炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

このイメージングプロトコルの全体的な目的は、炎症を起こした皮膚におけるCD4陽性T細胞のダイナミクスを可視化することです。本手法は、炎症組織における免疫細胞の運動性や機能の根底にあるメカニズムは何か、といった免疫学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、CD4 T細胞の動的な挙動をIn Situで研究するための低侵襲な方法を提供することにあります。

耳のイメージング準備の手順は習得が難しく、高品質な画像を撮影するには耳の適切なポジショニングが必要であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。私は大学院生のAlison Gayloです。これからこのプロトコルの実演を行います。まず、マウス1匹あたり300 µLの蛍光標識エフェクターT細胞懸濁液を、27.5Gの針を装着したシリンジに吸引することから始めてください。

次に、シリンジの針側を上に向け、シリンジのシャフトを軽く指で弾き、必要に応じてプランジャーを上下に動かして気泡を取り除きます。細胞の準備が整ったら、マウスを清潔なケージに移し、尾静脈が拡張するまでヒートランプの下に置きます。その後、1匹目のマウスを固定器に移し、アルコール綿で尾を拭きます。

側尾静脈を確認した後、200 µLの細胞を静脈内にゆっくりと注入します。すべての細胞を転移させた後、28.5ゲージのインスリン用注射器に50 µLの完全フルオレッセンス乳剤を吸い込み、プランジャーを強く押し下げて大きな気泡を取り除きます。次に、左手の人差し指にシンブルを装着し、耳の腹側を上にして、左手の親指とシンブルの間でマウスの耳を注意深く保持します。

次に、針の斜面を上に向け、耳介の外側3分の1の真皮内に、中心からわずかに外れた位置へ刺入し、10 µLのエマルションを組織内にゆっくりと注入します。すべての動物への注入後、マウスが完全に回復するまで観察します。免疫から3日後、先に示した方法で注入した動物の尾静脈を血管拡張させます。

麻酔後、1匹目のマウスの尾をピンセットで固定します。アルコール綿で尾を拭き、30.5ゲージの針カテーテルを尾側静脈に慎重に挿入します。シリンジのプランジャーを軽く押し、開通していることを確認してください。カテーテルが適切に留置されたら、注射部位にシアノアクリレート組織用接着剤を1〜2滴塗布し、約30秒間乾燥させます。

次に、ハサミを使って、ひげおよび耳の背面と側面の毛を注意深く刈り取ります。続いて、綿棒を用いてPBSで耳の内面を湿らせます。その後、マウスを回転させ、注入した耳を24 by 50 millimeterのNo. 1.5 ガラスカバースリップの上に、ガラス面に密着するまで平らに固定します。

余分なPBSを吸い取ります。次に、2本の湾曲鉗子を用いて、長さ約20 mmの布製テープの上端の両角を縦方向に掴み、テープの下端をマウスの耳の最上部にあるカバースリップの上に配置します。耳の残りの部分に沿ってテープを巻き付け、必要に応じて鉗子で余分な毛をどかしながら進めます。乾燥した綿棒を使用して、耳自体を圧迫しないように注意しながら、テープを耳の周囲に軽く押し付け、密着させます。

得られる画像の品質に影響するため、耳をカバーガラスに適切にテープで固定し、両端をしっかりと密閉させ、気泡を最小限に抑えることが不可欠です。次に、蛍光顕微鏡イメージングプラットフォームを37 °Cのヒーティングブロックにテープで固定し、プラットフォームの耳設置エリアの両側に真空グリースを塗布します。マウスを回転させてカバーガラスをプラットフォーム上に配置し、耳がフェルトの中央に揃うように注意してください。

耳の配置が完了したら、イソフルラン用ノーズコーンをプラットフォーム上のホルダーにカチッとはめ込み、コーンが固定され、マウスの鼻が完全に覆われていることを確認します。次に、綿棒を使用して、カバーガラスをイメージングプラットフォーム上にしっかりと、かつ慎重に押し付け、カバーガラスの下で真空グリースを広げます。2枚の20 mmのテープと2枚の長めのテープをプラットフォームの上部に巻き付け、カバーガラスをプラットフォームに固定します。

次に、マウスを顕微鏡ステージに移動させます。プラットフォームをさらにテープで固定し、耳の周囲のカバーガラス上に真空グリースの二重層を塗布します。その後、水で満たした加熱ブランケットでマウスを包み、真空グリースのリザーバーに37 °Cの蒸留水を満たします。

In Vivoタイムラプスイメージングを行うには、まず対物レンズを耳の中心に配置し、リザーバー内の水面にちょうど接触するまで対物レンズを下げます。次に、外部光源を用いて、耳の表面にピントが合うまでゆっくりと対物レンズを下げます。その後、顕微鏡ステージ周囲の内側および外側のカーテンを下げ、MPレーザーコントローラーウィンドウでレーザー波長を900 nanometersに、取得設定レーザーウィンドウでレーザー出力を、そして画像取得コントロールウィンドウでPMT電圧をそれぞれ調整します。

撮影設定のサイズおよびモードウィンドウで、顕微鏡の解像度を512×512ピクセルに設定し、1ピクセルあたりのドウェル時間を2 µsに設定して、XYリピートを選択して組織をスキャンするためのライブイメージングモードを有効にします。適切な撮像視野が決定したら、真皮の中で最も高い位置にある細胞を探し、「set zero」ボタンをクリックしてZ位置をゼロに設定します。Z方向にスクロールして、細胞の深さを測定します。

次に、顕微鏡のデータ収集設定ウィンドウで開始位置と終了位置を設定し、輝度Zウィンドウで装置のPMT電圧とレーザー出力を調整して、イメージング視野の全深度にわたって細胞を最適に可視化します。深度および時間ボタンをチェックし、画像収集制御フィルターモードウィンドウにて共通フィルターを設定して、1ラインあたり3回スキャンするように設定します。画像収集顕微鏡ウィンドウでZスライス深度を調整し、タイムビューウィンドウに表示される完全なスタックのキャプチャに約1分かかるように設定してください。

次に、組織の安定性を評価するため、画像取得設定のタイムスキャンウィンドウでリピート回数を5回に設定し、スキャンボタンをクリックして、当該領域の5分間のタイムラプス画像を撮影します。5分後も組織が安定している場合は、画像取得設定のタイムスキャンウィンドウでリピート回数を30回から45回に設定し、画像収集中の軽微な組織ドリフトがないかを確認しながら、30分から45分間のタイムラプス画像を収集します。抗体処理前の画像を適切な形式で保存し、その後、気泡が入らないように注意しながら、抗体混合液を1 mLの結核菌用注射器に吸い取ります。

プランジャーをゆっくりと押し、針先に抗体溶液の液滴を形成させ、ステージ周囲のカーテンを上げてカテーテルを確認します。PBSのシリンジを抗体シリンジに交換し、抗体をカテーテル内にゆっくりと注入します。抗体の注入が完了したら、カーテンを再び下ろし、注入時刻を記録します。

その後、抗体投与前のイメージングと同じ場所および装置設定を用い、直ちに20～40分間の新しいイメージングシーケンスの収集を開始します。最後に、抗体投与後のイメージングファイルを適切な形式で保存し、マウスを顕微鏡ステージから慎重に移動させ、動物が完全に回復するまで観察します。本プロトコルによる無傷の耳真皮のイメージングは、炎症を起こした真皮におけるエフェクターT細胞のダイナミクスの高解像度タイムラプス画像の取得を可能にします。

この動画では、緑色で示された養子移入されたエフェクターT細胞が真皮組織全体を移動する様子が観察できます。しかし、カテーテルを介してanti-β1およびanti-β3インテグリン遮断抗体を投与すると、それまで移動していた細胞が真皮内で停止します。抗体投与後、細胞の平均速度が低下し、ともにメアンダリング指数（meandering index）も有意に低下することが示されています。

すなわち、全変位量に対する全走行距離の比です。毛包からの自家蛍光、上層にある毛によるシャドーイングや自家蛍光、そして耳の表面とカバーガラスの間に閉じ込められた気泡は、すべてイメージングアーティファクトの原因となり、T細胞の可視化を妨げ、自動画像解析ソフトウェアに干渉します。加えて、複数の熱源を使用すると組織の安定性に問題が生じ、イメージング中に大きな振動が発生して結果の解釈を困難にすることがあります。

この手順を正しく習得すれば、真皮内のCD4 T細胞のイメージングは2〜3時間で完了させることができます。本手順を行う際は、マウスを用いた実験に関する適切な動物愛護および使用ガイドラインに従うことが重要です。また、本手順は、感染モデルや炎症誘発方法を変更することで、耳における他のT細胞サブセットや免疫細胞種の可視化にも応用可能です。

イントラバイタルイメージングの開発により、免疫学分野の研究者は、生体動物内における進行中の免疫応答のダイナミクスを探索することが可能になりました。マルチホスファーレーザーの使用は極めて危険であるため、この手順を行う際は、適切な遮蔽などの予防策を常に講じてください。このビデオを視聴することで、マウスの耳真皮に炎症を誘導する方法、および抗体投与前後におけるCD4 T細胞活性のタイムラプス画像をイントラバイタルイメージングで撮影する方法について、十分に理解することができます。