度で一晩反応させました。次に、BSAゴムにコラーゲンを充填し、摂氏37度に1時間加熱しました。
ゴムは15時間酵素消化され、コラーゲンハイドロゲルの形状に影響を与えることなく、ゴムが脱落するまで弱くなりました。金型によって鋳造された4ミリメートルの流入チャネルは、ノギスで測定され、コラーゲンハイドロゲル内で正確に4ミリメートルになりました。金型の安定性をテストしたところ、300ミクロンという小さな寸法でも確実に設計できることがわかりました。
さらに、モスコナス洗浄後に足場に残留グルタルアルデヒドがないかテストしましたが、残留物は見つかりませんでした。このビデオを見れば、生体内の形状を模倣する可能性のある3Dコラーゲンスキャフォールドの作り方を十分に理解できるはずです。この手順に続いて、生体内組織の3Dモデルの作成や特定の建築的特徴を持つ型の作成など、この技術を補完する他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、組織工学の分野の研究者が、内部構造の特徴とマトリックス成分と細胞とのin-vitroモデルでの相互作用を探求する道を開きました。
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概要
本記事では、生体内の組織の構造的特徴および機械的特性を模倣した三次元コラーゲン足場を構築するための、革新的なバイオファブリケーション技術を紹介します。この手法では、新たに開発された犠牲材料であるBSAラバーを用いて、さまざまな組織の微細幾何学構造を正確に再現します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織工学
- バイオファブリケーション
- スキャフォールド開発
背景
- 本研究では、研究における現実的な組織モデルの必要性について取り上げています。
- 細胞とECM（細胞外マトリックス）の相互作用と、それが組織工学において持つ重要性を探求します。
- 本手法は、組織置換物の再現性を向上させることを目的としています。
- 成功のためには、無菌状態の維持と適切な材料保存が極めて重要です。
研究目的
- 生体内の組織に密接に類似したスキャフォールドを構築すること。
- 組織工学における構造的特徴の影響を調査すること。
- 生分解性スキャフォールドを作製するための信頼性の高い手法を開発すること。
使用した手法
- 管理された条件下でのBSAラバーの調製。
- 詳細な空間的特徴を転写するための犠牲材料の利用。
- 熟練したポストドクターによる手順のデモンストレーション。
- 材料の無菌性の確保および適切な保存。
主要な結果
- この手法により、組織の微細幾何学的構造を再現することに成功した。
- 内部流路の作製において高い忠実度が達成された。
- 結果は、組織工学および代替組織への応用の可能性を示唆している。
- プロセスにおける材料ハンドリングの重要性が実証された。
結論
- この手法は、組織工学における課題に対する実行可能なアプローチを提供します。
- これにより、構築された組織におけるECM相互作用への理解が深まります。
- これらの知見は、組織置換技術の進歩につながる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
このバイオファブリケーション技術は、コラーゲンハイドロゲル内における組織微細構造の精密な再現を可能にし、前臨床モデルの忠実度における重要な課題を解決します。定義されたマイクロスケールおよびマクロスケールのチャネルを構築するためのスケーラブルな手法を提供することで、組織標的治療の開発におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。本アプローチにより、生理学的に妥当な3D環境内での薬物と組織の相互作用を評価する際の予測信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 疾患に関連するシステムにおいて、構造的特徴がECM-細胞相互作用およびパスウェイの活性化にどのように影響するかを解析することを可能にします。
- 実用的価値： 再現可能なスキャフォールド幾何学形状を提供し、実験バッチ間で一貫したターゲットバリデーションアッセイを実現します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 生体模倣環境における信頼性の高い化合物スクリーニングのため、定量可能なチャネル寸法を持つ標準化されたコラーゲンスキャフォールドを作製する。
- 運用上の価値： 犠牲成形（サクリフィシャルモルディング）を通じてアッセイの標準化を支援し、マイクロ流路のような組織モデルにおける変動を低減する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：生体内の組織構造を模倣したスキャフォールドにおける灌流および輸送現象の研究を容易にし、トランスレーショナルなバイオマーカーの妥当性を向上させる。
- 運用的価値：縦断的な組織成熟研究に適した、定義された形状を持つスキャフォールドを作成することで、前臨床段階における連続性を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、単純な2Dモデルと複雑なオルガノイドを橋渡しする、調整可能で生分解性の足場を提供することで、初期の創薬探索ワークフローに組み込まれ、仮説に基づいたターゲットバリデーションを支援します。
- 創薬生物学：スキャフォールドの構造が治療候補物質に対する細胞応答をどのように調節するかを制御された条件下で試験することを可能にし、メカニズム解析におけるリスク軽減を支援します。
- スクリーニング：化合物の浸透性とターゲット結合の定量的な評価に向けた、再現性のある構造定義済みハイドロゲルを提供します。
- 解析：チャネル寸法（例：3 mmおよび4 mm）や300 micronsまでの構造的完全性の精密な測定を可能にし、客観的な形態計測リードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：構造的特徴を機能的な組織結果と相関させることができるスキャフォールドを生成することにより、前臨床段階における連続性を確保します。
- 企業内での再利用：CAD設計のモールドとBSAラバー成形を用いることで、複数のプロジェクトにわたって標準化された組織模倣体を生成するためのプラットフォーム機能を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ECM-細胞シグナル伝達研究において構造的な変数を分離することで、組織工学モデルにおけるメカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：標準化されたBSAラバーの作製と酵素的除去により再現性を確保し、バッチ間のばらつきを最小限に抑えます。
- 戦略的価値：薬物分布および細胞挙動に対する生体内の組織的制約をより適切に再現したスキャフォールドからデータを提供することで、Go/No-Go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：構造的に定義された疾患関連システムにおける性能に基づき、リスク調整後の治療薬の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 生体材料の取り扱い、無菌操作、および酵素消化の最適化に関する専門知識が必要です。
- CADソフトウェア、精密成形装置（例：Microlution）、および制御されたインキュベーション/架橋システムの利用が必須となります。
- 再現性を確保するため、モールド設計、BSAラバーの調製、およびコラーゲンハイドロゲルのプロトコルについて、チーム間での標準化が必要です。
- 本手法を異なるコラーゲン濃度や代替天然ポリマーに適用する場合、適応上の検討が必要となります。
- 実用上の制限として、BSAラバー前駆体の冷所保存が必要であること、および犠牲材料を完全に除去するために長時間の消化時間（15–24時間）を要することが挙げられます。
