Name: 炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶ炎症性皮膚におけるCD4陽性T細胞の動態可視化法。マウス耳介真皮を用いた低侵襲的イメージング技術で、免疫細胞の運動メカニズムをin situで解析し、免疫学研究に貢献します。

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著者は、ライブイメージングのヘルプのためのロチェスター大学の多光子顕微鏡中核施設に感謝します。 DJFにNIH AI072690とAI02851によってサポートされています。 MGOへAGおよびAI089079にAI114036。

著者らは、開示することは何もありません。

意義 ここでは、無傷のマウス耳真皮における転送、抗原特異的なエフェクターTh1細胞の4D可視化のための完全なプロトコルを提示します。この方法は、いくつかの理由のために、いくつかの現在の撮像モダリティ上の利点を提供します。腹側の耳の真皮を画像化することによって、我々は他の皮膚部位を含むイメージング・プロトコルのために必要とされる脱毛を見送ることができます。脱毛剤は、一般的に軽度であるが、それらは皮膚バリア42、免疫応答43,44を刺激することができるプロセスに混乱を引き起こすことが示されています。また、真皮や皮下組織を露出させるために侵襲的な外科的処置を回避することにより、このプロトコルは、損傷誘発炎症と真皮への好中球37および他の免疫細胞の迅速な動員を防止します。重要な分子に対するブロッキング抗体を提供するために、このシステムにおける静脈カテーテルの使用は、DYNAのリアルタイム尋問を可能にしますCD4 T細胞のマイク行動。この撮像プロトコールを使用することは、 イン...

CD4 T細胞のエフェクター機能は、損傷の調査、感染の病巣の特定、または慢性感染や自己免疫による病理を引き起こすために、さまざまな末梢組織に迅速に侵入して横断する能力に大きく依存しています。 炎症部位1-4へのホーミングと血管系から組織への血管外漏出5-7のプロセスは十分に特徴付けられていますが、T細胞の間質運動性を駆動および調節する因子は未定義のままです。複雑な3D環境におけるT細胞の移動は、人工マトリックス8-10またはマイクロ流体デバイス11,12を用いてin vitroで研究されてきたが、これらはin vivoシステムの複雑で動的な環境を再現することができない。高解像度のマルチカラー生体内イメージングの出現により、免疫細胞の動的挙動をin situで研究することが可能になり、無傷の免疫応答をより深く理解できるようになりました。
10年以上前に、免疫学的な問題に取り組むために初めて多光子顕微鏡を利用したいくつかの影響力のある研究が発表されました。初期の研究では、外植リンパ器官内の免疫細胞の挙動に焦点を当てていました13-16、その後すぐに麻酔をかけたマウスの露出したリンパ節を画像化する技術が続きました17。イメージングにより、T細胞18のリンパ節プライミングの段階、T細胞が二次リンパ器官19で移動するメカニズム、T細胞と他の免疫細胞との相互作用20,21、およびリンパ節22内の動的T細胞の位置に関する新しい基本的な観察が可能になりました。初期の多くの研究はリンパ節のダイナミクスに焦点を当てていましたが、それ以来、脳23-25、肝臓26、肺27、皮膚28-30など、多くの末梢組織の免疫応答を画像化するために生体内イメージングが利用されています。
マウスの耳の真皮は、耳の皮膚が薄く、髪の毛が比較的少ないこと、そして呼吸運動から分離することが容易であることから、イメージングに特に適しています31。実際、真耳は樹状細胞32,33、T細胞28,29,34,35、および好中球36,37の間質性挙動を画像化するために使用されており、真皮の炎症を研究するための確立された部位である。非侵襲的処置は、皮膚の分割38,39、脇腹39,40、または背側皮膚皮弁窓39,41 モデルなど、局所炎症性環境の変化を誘発する可能性のある皮膚の外科的製剤に取って代わることが増えています。転写されたin vitroプライミングされた抗原特異的CD4エフェクターT細胞の使用により、真皮炎症反応30の状況で細胞の均質な集団の研究が可能になります。ここでは、炎症を起こしたマウスの耳の真皮間質にある抗原特異的エフェクターCD4 T細胞の可視化を可能にする非侵襲的イメージング手順と、静脈カテーテルを介してブロッキング抗体を導入することにより、これらの細胞をリアルタイムで操作する能力について説明します。このモデルは、真皮内のCD4 T細胞の動きを追跡し、この運動性を支配するメカニズムを照会するのに効果的であることを示します。

<table><tbody><tr><td>BALB/c マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000651</td><td>使用したマウスは社内で飼育しました</td></tr><tr><td>DO11.10 マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>003303</td><td>使用したマウスは社内で飼育しました</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>フィッシャー</td><td>10-013-CV</td><td>多重等</td></tr><tr><td>価子牛新生児血清 (NCS)</td> <td>サーモ/ハイクローン</td><td>SH30118.03</td><td>56°Cで不活化モル</td></tr><tr><td>モット補体</td>シ<td>ダーレーン</td><td>CL-5000</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8抗体</td><td>ATCC</td><td>3.155(ATCC TIB-211)</td>から<td>得られる抗体&nbsp;このハイブリドーマ</td></tr><tr><td>抗MHCクラスII抗体</td><td>ATCC</td><td>M5/114.15.2(ATCC TIB-120)</td><td>から得られる抗体&nbsp;このハイブリドーマ</td></tr><tr><td>抗CD24抗体</td><td>ATCC</td><td>J11d.2(ATCC TIB-183)</td><td>から得られる抗体抗体は&nbsp;このハイブリドーマ</td></tr><tr><td>抗Thy1.2抗体</td><td>ATCC</td><td>J1j.10(ATCC TIB-184)</td><td>抗体由来&nbsp; このハイブリドーマ</td></tr><tr><td>Ficoll(Fico / Lite-LM)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>I40650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>21-040-CV</td><td>複数の同等の</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャー</td><td>15323591</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗CD62L抗体(クローンMEL-14)</td><td>BD</td><td></td><td></td>553149</tr><tr><td>ストレプトアビジン磁気分離ビーズ</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 分離カラム</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>抗IFNg抗体 (clone XMG 1.2)</td><td>eBioscience</td><td>16-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>anti-IL-4 antibody (clone 11b11)</td><td>eBioscience</td><td>16-7041-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>VWR</td><td>45000-412</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>15303641</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャー</td><td>15323671</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミンペプチド</td><td>バイオペプチド</td><td></td><td>ISQAVHAAHAEINEAGR-OH ペプチド</td></tr> 子<tr><td>牛胎児血清 (FCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SV30014.03</td><td>56°Cで不活性化C 30分間</td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td><td>LPS</td><td>3526</td><td>複数等価</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 インスリン注射器、1ml</td><td>BD</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 インスリン注射器、300μ;l</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>27 G1/2 TB シリンジ、1ml</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 針</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 医療用チューブ</td><td>BD</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート獣医用接着剤 (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>加熱プレート</td><td>WPI</td><td>61830</td><td></td></tr><tr><td>加熱プレート コントローラー</td><td>WPI</td><td>ATC-2000</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターブランケットコントローラー</td><td>ゲイマー</td><td>TP500</td><td>生産終了、新しい同等の</td></tr><tr><td>利用可能なウォーターブランケット</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>LEI Medical</td><td>Isotec 4</td><td>生産終了、新しい同等の</td></tr><tr><td>利用可能なイソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td></td><td>獣医を通じて注文スタッフ</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>複数等価</td></tr><tr><td>医療テープ</td><td>3M</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>イソフルランノーズコーン</td><td></td><td></td><td>社内で構築、図2</td></tr><tr><td>イメージングプラットフォーム</td><td></td><td></td>を参照 <td>社内で構築、図2</td></tr><tr><td>湾曲した鉗子</td><td>WPI</td><td>15915-G</td><td>複数の同等の</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-6802</td><td>複数の同等の</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>VWR</td><td></td><td>複数の同等の</td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>フィッシャー</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td></td><td></td><td>複数の同等の</td></tr><tr><td>繊細なタスクワイプ</td><td>フィッシャー</td><td>34155</td><td>複数の同等の</td></tr><tr><td>オリンパス Fluoview 1000 AOM-MPM 直立顕微鏡 Spectra-PhysicsMaiTai HP DeepSee Ti:Saレーザー</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振動制御付き光学テーブル</td><td>ニューポート</td><td></td><td>見積もり</td></tr><tr><td>25倍NA 1.05 多光子イメージングのための水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズヒーター</td><td>Bioptechs</td><td>PN 150815</td><td></td></tr><tr><td>検出フィルターキューブ</td><td>オリンパス</td><td>FV10-MRVGR/XR</td><td>独自のキューブは、個々のフィルター/ダイクロイクス</td></tr><tr><td>抗インテグリン&βから近似することができます。1抗体(クローンhMb1-1)</td><td>eBioscience</td><td>16-0291-85</td><td>アジドフリー、低エンドトキシン</td></tr><tr><td>抗インテグリン&β;3抗体(クローン2C9。G3)</td><td>eBioscience</td><td>16-0611-82</td><td>アジドフリー、低エンドトキシン</td></tr><tr><td>テキサスレッドデキストラン (70,000 MW)</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

炎症真皮における撮像cd4 t細胞間質への移行

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

エフェクター機能を実行するCD4 T細胞の能力は、未未定義の機構を介して炎症の末梢組織におけるこれらの細胞の迅速かつ効率的な移行に依存します。免疫系の研究に多光子顕微鏡の応用は、無傷の組織内の免疫応答の動態を測定するためのツールを提供しています。ここでは、炎症を起こしたマウス耳真皮におけるCD4 T細胞の非侵襲的な生体内多光子イメージングのためのプロトコルを提示します。カスタムイメージングプラットフォームの使用及び静脈カテーテルは、運動性に関与する重要な分子成分に対する抗体をブロッキング添加によってリアルタイムでこれらの細胞に問い合わせする能力を、皮膚間質におけるCD4 T細胞の動態の可視化を可能にします。このシステムは、in vitroモデルおよび外科的侵襲的な画像化手順の両方に勝る利点を提供します。運動のためのCD4 T細胞によって使用される経路を理解することは、最終的にバシへの洞察を提供することができますCのCD4 T細胞の機能だけでなく、慢性感染症からの両方の自己免疫疾患の病因と病理。

免疫環境を変更することなく、 その場での免疫応答を研究する能力は、炎症組織でTエフェクター細胞のリアルタイム相互作用の研究に不可欠です。 図1AおよびBで概説し、このプロトコルにより、無傷の耳の真皮のイメージングは、皮膚の間質における転送蛍光標識されたTエフェクター細胞の可視化を可能にします。これは、高解像度（ 図1C）とタイムラプス（ 図1D、 映画1）炎症を起こし、真皮内のエフェクターT細胞動態の画像の両方を可能にします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53585/53585fig1.jpg" /> 図1.高解像度と無傷の皮膚の間質におけるTエフェクター細胞の4Dイメージング...

炎症部位でのCD4エフェクターT細胞の間質運動を支配するメカニズムは、比較的知られていません。我々は、in vitroで視覚化して操作するための非侵襲的なアプローチは、その場でこれらの細胞の動的挙動の研究を可能にする、炎症を起こした耳の真皮中のCD4 T細胞を-primed提示します。

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

このイメージングプロトコルの全体的な目的は、炎症を起こした皮膚におけるCD4陽性T細胞のダイナミクスを可視化することです。本手法は、炎症組織における免疫細胞の運動性や機能の根底にあるメカニズムは何か、といった免疫学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、CD4 T細胞の動的な挙動をIn Situで研究するための低侵襲な方法を提供することにあります。耳のイメージング準備の手順は習得が難しく、高品質な画像を撮影するには耳の適切なポジショニングが必要であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。私は大学院生のAlison Gayloです。これからこのプロトコルの実演を行います。まず、マウス1匹あたり300 µLの蛍光標識エフェクターT細胞懸濁液を、27.5Gの針を装着したシリンジに吸引することから始めてください。次に、シリンジの針側を上に向け、シリンジのシャフトを軽く指で弾き、必要に応じてプランジャーを上下に動かして気泡を取り除きます。細胞の準備が整ったら、マウスを清潔なケージに移し、尾静脈が拡張するまでヒートランプの下に置きます。その後、1匹目のマウスを固定器に移し、アルコール綿で尾を拭きます。側尾静脈を確認した後、200 µLの細胞を静脈内にゆっくりと注入します。すべての細胞を転移させた後、28.5ゲージのインスリン用注射器に50 µLの完全フルオレッセンス乳剤を吸い込み、プランジャーを強く押し下げて大きな気泡を取り除きます。次に、左手の人差し指にシンブルを装着し、耳の腹側を上にして、左手の親指とシンブルの間でマウスの耳を注意深く保持します。次に、針の斜面を上に向け、耳介の外側3分の1の真皮内に、中心からわずかに外れた位置へ刺入し、10 µLのエマルションを組織内にゆっくりと注入します。すべての動物への注入後、マウスが完全に回復するまで観察します。免疫から3日後、先に示した方法で注入した動物の尾静脈を血管拡張させます。麻酔後、1匹目のマウスの尾をピンセットで固定します。アルコール綿で尾を拭き、30.5ゲージの針カテーテルを尾側静脈に慎重に挿入します。シリンジのプランジャーを軽く押し、開通していることを確認してください。カテーテルが適切に留置されたら、注射部位にシアノアクリレート組織用接着剤を1〜2滴塗布し、約30秒間乾燥させます。次に、ハサミを使って、ひげおよび耳の背面と側面の毛を注意深く刈り取ります。続いて、綿棒を用いてPBSで耳の内面を湿らせます。その後、マウスを回転させ、注入した耳を24 by 50 millimeterのNo. 1.5 ガラスカバースリップの上に、ガラス面に密着するまで平らに固定します。余分なPBSを吸い取ります。次に、2本の湾曲鉗子を用いて、長さ約20 mmの布製テープの上端の両角を縦方向に掴み、テープの下端をマウスの耳の最上部にあるカバースリップの上に配置します。耳の残りの部分に沿ってテープを巻き付け、必要に応じて鉗子で余分な毛をどかしながら進めます。乾燥した綿棒を使用して、耳自体を圧迫しないように注意しながら、テープを耳の周囲に軽く押し付け、密着させます。得られる画像の品質に影響するため、耳をカバーガラスに適切にテープで固定し、両端をしっかりと密閉させ、気泡を最小限に抑えることが不可欠です。次に、蛍光顕微鏡イメージングプラットフォームを37 °Cのヒーティングブロックにテープで固定し、プラットフォームの耳設置エリアの両側に真空グリースを塗布します。マウスを回転させてカバーガラスをプラットフォーム上に配置し、耳がフェルトの中央に揃うように注意してください。耳の配置が完了したら、イソフルラン用ノーズコーンをプラットフォーム上のホルダーにカチッとはめ込み、コーンが固定され、マウスの鼻が完全に覆われていることを確認します。次に、綿棒を使用して、カバーガラスをイメージングプラットフォーム上にしっかりと、かつ慎重に押し付け、カバーガラスの下で真空グリースを広げます。2枚の20 mmのテープと2枚の長めのテープをプラットフォームの上部に巻き付け、カバーガラスをプラットフォームに固定します。次に、マウスを顕微鏡ステージに移動させます。プラットフォームをさらにテープで固定し、耳の周囲のカバーガラス上に真空グリースの二重層を塗布します。その後、水で満たした加熱ブランケットでマウスを包み、真空グリースのリザーバーに37 °Cの蒸留水を満たします。In Vivoタイムラプスイメージングを行うには、まず対物レンズを耳の中心に配置し、リザーバー内の水面にちょうど接触するまで対物レンズを下げます。次に、外部光源を用いて、耳の表面にピントが合うまでゆっくりと対物レンズを下げます。その後、顕微鏡ステージ周囲の内側および外側のカーテンを下げ、MPレーザーコントローラーウィンドウでレーザー波長を900 nanometersに、取得設定レーザーウィンドウでレーザー出力を、そして画像取得コントロールウィンドウでPMT電圧をそれぞれ調整します。撮影設定のサイズおよびモードウィンドウで、顕微鏡の解像度を512×512ピクセルに設定し、1ピクセルあたりのドウェル時間を2 µsに設定して、XYリピートを選択して組織をスキャンするためのライブイメージングモードを有効にします。適切な撮像視野が決定したら、真皮の中で最も高い位置にある細胞を探し、「set zero」ボタンをクリックしてZ位置をゼロに設定します。Z方向にスクロールして、細胞の深さを測定します。次に、顕微鏡のデータ収集設定ウィンドウで開始位置と終了位置を設定し、輝度Zウィンドウで装置のPMT電圧とレーザー出力を調整して、イメージング視野の全深度にわたって細胞を最適に可視化します。深度および時間ボタンをチェックし、画像収集制御フィルターモードウィンドウにて共通フィルターを設定して、1ラインあたり3回スキャンするように設定します。画像収集顕微鏡ウィンドウでZスライス深度を調整し、タイムビューウィンドウに表示される完全なスタックのキャプチャに約1分かかるように設定してください。次に、組織の安定性を評価するため、画像取得設定のタイムスキャンウィンドウでリピート回数を5回に設定し、スキャンボタンをクリックして、当該領域の5分間のタイムラプス画像を撮影します。5分後も組織が安定している場合は、画像取得設定のタイムスキャンウィンドウでリピート回数を30回から45回に設定し、画像収集中の軽微な組織ドリフトがないかを確認しながら、30分から45分間のタイムラプス画像を収集します。抗体処理前の画像を適切な形式で保存し、その後、気泡が入らないように注意しながら、抗体混合液を1 mLの結核菌用注射器に吸い取ります。プランジャーをゆっくりと押し、針先に抗体溶液の液滴を形成させ、ステージ周囲のカーテンを上げてカテーテルを確認します。PBSのシリンジを抗体シリンジに交換し、抗体をカテーテル内にゆっくりと注入します。抗体の注入が完了したら、カーテンを再び下ろし、注入時刻を記録します。その後、抗体投与前のイメージングと同じ場所および装置設定を用い、直ちに20～40分間の新しいイメージングシーケンスの収集を開始します。最後に、抗体投与後のイメージングファイルを適切な形式で保存し、マウスを顕微鏡ステージから慎重に移動させ、動物が完全に回復するまで観察します。本プロトコルによる無傷の耳真皮のイメージングは、炎症を起こした真皮におけるエフェクターT細胞のダイナミクスの高解像度タイムラプス画像の取得を可能にします。この動画では、緑色で示された養子移入されたエフェクターT細胞が真皮組織全体を移動する様子が観察できます。しかし、カテーテルを介してanti-β1およびanti-β3インテグリン遮断抗体を投与すると、それまで移動していた細胞が真皮内で停止します。抗体投与後、細胞の平均速度が低下し、ともにメアンダリング指数（meandering index）も有意に低下することが示されています。すなわち、全変位量に対する全走行距離の比です。毛包からの自家蛍光、上層にある毛によるシャドーイングや自家蛍光、そして耳の表面とカバーガラスの間に閉じ込められた気泡は、すべてイメージングアーティファクトの原因となり、T細胞の可視化を妨げ、自動画像解析ソフトウェアに干渉します。加えて、複数の熱源を使用すると組織の安定性に問題が生じ、イメージング中に大きな振動が発生して結果の解釈を困難にすることがあります。この手順を正しく習得すれば、真皮内のCD4 T細胞のイメージングは2〜3時間で完了させることができます。本手順を行う際は、マウスを用いた実験に関する適切な動物愛護および使用ガイドラインに従うことが重要です。また、本手順は、感染モデルや炎症誘発方法を変更することで、耳における他のT細胞サブセットや免疫細胞種の可視化にも応用可能です。イントラバイタルイメージングの開発により、免疫学分野の研究者は、生体動物内における進行中の免疫応答のダイナミクスを探索することが可能になりました。マルチホスファーレーザーの使用は極めて危険であるため、この手順を行う際は、適切な遮蔽などの予防策を常に講じてください。このビデオを視聴することで、マウスの耳真皮に炎症を誘導する方法、および抗体投与前後におけるCD4 T細胞活性のタイムラプス画像をイントラバイタルイメージングで撮影する方法について、十分に理解することができます。

imaging-cd4-t-cell-interstitial-migration-in-the-inflamed-dermis

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

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In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

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学ぶ炎症性皮膚におけるCD4陽性T細胞の動態可視化法。マウス耳介真皮を用いた低侵襲的イメージング技術で、免疫細胞の運動メカニズムをin situで解析し、免疫学研究に貢献します。

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

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