Name: siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞の減数分裂紡錘体評価法。免疫蛍光分析で紡錘体形成と染色体分配機構を解明し、生殖生物学研究に応用する。

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この研究は、ジョージア大学と国立衛生研究所からのMMVへの助成金（HD071330によって部分的に支援されました。

このプロトコルは、ジョージア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.準備<ol><li>卵母細胞培養、購入やたての最小必須培地（MEM）を調製し、 表1で説明したように3 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）で補うために。ロードバランス（ゼロに風袋）にポリスチレンボトルを置きます。ためには、BSAを除き、全ての試薬を追加し、250グラムの合計重量のMQ水で最終体積を持ち出します。その後、BSAを追加し、溶解し、フィルター滅菌することができます。 注：記載のMEM培地を、5％CO 2、5％O 2および90％N 2の医療用ガスの混合物で平衡化し、細胞のインキュベーションを必要とします。しかしながら、他の媒体（例えば、CZB）は大気条件下、5％CO 2での細胞のインキュベーションを可能に使用することができます。 </li><li>卵母細胞のマイクロインジェクションのために、購入またはM2培地を準備します。 </li><li> Pを準備します5 IU / 100μlの濃度に君臨するの牝馬の血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）。 </li><li> 1μMの作業濃度に対するsiRNAの株式を購入し、再構成します。 </li></ol> 2.マウス卵母細胞のコレクション<ol><li> 1日目：卵胞の発達を刺激し、排卵前卵胞の数を増やし、前卵母細胞のコレクションに雌マウスの腹腔内に48時間をPMSGの5 IUを管理します。 </li><li> 3日目：卵母細胞の収集および培養のためには、1 / mlのミルリノンを補足したMEM / BSAの3 mlを35mm培養皿を設定します。このホスホジエステラーゼ阻害剤は、前期-I停止に卵母細胞を維持し、胚胞崩壊（GVBD）を防ぐことができます。少なくとも15分間、医療ガス混合物中の培養皿を平衡化。 注：ミルリノン補充した培地は、卵母細胞の収集だけでなく、卵母細胞のマイクロインジェクション、24時間培養ホールド期間後のsiRNA全体で必要とされます。 </li><li> 15を実践確立実験室を使用した雌マウスから卵巣を取得し、予め温めておいて、新しい培養皿に移し、MEM / BSA /ミルリノンを平衡化しました。 </li><li>卵母細胞の収集のための実体顕微鏡のステージ上で培養皿を置きます。リリース卵丘卵母細胞複合体（COCの）手動で27 G針で胞状卵胞を穿刺することによって。 1mlシリンジに取り付けた27 G針で、培養皿の底に1卵巣を修正し、すべての大型卵胞を穿刺するために第2の針を使用しています。各卵巣のために繰り返します。 </li><li>コンパクトな卵丘細胞の2以上の層に囲まれているすべての卵母細胞を収集し、標準的な口のピペット操作手順や卵母細胞吸引の他の手段を使用します。新しい皿にCOCのを移し、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>慎重に750μlのの吸引量に設定した1mlピペットを用いて繰り返し穏やかにピペッティングすることにより周囲の卵丘細胞を除去。ピペッティングのステップを約12回繰り返します卵母細胞を5分間回復することができます。卵丘細胞のすべてまたは大部分が除去されるまで、このように続けます。別の培養皿に剥皮した卵母細胞を移し、37℃で15分間平衡化することができます。 </li><li>使用される3つの実験群に露出した卵母細胞を割り当てる：目的の標的に対する特異的siRNA（I）のマイクロインジェクション、非特異的（対照）siRNAの（ii）のマイクロインジェクション、および（iii）非注射対照群を説明するために培養条件。 </li></ol> 3.卵母細胞のマイクロインジェクション<ol><li>卵母細胞のマイクロインジェクションのためのミルリノン（1μg/ ml）で補足した3ミリリットルM2培地で培養皿を設定します。洗浄、注入した卵母細胞のその後の培養のために、MEM / BSA /ミルリノンを含む培養皿を準備します。 注：M2培地は、HEPESバッファー含まれており、大気条件下で37℃で15分間プレ加温が必要です。 MEMは、説明するように、医療ガスを用いて予備温暖化と平衡化を必要とします上記日間。 </li><li>マイクロインジェクションシステムを準備します。 1μMの特異的siRNA溶液5μlの注射針をロードします。マイクロインジェクションシステムのマイクロマニピュレーターにホールディングピペットや注射針を固定し、較正容積と圧力で射出装置を設定します。 </li><li> 3センチメートル培養皿の蓋の内側にM2培地の200μlのマイクロドロップを置き、マイクロインジェクションシステムの設定や位置合わせのための卵母細胞を追加します。 </li><li>ガイドとして、卵母細胞を用いて、保持し、注射針の位置を調整します。優しく卵母細胞を固定し、セルの最も広い直径に注射針の位置を調整するホールディングピペットに負圧を適用します。どこでも卵母細胞の細胞質にsiRNA溶液の約10 PLのマイクロインジェクションを許可するように設定を調整します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> 図1.卵母細胞のマイクロインジェクションは、設定します。（ <stroNG&gt;それぞれ左右、上に位置するホールディングピペットや注射針で3センチ培養皿から蓋に配置されたM2培地の200μlのマイクロドロップのA）代表画像。 （B）グループは、前期の-Iは、マイクロインジェクションの前に卵母細胞（GV段階）を逮捕した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </li><li>実体顕微鏡のステージに蓋を戻し、新鮮M2培地200μlのマイクロドロップを追加します。マイクロインジェクションステージにマイクロドロップで蓋を戻した後、口のピペット操作によってマイクロドロップ、または代替方法に卵母細胞のグループ（〜10）を追加します。 <ol><li>個々の卵母細胞を顕微注入するために進んでください。ゆっくりと細胞質に注射針の先端を挿入し、保持ピペットで1卵母細胞を固定し、siRNA溶液の注入量を追放。慎重に注射針やMOを撤回マイクロドロップの底の位置に注入された卵母細胞をVEの。マイクロドロップの上部の位置に失敗した注入した卵母細胞を移動します。 </li><li>各卵母細胞にマイクロインジェクションの手順を繰り返します。一度に最適な卵母細胞の生存率、卵母細胞の顕微注入するだけの小さな数を維持するために。このプロセスは、マイクロドロップ内の温度およびpH変化を防止するために、数分以上を取らないことを確認してください。 </li></ol></li><li>吸引除去に成功した卵母細胞を注射するか、または慎重に実体顕微鏡に注入した卵母細胞のマイクロドロップで蓋を移動します。 37℃で洗浄し、平衡化するMEM / BSA /ミルリノン媒体に、口のピペッティングまたは代替の方法で注入した卵母細胞生存能力を転送します。 </li><li>卵母細胞の別のグループを使用して、対照群の非特異的なsiRNAを装填新しい注射針を用いてマイクロインジェクションプロセスを繰り返します。独立した培養皿にMEM / BSA /ミルリノン、転送中の卵母細胞を洗います。 </li><li>文化すべてのグループ医療ガスの雰囲気下、37℃でMEM / BSA /ミルリノンで24時間卵母細胞。 注：「ミルリノンブロック「培養期間は、効率的な標的mRNA /タンパク質の枯渇のために必要とされます。 </li></ol>減数分裂成熟4.卵母細胞の培養<ol><li> 4日目：卵母細胞の各実験群については3ミリリットルMEM / BSAとセットアップ4培養皿（35ミリメートル）。卵母細胞の成熟のために使用する10％（高品質）ウシ胎児血清（FBS）とグループごとに1つのメディア皿を補います。すべての培養皿は、医療ガス混合物で、37℃で平衡化することを許可します。 </li><li> 「ミルリノンブロック」から卵母細胞を解放するには、順次、MEM / BSAを含む皿に卵母細胞を3回洗浄した後、10％FBSを含む培地を含む成熟皿に卵母細胞を移します。文化37℃で17時間、すべての卵母細胞群は、再開と減数分裂の進行を可能にします。 </li><li> 5日目：卵母細胞のFIXaのためのソリューションを準備ンを含む：（I）PEM緩衝液中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）（100mMのPIPES [pHは6.9]、1mMのMgCl 2、1mMのEGTA）、0.5％のTriton-X 100、および（ii）PBS、5を補充したと卵母細胞を洗浄し、ブロックするために使用される％FBS。 注：これらのソリューションは、従来の卵母細胞の固定を37℃に予備加温する必要があります。 </li><li> （4ウェルディッシュの）卵母細胞の固定は（17時間の培養後）、速やかに個々のウェルに口ピペッティングまたは代替の方法により卵母細胞の各実験群を転送予め温めておいた4％PFA溶液を750μLを含有し、37℃でインキュベートについて1時間Cを°。その後、5％FBSを含む予め温めておいたPBS750μlの中で3回（各15分）の卵母細胞の各グループを洗います。 </li><li> 4℃で200μlのPBS / 5％FBS、O / Nでのブロックの卵母細胞は、非特異的結合する抗体を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 5.免疫蛍光分析<ol><li> 6日目： 注：免疫染色は、マルチウェルプレートとOOCで行われますytesが直列それぞれの抗体および洗浄溶液を含む、連続的なウェルに移しています。いずれかの48または96ウェルプレートを使用することができ、単によく大きさに基づいて液量を調整します。 96ウェルプレートについて、ウェル当たり200μlのを使用しています。 - 3洗浄ウェル - 二次抗体溶液 - 3洗浄井一次抗体溶液：卵母細胞は、次の順序でさまざまなソリューションに転送されます。露光量を制限するために、プレートをホイルで覆うことができます。 新しいPBS / 5％FBSを準備し、抗体希釈液（例えば、ウサギ抗ペリセントリン（1 /千）、マウス抗チューブリン（1 / 1,000））を調製し、この溶液を使用してください。 </li><li>一次抗体溶液の（より少ない容量が必要な場合、または100μl）を200μLを含む個々のウェルに各実験群の固定卵母細胞を移し、よくパラフィルムでカバーしています。 （1時間、または4°のCO / Nのために例えば、37℃）、最適な抗体固有の条件に従ってインキュベートします。 注：一次抗体dilutioN並びに特定のインキュベーション時間および温度は、使用される種々の抗体についての最適な条件を決定するための試験を必要とします。 </li><li>一次抗体とのインキュベーション後、PBS / 5％FBS（10〜15分毎）​​に卵母細胞を3回洗浄します。 </li><li>蛍光結合二次抗体 （例えば、1 /千の異なる波長の蛍光色素と結合した抗ウサギおよび抗マウス抗体の希釈物）を含有する溶液中に卵母細胞を移します。 37℃で1時間インキュベートします。 </li><li> （ - 15分毎10）をPBS / 5％FBS中で卵母細胞を3回洗浄します。 </li><li>最後の洗浄工程の後、清浄なガラススライド上に卵母細胞を転送し、優しく余分な洗浄液を吸引除去します。これは、ガラス表面上の卵母細胞を固定します。メディア（DAPIを含む）を搭載した8μlを添加して、慎重に22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップでマウントメディアを重ねます。気泡を捕捉および/または卵母細胞の損傷を防ぐために、ゆっくりとカバースリップを下げます。 注：または、前のスライドに取り付けるにカバースリップの角に（ワセリンと混合）100μmのガラスビーズの小さなボリュームを追加、共焦点顕微鏡分析のための卵母細胞の3次元特性を維持します。 </li><li> 4℃で保存したスライドは、または減数分裂の進行を評価するだけでなく、使用した二次抗体を一致させるために必要なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて発現レベルおよび細胞内タンパク質の局在の分析に進みます。 </li></ol>

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</ol>

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そのようなエレクトロポレーション及びトランスフェクションのような体細胞への外因性核酸の転写のための複数の方法があるが、マイクロインジェクションは、転写休止マウス卵母細胞へのRNA分子の送達のための最適な方法です。現在のプロトコルは、異なる主軸および/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能テストを可能にする特定のmRNAのインビトロ枯渇のための効果的なアプローチを提供します。このアプローチは、効率的な転写産物の枯渇をもたらし、非常に適応可能です。 siRNAは特にPCNT転写産物を標的とするために使用されたが、同様の条件は、目的のほとんどすべての遺伝子を標的化するために使用することができます。 卵母細胞の収集、文化や操作など、このプロトコルのいくつかの態様は、卵母細胞の品質を維持するためと技術的成果物を避けるために、練習と経験が必要です。培地のpH及び/又は温度の変動は、作業eで避けなければなりませんxpediently、慎重に。卵母細胞の小グループのマイクロインジェクション、およびマイクロインジェクションシステム内の加熱されたステージ...

減数分裂は、配偶子（卵母細胞および精子）で発生する独特の分割処理であり、それぞれ1、減数分裂Iと減数分裂IIの間に相同染色体と姉妹染色分体を分離するためにDNA合成を介在せずに2つの連続した部門が関与します。卵母細胞における減数分裂時の染色体分離におけるエラーは受精胚中に継承され異数性をもたらすことができます。特に、発展途上胚における異数性の発生率は、母体の加齢に伴って増加し、女性1,2における妊娠損失だけでなく、先天性の先天性欠損症の主な原因である、したがって、減数分裂時の異数性の分子基盤を理解するための重要な必要性を強調。 細胞分裂の間、染色体分離は反対スピンドルへの正しい取り付けのための微小管スピンドル装置と安定した染色体微小管の相互作用の確立の組み立てに決定的に依存していますポール。重要なことは、哺乳動物の卵母細胞における減数分裂紡錘体の形成は、体細胞での有糸分裂とは異なり、中心小体3,4を欠いているユニークな微小管組織化センター（MTOCs）によって規制されています。微小管の核形成と組織のために必要不可欠なタンパク質は、微小管集合を触媒するγチューブリンを含む卵母細胞MTOCs、に局在します。また、MTOCs 5でバインド必須の足場タンパク質として機能し、アンカーγチューブリン、ならびにその他の要因ペリセントリン。注目すべきことに、我々の研究は、キーMTOC関連タンパク質の枯渇が減数分裂紡錘体の組織を破壊し、完全に紡錘体チェックポイント（SAC）6,7によって解決されていない卵母細胞における染色体分離のエラーにつながることを示しています。したがって、減数分裂の停止を誘発しないスピンドル安定性の欠陥は、異数性に貢献において重要なリスクをもたらします。スピンドルアセンブリと組織内での重要な役割、卵母細胞MTOC protのにもかかわらず、EIN組成と機能が十分に理解されたままになります。 細胞が減数分裂まもなく8,9の再開前に、転写的に静止してしまうなどの哺乳動物の卵母細胞に特異的な標的タンパク質の機能をテストすることは、困難です。したがって、排卵前の卵母細胞が減数分裂を再開し、受精10,11の後に減数分裂と同様に最初の切断部門をサポートするために母性mRNAの店に依存しています。哺乳動物の卵母細胞中のmRNA転写物のRNA干渉（RNAi）介在性分解の有効性は、十分に確立され、減数分裂成熟の間の翻訳のために募集母性RNAは、siRNAが12-14を標的に特に適しています。したがって、卵母細胞への短い干渉RNA（siRNA）のマイクロインジェクションは、機能テストのために標的mRNAを枯渇させる貴重なアプローチを提供します。 ここでは、マウス卵母細胞及び特定transcriのsiRNA媒介枯渇を単離するための方法を記載PTSはペリセントリン、本質的​​なMTOC関連タンパク質の機能をテストします。加えて、我々は、卵母細胞における減数分裂紡錘体形成を評価するために免疫蛍光分析条件を記述する。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium(MEM)</td><td></td><td></td><td>*表1に概説されているレシピ</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム重炭酸</td><td>Σ</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸・ナトリウム塩&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンG、カリウム塩&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム塩二水和物&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>必須アミノ酸 (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEMビタミン混合物(100x)</td><td>シグマ</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド溶液</td><td>シグマ</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマ</td><td>A1470</td><td></td></tr>ミル<tr><td>リノン</td><td>シグマ</td><td>M4659</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2培地(ヘプス付き</td>)<td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs 標的 Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (16% 溶液)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチラビット アレクサ フルーア 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウス アレクサ フロー 555</td><td>インビトロジェン</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>主要機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡 (SMZ 800)</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アップライト 蛍光顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet マイクロインジェクションシステム</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションニードル (フェムトチップ)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>ホールディングピペット (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培養皿</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA フィルターシステム</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

sirna媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

配偶子の減数分裂中の染色体分離のエラーは、受精時に胚に伝染する異数性につながる可能性があります。発生中の胚に生じる異数性は、流産やダウン症候群などの先天性先天性欠損症の主な原因として認識されています。正確な染色体分配は、微小管紡錘体装置の形成に大きく依存していますが、このプロセスは哺乳類の卵子では十分に理解されていません。興味深いことに、減数分裂紡錘体は有糸分裂とは異なり、少なくとも部分的には、独自の微小管組織化センター(MTOC)によって調節されています。MTOC関連タンパク質の評価は、減数分裂紡錘体の形成と組織化を支配する制御メカニズムに関する貴重な洞察を提供することができます。ここでは、siRNAを介したテスト機能を用いて、マウス卵子を単離し、MTOC関連タンパク質を枯渇させる方法について説明します。さらに、減数分裂紡錘体の形成と組織を評価するための卵子固定および免疫蛍光分析条件について説明します。

siRNAのマイクロインジェクションは、in vitroで異なるターゲット因子の効率的かつ高度に特異的な機能テストを可能にした卵母細胞におけるmRNAの分解及びその後のタンパク質の枯渇に有効なアプローチを提供します。その後、免疫蛍光は、特定の表現型分析のために使用されるだけでなく、siRNAを注入した卵母細胞中のタンパク質の枯渇を検証します。現在の例では、抗チューブリンおよび抗ペリセントリン抗体とともにDAPIで個々の卵母細胞の蛍光標識有効：だけでなく、ペリセントリン枯渇の（ⅰ）確認（ii）のコントロールの両方のクロマチンと減数分裂スピンドル構成を総合的に評価し、 PCNT -枯渇した卵母細胞。 非特異的コントロールまたはPCNTのsiRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞の代表的な免疫蛍光画像は、図2〜図7に示されている。17時間の培養後、ほとんどの制御卵母細胞は中期-IIのクワガタに達しました整列した染色体と紡錘体極の明るいペリセントリン標識（ ...

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

本手順の全体的な目的は、perrinなどの主要なMTOC関連タンパク質をirnaによって枯渇させた後の、Cytesにおける紡錘体の形成と組織化を評価することです。この手法は、染色体分離を調節するメカニズムや、あらゆる部位で異数性を引き起こす潜在的な分断など、生殖生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、個々のcytesに対して効率的な転写物ノックダウンおよび特異的な免疫蛍光分析が可能になることです。この手順は、ほぼあらゆる標的タンパク質の研究に適応させることが可能です。卵子採取日の48時間前に、採取に使用する雌マウスに5 international unitsのPMSGを腹腔内注射します。標準的な手法で卵巣を採取した後、BSAとmil reoneを添加し、あらかじめ加温して平衡化したMEM培地を入れたディッシュに移し、解剖顕微鏡下で卵子を分離する準備をします。27ゲージの針を用いて卵巣を培養皿の底に固定し、別の針で卵胞腔を穿刺して、卵子吸引または標準的なマウスピペッティング法により、卵丘細胞・卵子複合体（COC）を回収します。2層以上の緻密なキュムルス細胞に囲まれた卵母細胞を回収します。これらのCOCをM-E-M-B-S-A mild reoneを入れた新しいディッシュに移し、37 °Cで1時間インキュベートします。その後、標準的な方法に従って卵母細胞の除細胞（denuding）を行います。3 mLのM2培地に1 µg/mLのmiloneを加えたものを注入用培養皿に準備します。また、洗浄用および培養用の皿にMEM BSA miloneを準備します。次に、1 mMのINA溶液 5 µLを注入針に充填し、マイクロインジェクションの準備を整えます。次に、3 cmディッシュの蓋の上にM2培地を100 µL滴下します。そこに卵母細胞を1個導入し、ホールディングピペットの位置を調整します。陰圧を用いて卵母細胞をホールディングピペットに吸着させ、OAS部位を固定します。次に、注入針の位置を卵母細胞の最も直径が大きい部分に合わせます。位置が決まったら、核を避けて卵母細胞の細胞質に約10 picolitersの溶液を注入します。実体顕微鏡のステージに蓋を戻し、100 microlitersの新鮮なM two培地を加えます。約10個の卵細胞を培地に置きます。その後、マイクロインジェクションステージにて、マイクロインジェクションを行います。ホールディングピペットで各卵細胞を固定し、注入針を細胞質にゆっくりと挿入します。S irna溶液を注入し、注入用ピペットを慎重に回収します。注入に成功した細胞を液滴の一端へ、注入に失敗した細胞を反対側の端へと移動させます。細胞の生存率を維持するため、10個の細胞への注入を数分以内に完了させることが重要です。蓋を実体顕微鏡のステージに移動させ、注入に成功したすべての細胞を37°Cに温めたM-E-M-B-S-A培地のディッシュに移します。細胞を医療用ガス雰囲気下の37°Cインキュベーターに移し、24時間培養します。まず、M-E-M-B-S-Aで細胞を3回洗浄し、細胞をマトリゲルブロックから遊離させます。その後、細胞を10% FBS含有成熟培地に移します。細胞を37°Cで17時間培養することで、翌日に減数分裂が再開します。細胞を固定します。細胞吸引またはマウスピペッティングを用いて、異なる実験群を、あらかじめ温めておいた 4% PFA 750 microliters が入った 4 ウェルプレートの各ウェルへ迅速に移動させます。その後、細胞を 1 時間インキュベートします。5% FBSを含む加温したPBS 750 µLで、各群を3回洗浄します。各洗浄後、インキュベーター内で15分間静置してください。その後、BS中の5% FBSを用いて各Oサイト群をブロッキングします。免疫染色を行うため、4 °Cで一晩ブロッキングしてください。マルチウェルプレートの8ウェルの1列を、細胞の各実験群に使用します。4枚の96ウェルプレートの各ウェルに、溶液を200 microlitersずつ分注します。新鮮に調製した一次抗体溶液を用いて染色工程を開始してください。その後、ウェルをパラフィルムで密閉し、一次抗体後の抗体仕様に従って細胞をインキュベートします。PBSで希釈した5%FBSを用いて、細胞を1回につき10〜15分間、計3回洗浄します。3回の洗浄後、細胞を二次抗体溶液が入ったウェルに移します。これらのウェルをパラフィルムで覆います。細胞を37°Cで1時間インキュベートし、その後、前述と同様に3回洗浄します。洗浄後、卵母細胞を清潔なガラススライドに転移させます。1つの実験群のすべての卵母細胞は、1枚のスライドに転移させます。細胞を固定するために余剰な溶液を吸引し、すぐに封入剤を含むdappy 8 µLを添加します。その後、気泡の混入や細胞への損傷を避けるように注意してカバーガラスを被せます。非特異的コントロールまたはperrin miRNAをマイクロインジェクションした細胞を17時間培養したところ、ほとんどのコントロール細胞が中期2期に達し、染色体が整列した組織的な有糸分裂紡錘体が形成されていました。赤色で示されるPerrinの標識は、紡錘体極において明瞭かつ集中的に観察されました。irnaを注入した細胞ではペリン染色が検出されなかったため、転写産物は正常にノックダウンされた。これらの卵細胞の大部分は第一減数分裂中期に留まり、染色体が整列していない乱れた紡錘体構造を示した。一部は第二減数分裂中期まで進行したが、同様に紡錘体の崩壊が認められた。これで、マウス卵細胞の回収、特定のsiRNAのマイクロインジェクション、およびスピンドル形成と組織化の蛍光解析のための免疫染色の方法について十分に理解できたはずです。卵細胞の生存率と品質を維持するためには、迅速かつ細心の注意を払って作業することが重要であることを忘れないでください。

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学ぶ siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞の減数分裂紡錘体評価法。免疫蛍光分析で紡錘体形成と染色体分配機構を解明し、生殖生物学研究に応用する。

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

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