Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

PSmOrange写真変換技術の全体的な目標は、胚発生と疾患中の生きた動物の細胞を追跡することです。この手法は、組織や臓器に発展する細胞の起源を明らかにするなど、発生生物学における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、GFPトランスジェニックバックグラウンドに適用できることです。

この方法は、再生、腫瘍の進行、浸潤など、さまざまな研究分野にも適用できます。テキストプロトコルに従ってPSmOrangeおよびGFP発現胚を作製し、包埋した後、胚を共焦点顕微鏡の下に置き、20倍対物レンズと488および561ナノメートルレーザーを使用して標本をスキャンし、光変換する領域を特定します。光変換前にPSmOrangeタンパク質を検出するには、対物レンズの上の焦点面で測定した0.74ミリワットの出力で561ナノメートルのレーザーを使用し、必要に応じてレーザー出力を調整します。

ズーム係数を調整して、関心のある領域を強調表示し、画像取得時間と写真の毒性を減らします。488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーをシーケンシャルモードと1.0〜2.0マイクロメートルのZステップで使用して、目的の構造をカバーするZスタックを取得します。ライン平均とスキャン頻度を調整して、画質を最適化します。

次に、サンプルをスキャンして関心領域、またはROIツールを選択し、ROIを刺激領域として固定する前に、光変換する領域を強調表示します。光活性化漂白モジュールを選択し、ボックスをチェックして488ナノメートルレーザーをアクティブにし、488ナノメートルレーザーを80%に設定し、スキャン速度をフレームあたり0.5秒に設定します。次に、写真変換ユーティリティを開き、[追加]をクリックして写真変換プロトコルを指定します。

取得刺激メニューで、フェーズ1を取得に設定し、ループメニューで、光変換前に取得する画像の数を指定します。フェーズ 2 を刺激に設定し、実行する刺激イベントの数を入力します。フェーズ 1 の説明に従って、フェーズ 3 を調整します。

必要に応じて、画像取得の最後のラウンドの前に待機する時間を入力して、フェーズ 2 の後に待機フェーズを挿入します。パラメータを設定したら、刺激設定を適用し、光変換を実行します。ミスクロスコープの設定は、PSmOrange写真変換に不可欠です。

光変換を成功させるために、実験の直後に胚を画像化して、光変換されたPSmOrangeタンパク質を検出します。変換が成功しなかった場合は、この手順が繰り返されます。488、561、640ナノメートルのレーザーを使用し、640ナノメートルのレーザーを最大4.5ミリワットの高出力に設定すると、前述の設定で最終的なzスタックが得られます。

胚を取り外すには、顕微鏡からチャンバーを取り外し、鉗子を使用して胚をアガロースから取り出します。胚を、E3に0.2ミリモルPTUを含む新しい滅菌プラスチックペトリ皿または滅菌6ウェルプレートに移します。胚を摂氏28度で所望の発達段階までインキュベートします。光変換されたPSmOrangeタンパク質発現細胞の運命を解析するには、テキストプロトコルに従って胚を再埋め込みします。

共焦点ミスクロスコープで標本をスキャンし、目的のGFPトランスジェニック構造内の光変換細胞を同定します。488、561、および640ナノメートルのレーザーを使用して、構造を覆うシーケンシャルモードで1〜2マイクロメートルの固定スタックを持つzスタックを取得します。Image J Fijiソフトウェアを使用して、GFPと光変換タンパク質を共発現する細胞を同定します。

元のスタックを複製し、Gaussian Blurプラグインと画像計算機を使用して、元のスタックから滑らかなスタックを差し引きます。光変換されたセルを強調表示するために、緑と遠赤のチャンネルに特定のしきい値を適用します。次に、パーティクルの解析ツールを使用して、適切な設定で緑チャンネルのしきい値領域を検出します。

ファーレッドチャンネルに対してこの手順を繰り返します。画像計算機プラグインを開いて、共局在するセルを検出します。重なり合う ROI を緑または遠赤のチャネルに黄色で表示するには、[粒子の分析] ツールを使用します。

NIS-Elementsソフトウェアを使用して、3D日付評価を実行し、Show Volume Viewオプションを使用してスタックを3Dで表示します。次に、グラフィックインターフェイスを使用して、緑、赤、遠赤のチャンネルを選択し、明るさとコントラストを調整し、3Dスタックを切り抜いて写真変換された領域を強調表示します。ここに示されているのは、ゼブラフィッシュのトランスジェニックFOXD3フローティングヘッドGFP胚におけるPSmOrange光変換システムの例です。

受精後26時間で、松果体の前部にある2つの細胞クラスターが光変換され、すぐに画像化されました。このタンパク質は、640ナノメートルの遠赤色レーザーで検出されましたが、561ナノメートルのレーザーでは検出されませんでした。これらの細胞では、GFPの発現は光退色のために最初に減少しました。

52 HPFでは、光変換されたH2B PSmOrangeタンパク質発現細胞でGFPおよびH2B PSmOrangeが検出されました。これらの細胞のいくつかは、脳の左側にパラパペリアルを形成しました。この結果は、前松果体におけるパラパイン細胞の起源に関する以前の報告と一致しており、生きたGFPトランスジェニック脊椎動物の胚におけるPSmOrange技術の適用性を示しています。

この手順に続いて、細胞の発達の根底にある分子階層に関する追加の質問に答えるために、遺伝子操作された胚で細胞追跡分析を実行できます。