Name: Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学ぶハイスループット自動クライオ電子断層撮影の効率的なデータ処理パイプライン構築法。SerialEMとtomoautoを統合し、Shigella flexneriミニ細胞などの試料で高解像度in situ構造解析を実現し、研究者が生物学的問いに集中できる革新的なワークフローを提供する。

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私たちはコメント博士ウィリアム・マーゴリンに感謝します。私たちは、博士からSerialEMのサポートに感謝しています。デビッドMastronardeとチェン徐。 DM、BHとJLは、ウェルチ財団から国立アレルギー感染症研究所、総合医科学研究所（NIGMS）から補助金R01GM110243とR01GM107629、グラントAU-1714からの助成金R01AI087946によってサポートされていました。直接電子検出器は、健康賞S10OD016279の国立研究所によって資金を供給されました。

1.ミニ細胞の準備<ol><li> S.を作成するにはフレクスナーミニ細胞は、構成的にスペクチノマイシン耐性プラスミド5μlのエレクトロストレプトマイシン耐性血清型5aの（M90T-SM）、エレクトロポレーションによって細胞に低コピーから大腸菌細胞分裂遺伝子ftsQ、ftsA、とのFtsZを発現するプラスミドpBS58、1μlのを変換します1ミリメートルのキュベット中で5ミリ秒のために2.5 kVの時。 </li><li> 1.5ミリリットル極低温マイクロチューブ中で15％グリセロール中で-80℃で保存するミニ細胞のサンプル。スペクチノマイシンとするとき使用するための準備ができて、ピペットチップを使用して解凍していないマイクロチューブからの細胞の約5μLをこすりし、4ミリリットル中に細胞を懸濁トリプシン大豆ブロスを、100μg/ mlの濃度に加えました。 37℃でO / Nを成長させます。 </li><li>ピペット再び100μg/ mlの濃度になるように追加されたスペクチノマイシンと1.2 200ミリリットルにトリプシン大豆ブロスからの培養の2ミリリットル。後期対数期に37℃で成長します。 </li><li>ミニセル、遠心分離機を豊かにします5分1,000×gで1.3からの培養の200ミリリットル。慎重に10分間20,000×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に上清画分を注ぎます。慎重にオフ注ぎ、上清画分を廃棄し、静かにピペットチップを使用して残りの液体とペレットを混合し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにペレット混合物の約100μlのを転送します。 </li></ol> 2. EMグリッドの準備<ol><li>スライドガラス上にR2 / 2穴あきカーボン膜200メッシュ銅グリッドの炭素側を上に置きます。 注：R2 / 2 200メッシュのグリッドは、依然として試料を支持し、カメラの視野内に炭素膜の端部を配置しながら、単一のグリッド正方形で取得するように設定することができ、チルト系列の数を最大化するように選択されます所望の倍率で。細かいグリッドは、メッシュや、R1.2 / 1.3 400メッシュのような小さい穴あきカーボンフィルムは、より高い倍率で撮像されたサンプルのために使用することができます。このようR3.5のような大きな穴あき炭素膜/ 1 200メッシュを使用することができますサンプルについてのdは低倍率で撮像または顕微鏡写真は、R1のようなより大きな間隔を有する炭素エッジとホーリーカーボン膜を含むべきではない場合は、/ 4、200メッシュの関心領域にステージを揃えるから地域を保護を支援するために使用することができます露出オーバーのルーチンをフォーカス及びトラッキングインチ</li><li>グロー放電装置におけるプラットフォーム上でスライドを置きます。 注：私たちは、陽極とプラットフォームは、真空デシケーター内に機械加工されており、高周波発生器によって供給されている社内のデバイスを使用しています。真空を作成した後、グリッドをグロー放電する1分間のプローブのアノードと電源に高周波発生器のプローブを接続します。グリッドをグロー放電に必要な時間は数秒から分の範囲とすることができます。グロー放電時間を変化させることのないガラス質氷で乾燥現れる検体濃度およびグリッドの問題を診断するために使用することができます。 </li><li>ピンセットのセットでグリッドを削除し、鉗子が弾性Bで閉鎖ロックそして。 </li><li> 1.4で製造したミニ細胞をマイクロ遠心チューブに10nmの金コロイド溶液100μlを加え、穏やかに指でチューブをフリックすることによって混合します。 2.2で製造したグリッド上の混合物の新しいピペット場所4μlの。 注：金コロイドは、サイズやケアの様々な利用可能ですが不明瞭な機能には大きすぎるものではないが、金の大きさは、取得した倍率で処理される顕微鏡写真のピクセルサイズ与えられた5ピクセル以上であることに注意しなければなりません興味を持っている。 </li><li>プランジ​​凍結装置を準備します。液体窒素で凍結外側の容器を満たす、次に液体エタンと内側室を埋めます。プランジ​​ャロッドにグリッドに鉗子を接続し、上昇位置にプランジャロッドをロックします。 注：商業プランジ凍結装置の使用を記載するプロトコルにイアンクら 20を参照してください。 </li><li>注意深くtに濾紙片に触れることによって、グリッドをブロット彼はその後すぐにグリッドを凍結、プランジャロッドを解放し、グリッドとろ紙分離して停止したろ紙上に吸い上げ間のメニスカスまでサンプルのドロップします。慎重にプランジャロッドから鉗子を除去し、グリッドホルダーにグリッドを配置します。 </li><li>液体窒素でローディングエリアと吸収ポンプ容器に充填することによりクライオEM転送ステーションを準備します。ローディングエリア一旦液体窒素温度の場所でグリッドホルダとローディングエリアにおける顕微鏡標本カートリッジです。 </li><li>慎重以前Polara顕微鏡以降のモデルでは、Cスタイルのクリップリング上の小さなネジ付きロックリングのいずれかであるロックリングを取り外します。鉗子を使用してカートリッジへのEMグリッドを配置し、静かにグリッドを確保カートリッジに戻ってロックリングを再接続します。 </li><li>顕微鏡からの複数の試料ホルダーを外し、搬送ステーションに接続します。カートリッジ鉗子使用してホルダーに試料カートリッジを置きますローディングエリアからホルダーを撤回し、顕微鏡に戻って、複数の試料ホルダーを転送dは。 注：Chenら21 2.1から2.9の詳細を視覚的プロトコルを参照してください。 </li></ol> 3.ハイスループット自動チルトシリーズコレクション<ol><li>低倍率マップのコレクション<ol><li> SerialEM 10の「ナビゲータ」メニュー（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM）の「開く」をクリックして、新しいNavigatorウィンドウを開きます。 </li><li>許容可能な撮像条件が含まれているグリッドの正方形を探す（ すなわち、薄い氷、無汚染、関心の対象）は、低倍率で蛍光スクリーンを使用して（〜2,300Xミニ細胞標本用）。 注：[ オプション：このステップは、グリッド全体をモンタージュによってSerialEMで自動化することができます、しかし、それは単に手動でいくつかの領域を選択するために、高速になります。] </li><li>その後、調整し50℃に試料ホルダーを傾けることによってユーセントリックの高さにステージを調整しますステージのxy翻訳までZ高さは、傾斜と非傾斜ビュー間の最小です。 </li><li>グリッドの正方形の中央に移動し、現在のステージ位置を保存するためにナビゲータウィンドウで「追加ステージ順位」ボタンをクリックします。 </li><li>すべての許容可能なグリッドの正方形のステージ位置が保存されるまで、上記の手順3.1.1-4を続行します。 </li><li> 「ファイル」メニューの「新しいモンタージュ」をクリックして、新しいモンタージュMRCファイルを開きます。開くモンタージュ設定ダイアログでは、全グリッドの正方形（標準200メッシュグリッドのための例えば、10×10）を取得しますXとYにおけるピースの数を選択します。このような8の高ビニングを使用し、「画像をシフトさせる代わりにステージを移動して「ラジオボタン」の作品整列させるために使用相関スキップ」を選択します。 </li><li>ナビゲータウィンドウで最初のステージの位置をクリックして、「獲得」のチェックボックスをチェックして取得するように設定します。ナビゲータウィンドウの各ステージ位置のためにこれを繰り返します。 </li><li>ナビゲーターは、「ナビゲータ」メニューの「ポイントで取得」をクリックしてダイアログを取得開きます。 「獲得マップ画像」と「ラフeucentricity」チェックボックスをチェックし、他のすべてのチェックボックスがオフであることを確認してください。各ステージ位置でのモンタージュを収集するために、「進む」をクリックします。 </li></ol></li><li>チルトシリーズの取得<ol><li>ナビゲータウィンドウで獲得したマップのいずれかを選択し、「ロードマップ」ボタンをクリックします。 </li><li>ナビゲータウィンドウでチルトシリーズの取得をする時にマップ内のボタン「ポイントの追加」を選択しポイントをクリックします。その後、ボタン「ポイントの追加の停止」をクリックします。収集された各マップの繰り返し。 </li><li>カメラメニューで「パラメータ」を選択し、フォーカス、裁判、および録音モードのパラメータを定義します。 [ オプション：用量分画したデータは、記録モードのパラメータで指定することができます。] </li><li>ナビゲータウィンドウでポイントを選択し、「チルトシリーズをチェック9;チェックボックスをオンにします。チルトシリーズのコレクションのために必要なパラメータを選択し開きチルトシリーズの設定]ダイアログウィンドウで。 Navigatorウィンドウで選択されたポイントの残りのために繰り返しますが、マップを選択しないでください。 </li><li>ナビゲーターメニューで再び「ポイントで取得」を選択します。ナビゲータでダイアログを取得選択し、オートフォーカス」を項目に再調整 &#39;&#39;と &#39;ラフeucentricityの予備的作業として、選択し「ときにすべての列を閉じるには「チルトシリーズの取得」プライマリタスクとして、および選択&#39;末端に閉じる列バルブを点の収集されました。チルトシリーズを進むと、各マップの各ポイントで収集されます。 </li></ol></li></ol> Tomoautoを使用4.ハイスループット自動チルトシリーズの処理と復興<ol><li>線量分画データでビーム誘起運動の補正[オプション] 注：TomoautoがMOTIONCORR 22を使用しています （http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htミリリットル）、用量分画し顕微鏡写真からビーム誘起運動を削除します。 NOTIONCORR 16は、システムにインストールする必要があります。 <ol><li>オリジナルのチルトシリーズとSerialEM 10およびすべての現在の作業ディレクトリ内の個々の用量分画した画像から、出力ログ、端末内のコマンドを実行します。 &lt;filename.st&gt; dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt;プロセスにチルト系列の名前です。 </li></ol></li><li>チルトシリーズのアライメント・復興 注：デフォルトでTomoautoチルトシリーズの自動化基準モデル生成、配置、コントラスト伝達関数（CTF）、CTF補正23、の決意を処理するために（http://bio3d.colorado.edu/imod/）IMOD 13を使用し、再建。あるいは、ユーザーは、自動化された基準モデル生成、CTFのために（IMODに含まれる）RAPTOR 24を使用するには tomoautoでオプションを持っていますCTFを決定するFIND4 25（http://grigoriefflab.janelia.org/ctf）、および再構成のためかによるソフトウェアパッケージの任意の組み合わせで（https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d）26 tomo3d設定。各パッケージで利用可能なこの構成だけでなく、パラメータは、ローカル設定ファイルは、特定の検体に使用する詳細パラメータ、コレクションに作成することができる一方で、最も一般的に研究室で使用される値に合わせて編集することができ、グローバルコンフィギュレーション・ファイルによって処理されますセットまたは個々のチルトシリーズ。使用することを希望するすべてのパッケージがシステムにインストールする必要があります。 <ol><li>現在の作業ディレクトリにチルトシリーズでは、ターミナルでコマンドを実行 tomoauto --CTF --mode =揃える&lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;filename.st&gt;チルトシリーズが処理されると&lt;fid_diam&gt;はディアメですナノメートル単位の基準マーカーのター。このコマンドは、自動的にチルトシリーズのCTFを揃えると推定されます。これは、コマンドからの--CTFオプションを除去することによって、CTF処理をスキップすることが可能です。 </li><li>アライメント処理の任意の明白なエラーを視覚的に整列チルトシリーズを検査し、コマンドを実行することにより、推定CTFを調べます： 3dmod &lt;ファイル名&gt; .ali submfg &lt;ファイル名&gt; _ctfplotter.com それぞれ、 ここで、&lt; ファイル名&gt;は接尾辞なしチルトシリーズの名前です。また、アライメント品質の定量的統計で整列によって生成された平均残留誤差を、見るためにtomoautoコマンドの出力を確認してください。 </li><li>許容可能なアライメント与えられたコマンドを実行して処理を続行します： tomoau--CTF --mode =に&lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt;再構築 4.2.1と同様に、ユーザ置換を伴います。このコマンドは、CTFを修正チルトシリーズの基準マーカーが消去され、再構築を計算します。ここでもCTF処理は4.2.1のように省略することができます。 </li><li>目視検査手順をスキップし、完全にコマンドを実行し、処理し、再構築を自動化するには、[オプション] tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [オプション]ローカル設定ファイルを生成する方法についてtomoautoのドキュメントを参照して、特定のローカル構成を使用して、コマンドを実行するには tomoauto [オプション] -L &lt;LOCAL_CONFIG&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; ここで、&lt;LOCAL_CONFIG&gt;は、ローカルのconfの名前です。igurationファイル。 </li></ol></li></ol> 5.サブ断層アベレージ注：我々は、サブ断層像の平均化実験を処理するために（http://www.electrontomography.org/）i3のパッケージ 15 を使用し 、しかし、プロトコルは説明最も利用可能なサブ断層平均ソフトウェアpackages16toプロセスサブ断層像の平均化実験、一般的に適用され、しかし、このプロトコルは、ほとんどの利用可能なサブ断層の平均化ソフトウェアパッケージ16-18に、一般的に適用される説明しました。 <ol><li>現在の作業ディレクトリに復元された断層像でコマンドを実行することによって粒子ピッキングのための断層像を開きます： tomopick &lt;ファイル名&gt; .rec ここで、&lt;ファイル名&gt;は4.2.2のようになります。 injectisomeを選択し、tomograのスライスを通してリフには、上下矢印キーを使用して最初の基礎体温、その後、針の先端を上にクリックし、マウスの左ボタンを使用して表示されるウィンドウでメートル。このようにすべての可視injectisomesを選択します。これは、テキストフ​​ァイル内の座標は構造物の長軸を定義するだけでなく、構造体の向きを記述3オイラー角の2を推定格納します。 </li><li>計算上のコマンドを実行して定義された長軸の中点を中心とする断層像から400 3ボクセルの立方体を抽出します。 クリップサイズ変更-CX &lt;X&gt; -cy &lt;Y&gt; -cz &lt;Z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;ファイル名&gt; .rec &lt;ファイル名&gt; _001.mrc ここで、&lt;x&gt;は、&lt;y&gt;を、&lt;Z&gt;構造の中点座標があり、&lt;ファイル名&gt;は4.2.2のようになります。抽出された立方体の大きさは、構造によって変化すべきであると倍率が使用され、適切にこのサンプルの400 3ボクセルで関心のある構造を、同封するのに十分な大きさでなければなりません。 </li><li>ダウンサンプル（ビン）コマンドを実行することにより、初期位置合わせのための計算時間を削減する4倍サブ断層。 binvol -b 4 &lt;ファイル名&gt; _001.mrc &lt;ファイル名&gt; _001.bin4.mrc ここで、&lt;ファイル名&gt;は5.2のようになります。 </li><li>決定オイラーサブ断層像に角度適用し、コマンドを実行することにより、初期テンプレートを生成するために世界の平均を計算します。 I3totsum.sh </li><li>合わせて、細胞質領域のバイナリ分類マスクを使用して、ダウンサンプリングされたサブ断層像を分類します。断層の特徴欠落しているウェッジアーティファクトを最小限にするために、フーリエ空間でサブ断層像の平均化を実行します。 4データをビニングするために、SAMPFACT = &quot;4 4 4」を使用してください。 i3mramsacls.sh </li><li>ダウンサンプリング係数2でサブ断層像を使って手順を繰り返し5.5（= SAMPFACT＆＃34; 2 2 2」）ともう一度、元のデータと（SAMPFACT = &quot;1 1 1」）。 i3mramsacls.sh </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome 19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明する助け推定上のタンパク質成分の特定の欠失を有するいくつかの変異体細胞を可視化するために利用されました。我々の方法はinjectisomeの構造 - 機能関係を研究するための新しい手段を提供しました。その結果、新たなステージをT3SS媒介分泌および病原性のメカニズムのさらなる解剖のために設定しました。 ここで紹介するプロトコルは、完全なSの高スループットクライオ-ETを説明フレクスナー、しかし凍結ETに適した任意のプロジェクトに適用可能です。この方法は、struct...

III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な3など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ6によって明らかにされました7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。 クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性赤痢菌株でそのままinjectisomesを画像化しました。クライオETの他の制限は、非常に迅速に、サンプル中の高解像度の情報を破棄し、電子ビームによって誘起される放射線に対する試料の感受性です。適切な用量は、完全傾斜シリーズ間で分散することができるように、その結​​果、非常に低い用量は、個々の傾斜画像に使用されます。これは、非常に困難なことは断層像のノイズの大量から被写体の構造的特徴を区別することを可能にすると冷凍のことで達成できる解像度を制限し、最終的な再構成における信号対雑音比（SNR）を低下させますET。 Conventiこのようなフーリエ変換し、実空間フィルタなど、ならびにダウンサンプリングonal画像処理、コントラストを高めるために使用されるが、高解像度の情報の多くをフィルタリングを犠牲にすることができます。最近、副断層像の平均を大幅にサブナノメートルレベル8,9にSNR、その後いくつかのケースでは、最終的な解像度を増加させることが可能となった。複合体のより詳細な分析は、計算含むサブ断層像の数千を抽出することによって可能となりますより高いSNRと高分解能でその場複雑な構造で決定するために、サブ断層像を位置合わせし、平均化し、元の断層像からの関心のある分野。これらの方法は、高分子集合体とネイティブ細胞環境での動的なコンフォメーションにさらに大きな洞察を提供するために、遺伝的アプローチと統合することができます。 一般的には、数十または数千のサブ断層像の何百もの高い決定するために平均化される必要がありますその場での -resolution構造。サブ断層像のこの大量生産するために必要なチルト系列の十分な数の取得が迅速にボトルネックとなります。その結果、チルトシリーズは、多くの場合、再構成の前に整列するようにチルトシリーズをもたらすために解決しなければならないビーム誘起シフト、ステージバックラッシュだけでなく、拡大、回転、スキュー欠陥の影響を受けています。チルトシリーズは、一般的に、伝統的にまだ別のボトルネックを引き起こし、チルトシリーズの検査によって手動で選択されている金基準マーカを、追跡することによって整列されます。多くのソフトウェアパッケージは、コンピュータ制御の電子顕微鏡10を介して自動化された傾斜シリーズ取得のために開発された11,12、傾斜シリーズのアライメントおよび再建13、14及びサブ断層像は、15-18を平均化されています。これらのパッケージは、クライオETのワークフローの個別の操作を処理するように、システムAのプロセスに抽象度の高いを構築することが望ましくなりますtically単一のパイプラインに全体のスキームを効率化します。したがって、我々は集中的に各コンポーネントの完全な設定を維持しながら、簡単なユーザ操作を可能にする、単一の半自動化されたユニットにこれらのパッケージの数を整理するために設計されたソフトウェアのラッパー・ライブラリー」tomoauto」を開発しました。ライブラリは、オープンソースは、よくオンラインリモートソースコードリポジトリ（http://github.com/DustinMorado/tomoauto）によって開発やさらなる統合を合わせて、継続的に開発され、使用のために自由に利用できる、文書化されています。 この高スループットクライオETパイプラインは 、Sにおける無傷injectisomesを可視化するために利用されていますフレクスナーミニセル。 1917断層像の合計は、サブ断層像19を平均することによって決定した細胞質ソーティングプラットフォームを含むインタクト機の現場構造における高分解能を明らかに、この方法を使用して生成されました。一緒に野生型およびMの分子モデリングとutantマシンは、当社の高スループットパイプラインは、ネイティブの細胞状況にそのままinjectisomeの構造と機能を理解するための新しい道を提供します。

<table><tbody><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>チロプチン酸醤油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーション装置</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Cuvette</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Cryogenic Tube</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心分離機 チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>Glow Discharge Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&nbsp;</td><td>自社製グロー放電装置に使用</td></tr><tr>自社製グロー放電装置に採用されている<td>高周波発生器</td><td>電機</td>製品<td>BD-10A</td><td>&nbsp;注意: このデバイスは高電圧を生成します。</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機鉗子</td><td>Dumont (Electron Microscopy Sciences)</td><td>72705-D</td><td>スタイル 5 反磁性</td></tr><tr><td>コリオダル金</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Ethane&nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>窒素</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>プランジャー装置</td><td>社内</td><td></td><td>商用 代替</td></tr><tr><td>利用可能な 極低温グリッド 収納ボックス</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>透過型 電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30 (300 KeV)</td></tr><tr><td>直接検出装置カメラ</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram Acquisiton Software</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 代替品UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td></tr><tr><td>Beam-induced Motion Correction Software</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html >2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>Tilt-Series Alignment Software</td> <td>が必要IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD 代替ソフト:XMIPP、Protomo</td></tr><tr><td>自動基準マーカーモデリングソフト</td><td>IMOD</td><td></td><td>の代替品:RAPTOR (IMOD0 に付属(tomoautoで使用可能)</td></tr><tr><td>CTF判定ソフト</td><td>IMOD</td><td></td><td>の代替品:CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (tomoautoで使用可能)</td></tr><tr><td>チルトシリーズ再構成ソフトウェア</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 代替ソフト:IMOD、XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es、Protomo</td></tr><tr><td>チルトシリーズ自動処理ソフト</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>パーティクルピッキングソフト</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org 代替品:IMOD</td></tr><tr><td>サブボリューム平均化ソフトウェア</td><td>i3</td><td></td><td>の代替品: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET、Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch、PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

クライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)は、高分子複合体を分子レベルでの本来の状況で視覚化するための強力な3次元(3D)イメージング技術です。この手法では、まず試料をガラス質の氷で急速に凍結して試料を本来の状態に保ち、次にさまざまな角度から高倍率で一連の顕微鏡写真を収集し、最後に3D密度マップを計算で再構築します。凍結水和した試料は電子ビームに非常に敏感であるため、放射線損傷を制限するために、非常に低い電子線量で顕微鏡写真が収集されます。その結果、生のクライオ断層撮影は、本質的にノイズの多い画像を特徴とする非常に低い信号対雑音比を示します。関心のある被写体をよりよく視覚化するために、従来の画像解析と、被験者のサブトモグラムを初期トモグラムから抽出し、位置合わせして平均化するサブトモグラム平均化を利用して、コントラストと解像度の両方を改善します。傾斜系列の大規模なデータセットは、さまざまな状態、条件、または突然変異の複合体を理解して解決し、平均化と分類に十分な大きさのサブトモグラムのコレクションを得るために不可欠です。このデータの収集と処理は、さらなる分析を妨げる大きな障害になる可能性があります。ここでは、コンピュータ制御の300kVクライオ電子顕微鏡、直接検出装置(DDD)カメラ、および自社開発の高効率な半自動画像処理パイプラインソフトウェアラッパーライブラリtomoautoをベースにしたハイスループットクライオETプロトコルについて紹介します。このプロトコールは、赤痢菌ミニセルにおける無傷のIII型分泌システム(T3SS)を可視化するために効果的に利用されています。クライオETに適したあらゆるプロジェクトに適用できます。

ミニ細胞Sのサンプルフレクスナーを回収し、 図2に詳述され、パイプラインを使用して、次のtomoauto概略図を図1に示したように処理しました。 傾斜シリーズは、低倍率のモンタージュマップ上でユーザにより指定されたポイントでの高スループット傾斜シリーズ取得を可能SerialEM 10（ 図3）を用いて収集しました。顕微鏡写真は、ビーム誘起運動22（ 図4）を低減するために直接検出素子カメラに対する用量分画モードを使用して収集しました。 TomoautoはMOTIONCORR 22、さらに（動画1）を処理することがチルトシリーズに結果を組み立てて、それぞれの処理用量分画した顕微鏡写真のコレクションを取って動き補正を調整します。 <...

我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

本手順の目的は、クライオ電子トモグラフィーの高スループットな収集および処理パイプラインの構築を支援することです。この手法は、次世代検出器で収集されたデータの取り扱い方や、自動傾斜シリーズ収集ソフトウェアによって生成される膨大なデータの処理方法など、クライオ電子トモグラフィー分野における重要な課題の解決に役立ちます。本手法の主な利点は、複数のソフトウェアパッケージを統合的に構成できるため、自動傾斜シリーズ処理の効率的なパイプラインを見出すことができ、トモグラムの解析に多くの時間を充てられる点にあります。一般的に、クライオ電子トモグラフィー（cryo-ET）の初心者は、電子顕微鏡から生成される膨大なデータを処理するために多くの煩雑なステップが必要となるため、困難に直面します。私たちは5年前、1つの細菌の3D再構成を得るために数百ものステップを手作業で行わなければならなかった時に、この開発のアイデアを初めて得ました。あらかじめ、Shigella flexneriミニセルの調製に関するテキストプロトコルを確認してください。次に、既存のJoVE論文で解説され、テキストプロトコルにも記載されている方法に従って、電子顕微鏡用グリッドを準備します。ガラス化氷に包埋したミニセルの集合体をEMステージにロードした後、ティルトシリーズ用の低倍率マップの収集を開始します。約2300倍の低倍率で蛍光スクリーンを確認しながら、撮像に適したグリッド正方形を探します。この領域に、汚染物のない薄い氷と目的の対象が存在することを確認してください。次に、視野をグリッド正方形の中心に合わせて、「Add Stage Position」ボタンをクリックし、その位置を保存します。その後、許容可能なすべてのグリッド正方形の位置が保存されるまで、この操作を繰り返します。次のステップは、新しいモンタージュファイルを開くことから始まります。セットアップダイアログで、グリッドの正方形全体がキャプチャされるようにXとYを設定してください。標準的な200メッシュのグリッドの場合、ビニング値を8などの高い値に設定し、10×10のスペースを作成します。また、「image（画像）」をシフトさせるのではなく「move stage（ステージ移動）」を行うオプションと、「skip correlations used to align pieces（ピースの整列に使用される相関をスキップする）」オプションを切り替えます。次に、ナビゲーターウィンドウで、「Acquire（取得）」トグルを使用して、取得する最初のステージ位置を選択します。各ステージ位置に対してこの操作を繰り返します。次に、Navigatorメニューから「Acquire at Points」をクリックします。表示されたダイアログボックスで、「acquire map image」と「rough eucentricity」をオンにします。その他のオプションはすべてオフにしてください。次に、proceedをクリックすると、各ステージ位置のモンタージュが作成されます。引き続きSerialEMソフトウェアでの操作を行います。Navigatorで取得したマップを選択し、Load Mapをクリックしてください。次に、[Add Points]をクリックし、ティルトシリーズを取得したいマップ上の点を選択します。選択後、[Stop Adding Points]をクリックし、収集した各マップでこのプロセスを繰り返します。次に、[Camera]メニューのパラメータを開き、Focus、Trial、およびRecordモードを設定します。線量分割データの記録オプションは特に有用な場合があり、「Record options」で指定できます。次に、現在表示されているマップ内の任意の点を選択し、「Navigator」ウィンドウの「tilt-series」オプションを切り替えます。開いたダイアログボックスで、チルトシリーズのパラメータを選択してください。次に、マップ内で選択した各ポイントについて、tilt-seriesオプションを切り替える操作を繰り返します。続いて、Navigatorから「Acquire at Points」オプションを開始します。ダイアログボックスで、「Preliminary Tasks」、「Realign to」項目、「Autofocus」、および「rough eucentricity」を有効にします。次に、プライマリタスクをチルトシリーズの取得に設定し、「close column vals at end」を選択して、すべてのポイントの収集が完了したときにカラムを閉じるようにします。プロセスを実行すると、各マップでチルトシリーズ収集がオンになっている各ポイントでチルトシリーズが収集されます。元のチルトシリーズ、SerialEMからの出力ログ、および個々の線量分画画像がすべて現在の作業ディレクトリにある状態で、ターミナルで次のコマンドを実行し、ビーム誘起運動アーティファクトを除去します。ティルトシリーズのアライメントと再構成を行います。ターミナルに次のように tomoauto コマンドを入力してください。コマンドの後に、処理するティルトシリーズのファイル名を入力し、続けてフィデューシャルの直径をナノメートル単位で指定します。CTF処理が不要な場合は、コマンドからそのオプションを単純に除外してください。このコマンドはtomoautoの主な用途であり、本来は手動での介入が必要であったチルトシリーズのアライメントに関するすべてのプロセスを単一のコマンドで実行できるため、ユーザーはバッチ処理を迅速にスクリプト化することが可能です。次に、3dmodコマンドを使用して、アライメント済みのチルトシリーズに明らかなエラーがないかを確認してください。ここで、filenameはサフィックスを除いたチルトシリーズの名前です。次に、ここで示すコマンドを使用して、推定されたCTFを確認します。ここでも、filenameはサフィックスを除いたチルトシリーズの名前です。また、tomoautoコマンドによって生成された出力ログで、アライメントの残留誤差を確認してください。これはアライメントの全体的な品質を定量的に評価する指標となります。アライメントの結果が許容範囲内であれば、再構成の計算に進んでください。このコマンドは、CTFを補正し、アライメントに使用したフィデューシャルマーカーをティルトシリーズから消去するために設定されています。視覚的な確認を省略して直接再構成を行う場合は、このコマンドを使用してください。Tomoautoには多くの利用可能なオプションがあります。tomoautoのドキュメントによれば、特に有用な機能の一つは、補助ファイルによって記述されるローカル設定を含めることができる点です。ティルトシリーズのファイル名を追記する前に、「local configuration」オプションを使用して、コマンドラインダイアログにこのファイル名を指定してください。ローカル設定ファイルを作成できる機能はtomoautoの最も強力な機能であり、自動処理を維持しながら、使用するすべてのコマンドを完全に設定し、特定のデータセットや困難なデータセットに合わせて実行を調整することが可能です。試験プロトコル内に、サブトモグラム平均化の実行方法に関する追加の手順が記載されています。記載されたプロトコルに従い、tomoautoを用いて2つの整列済み傾斜シリーズを作成しました。精密なアライメントは、理想的な基準マーカー座標を定義するモデルから算出されます。50度において、あるティルトシリーズでは金粒子が正しく追跡されており、許容可能なアライメントであることが示されました。一方、2番目のティルトシリーズでは、赤色で示された複数のモデルポイントが対応する金マーカーから逸脱しており、モデルが適切なアライメントを生成できなかったことを示しています。ティルトシリーズを収集した際、tomoautoは収集されたティルトシリーズの80から90%を正常にアライメントします。再構成後、最終的なトモグラムは画像サンプルの3Dボリュームとなります。これにより、セグメンテーションによる細胞のアノテーションや、サブトモグラム平均化を用いてサンプル内の分子機構の高解像度情報を得ることが可能になります。EMDBに登録されている、付着したShigella flexneriの2.7 nanometersのサブトモグラム平均は、単一のトモグラムでインジェクティソームを観察する場合と比較して、この手法が大幅な改善をもたらすことを示しています。このビデオを視聴することで、SerialEMとtomoautoを用いて、自動化されたハイスループットな手法でクライオ電子トモグラフィーデータを収集および処理する方法について詳しく理解できるはずです。この技術を習得し適切に実施すれば、1日でほぼ100本のチルトシリーズを収集し、1本のチルトシリーズを20分でアライメントすることが可能です。この手順を行う際は、チルトシリーズのアライメント品質を常に確認することが重要です。チルトシリーズのセットが適切にアライメントされない場合は、手動でアライメントを試み、そのパラメータをローカル設定に転送してください。この手順の後、サブトモグラム平均化などの他の手法を実行することで、高分子複合体のより高解像度な構造の決定など、さらなる疑問を解決できます。この技術の開発により、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）分野の研究者が、細菌、ウイルス、およびその他の生物における高解像度なin situ構造を探索する道が開かれました。

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。...

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

極低温電子断層撮影における大規模なデータ収集の需要の高まりには、高スループット画像取得ルーチンが必要です。ここでは、断層データ収集の時間効率とスループットを最大化することを目的とした高度な取得戦略の最近の開発を実装するプロトコルを説明します。...

極低温電子断層撮影の最適化戦略

このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける...

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。...

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

本プロトコルは、Tomo5を用いた高分解能クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集と、その後のデータ処理およびemClarityを用いたサブトモグラム平均化について記述する。アポフェリチンは、2.86...

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

クライオSTEMトモグラフィーは、埋め込み、切片作成、またはその他の侵襲的な調製物なしで、無傷の細胞の細胞小器官を視覚化する手段を提供します。得られた3D解像度は現在、数ナノメートルの範囲であり、数マイクロメートルの視野および1μmのオーダーのアクセス可能な厚さを有する。...

クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

このプロトコルは、高圧凍結(HPF)とワッフル法、低温集束イオンビーム(cryo-FIB)リフトアウト、線量対称の並列取得を統合することで、厚組織のクライオ電子断層撮影(cryo-ET)を標準化し、マウス海馬での再現可能な 現地...

マウス海馬における厚組織のクライオ電子断層撮影ワークフロー

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。...

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

学ぶハイスループット自動クライオ電子断層撮影の効率的なデータ処理パイプライン構築法。SerialEMとtomoautoを統合し、Shigella flexneriミニ細胞などの試料で高解像度in situ構造解析を実現し、研究者が生物学的問いに集中できる革新的なワークフローを提供する。

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

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