「ヒト化」を生成ショウジョウバエ S2細胞株

この実験の全体的な目標は、キネシン-5モーターの低分子阻害剤に感受性のあるショウジョウバエS2細胞株を作製し、エラー訂正の研究に使用できるようにすることです。細胞分裂中のエラー訂正は、誤った動原体と微小管の相互作用を脱確立して、細胞に適切な付着を形成するセカンドチャンスまたは別の機会を与えるプロセスであり、ゲノムを適切に分離することができます。この方法は、エラー訂正プロセスに関連する細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、染色体が少なく、キネシン-5阻害剤に感受性のあるショウジョウバエS2細胞株を使用できることです。これにより、個々のエラー訂正イベントの視覚化が容易になります。S2細胞を発現する100%コンフルエントなGFP-Alpha Tubulinの以前に培養した25cm四方のフラスコから始めて、2ミリリットルの培養物を35ミリメートルの皿に移します。その後、細胞を室温で約1時間インキュベートし、セミ接着させます。

皿から培地を取り出し、FBSを添加したシュナイダー培地1ミリリットルを2マイクログラムのEg5-mCherryコンストラクトおよびトランスフェクション試薬に加え、メーカーのプロトコルに従って細胞をトランスフェクションします。パラフィルムを使用して皿を密封し、細胞を摂氏25度で16〜18時間インキュベートします。次に、1ミリリットルのシュナイダー培地を加え、細胞をインキュベーターに戻します。

トランスフェクション後3日目に、トランスフェクションした細胞500マイクロリットルを、1.5ミリリットルのシュナイダー培地を含む新しい35ミリメートル組織培養皿に移し、試験導入を行います。Eg5-mCherryの発現を誘導するには、最終濃度500マイクロモルまで硫酸銅を添加します。皿をパラフィルムで密封し、摂氏25度で一晩インキュベートします。

あらかじめ調製した22 mm x 22 mmのConcanavalin Aコーティングカバースリップを、清潔な35 mm組織培養皿に入れます。次に、100%コンフルエントに誘導された細胞の500マイクロリットルをカバースリップに播種し、細胞を室温で接着させます。Eg5-mCherryの発現を確認するには、テキストプロトコルのガイドラインに従って、カバースリップを室温で培地および画像を含むローズチャンバーに組み立てます。

細胞がEg5-mCherryとGFPαチューブリンの両方を発現していることを確認した後、トランスフェクションした非誘導細胞の残りを、4ミリリットルのシュナイダー培地を含む25cm四方の組織培養フラスコに移します。フラスコに最終濃度25マイクログラム/ミリリットルのブラストシジンS HCLを添加し、細胞死が止まるまでブラストシジンS HCLの存在下で細胞の分割を続けます。テキストプロトコールに従ってKLP61F二本鎖RNAを調製した後、Eg5-mCherryを発現するS2細胞を35mm培養皿に25%の密度で播種し、1時間接着させます。

培地を皿から取り出し、1ミリリットルの無血清シュナイダー培地と5マイクログラムの二本鎖KLP61F RNAを加えます。室温で1時間インキュベートした後、10%FBSを含むシュナイダー培地1ミリリットルを加えます。細胞を摂氏25度でインキュベートします。

dsRNA処理の24時間後、500マイクロモルの最終濃度まで硫酸銅を添加することにより、Eg5-mCherryの発現を誘導します。細胞を摂氏25度でさらに24時間インキュベートします。生細胞イメージングを行うには、22 mm x 22 mmのConcanavalin Aコーティングカバースリップを清潔な35 mm組織培養皿に入れます。

一晩誘導されたdsRNA処理細胞の500マイクロリットルをカバースリップに播種し、約1時間接着させます。テキストプロトコルに従ってバイポーラスピンドルのタイムラプス画像を収集した後、ローズチャンバーから培地を取り出し、1マイクロモルSTLCを含むシュナイダー培地を追加し、STLC培地をさらに2回交換し、洗浄のたびに培地を廃棄してスピンドルの崩壊を視覚化します。薬剤を洗い流し、逆紡錘体崩壊を起こすには、STLC含有培地をローズチャンバーから慎重に取り出し、廃棄物容器に廃棄し、合計6〜8ミリメートルのシュナイダー培地を使用して細胞を4回洗浄し、各洗浄後に培地を廃棄します。

次に、チャンバーを補充するために新しい培地を追加した後、イメージングを続けます。薬物の洗浄とウォッシュアウトのための培地にアクセスするには、顕微鏡に固定した状態で、ローズチャンバーからトップカバースリップを慎重に取り外します。あるいは、カバースリップと同様にConcanavalin Aで処理されたガラス底のペトリ皿を生細胞イメージングに使用することができる。

KLP61F dsRNAで処理した500マイクロリットルのS2細胞をConcanavalin Aカバースリップに播種し、細胞を接着させた後、1.5ミリリットルのシュナイダー培地を加えて、最終容量を2ミリリットルにします。テキストプロトコルに従って細胞が有糸分裂で停止したら、1マイクロモルSTLCを添加し、1時間インキュベートしてモノポールが形成されます。2ミリリットルの新鮮なシュナイダーのメディウムを使用して、カバースリップを3回すすいでSTLCを洗い流します。

バイポーラ紡錘体形成の異なる時点で細胞を固定し、動原体の付着部位を評価するには、まず2ミリリットルの1X BRB80を使用してカバースリップを迅速にすすぎます。ケミカルフードに、1X BRB80に2ミリリットルの10%PFAを加え、10分間インキュベートします。次に、細胞を透過処理するために、1X PBSに1%Triton Xを添加し、10分間インキュベートします。

次に、1X PBS中の2ミリリットルの0.1%Triton Xを使用して、細胞を3回洗浄します。次に、セル側を上にしてカバースリップを150ミリメートルのペトリ皿のパラフィルムのシートに移します。150マイクロリットルのボイルドドンキーセラム(BDS)をカバースリップに加え、室温で1時間インキュベートして非特異的抗体の結合をブロックします。

インキュベーション後、ブロックを取り外し、テキストプロトコールに従って調製した150マイクロリットルの一次抗体を加えてから、室温で1時間インキュベートします。カバースリップを3回洗浄した後、BDSで希釈したFluoro-4標識二次抗体を添加し、室温で30〜60分間インキュベートします。カバースリップを3回洗浄したら、DAPI1ミリリットルあたり1マイクログラムを含む150マイクロリットルのBDSと5分間インキュベートします。

次に、カバースリップを2回洗浄した後、8マイクロリットルの封入剤を使用して、サンプルをセル側を下にして3×1インチのスライドにマウントします。マニキュアを使用して角をペイントします。最後に、100倍対物レンズを使用して、Eg5-mCherryを発現するバイポーラスピンドルを持つ細胞をイメージングします。

すべてのチャネルで0.2マイクロメートル間隔で30の平面で構成されるZシリーズを取ります。動原体と微小管を慎重に分析して、付着状態を判断します。KLP61Fは、ショウジョウバエS2細胞でバイポーラ紡錘体を形成するために必要です。ただし、低分子のキネシン-5阻害剤はそれに対して効果がありません。

これらの画像は、ヒトのキネシン-5 Eg5がショウジョウバエS2細胞のKLP61Fの機能を救うことができることを示しています。キネシン-5阻害剤であるSTLCを添加すると、モーターの微小管関連レベルが低下し、紡錘体が崩壊し、RNAの成功の結果として内因性KLP61Fを欠く細胞にモノポールが生じます。この図は、キネシン-5の阻害が薬物を洗い流すことで逆転し、バイポーラ紡錘体の回復を経時的に追跡できることを示しています。阻害剤が除去されると、Eg5-mCherryは微小管と再会合し、細胞はバイポーラ後期に進行する可能性があります。

このビデオを見れば、キネシン-5の低分子阻害剤に感受性のあるショウジョウバエS2細胞株の作製方法について十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約6時間で実行できます。この手順を試行するときは、数日前に準備する必要があるため、事前に計画を立てることが重要です。

低分子阻害剤の取り扱いは危険な場合があるため、常に手袋を着用することを忘れないでください。ヒト化ショウジョウバエ細胞の構築は、Crispr-Cas 9技術を適用し、ショウジョウバエキネシン-5をヒトに置き換えることで証明できます。ヒト化ショウジョウバエ細胞の開発は、将来、エラー訂正やその他の重要な細胞プロセスの理解を前進させるはずです。