Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル
January 30th, 2016
我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。
この手順の全体的な目標は、ユーザーがクライオ電子線トモグラフィーのハイスループット収集および処理パイプラインを確立できるようにすることです。この方法は、クライオ電子断層撮影法の分野における重要な疑問、例えば、新世代の検出器で収集したデータをどのように処理し、自動チルトシリーズ収集ソフトウェアによって生成された膨大な量のデータを処理するか?この手法の主な利点は、ユーザーが複数のソフトウェアパッケージを統一的に構成して、自動化されたチルトシリーズ処理の効率的なパイプラインを見つけることができるため、断層撮影分析により多くの時間を費やすことができることです。
一般に、クライオETを初めて使用する人は、電子顕微鏡から生成される大量のデータを処理するために多くの面倒な手順が必要になるため、苦労するでしょう。この開発のアイデアを最初に思いついたのは、5年前、1つの細菌を3Dで再構築するために何百ものステップを手作業で行わなければならなかったときでした。事前に、赤痢菌フレクスネリミニセルの調製に関するテキストプロトコールを参照してください。
次に、既存のJoVEの出版物で説明されているように、またテキストプロトコルにも文書化されているように、電子顕微鏡グリッドを準備します。ビトリファイドアイスに埋め込まれたミニセルのコレクションをEMステージにロードした後、チルトシリーズの低倍率マップの収集を開始します。蛍光スクリーンを約2300倍の低倍率で見ながら、画像に許容されるグリッドの正方形を見つけます。
この場所には、薄い氷と汚染物質のない対象物が含まれている必要があります。次に、ビューをグリッドの正方形の中央に調整し、[ステージ位置の追加]ボタンをクリックして位置を保存します。次に、すべての許容可能なグリッド正方形の位置が保存されるまで、このプロセスを繰り返します。
次のステップは、新しいモンタージュファイルを開くことから始まります。設定ダイアログで、グリッドの正方形全体がキャプチャされるようにXとYを設定します。標準の 200 メッシュ グリッドの場合は、ビニング値が高い 10 x 10 のスペース (8 など) を作成します。
また、画像をシフトする代わりにステージを移動するオプションと、ピースを整列するために使用される相関をスキップするオプションを切り替えます。次に、「ナビゲータ」ウィンドウで、「取得」トグルを使用して取得する最初のステージ位置を選択します。各ステージ位置でこれを続けます。
次に、[ナビゲーター] メニューで [ポイントで取得] をクリックします。開いたダイアログ ボックスで、取得マップ イメージと大まかな偏心を切り替えます。他のすべてのオプションの切り替えを解除します。
次に、[続行]をクリックすると、各ステージ位置のモンタージュが作成されます。SerialEMソフトウェアで作業を続けます。ナビゲーターで、取得したマップを選択し、[マップのロード]をクリックします。
次に、[ポイントの追加] をクリックし、傾斜系列を取得するマップ上のポイントを選択します。選択を行った後、[ポイントの追加を停止] をクリックし、収集したマップごとにこのプロセスを繰り返します。次に、カメラメニューのパラメータを開き、フォーカス、トライアル、および記録モードを設定します。
線量分割データを記録するオプションは特に興味深い場合があり、それは記録オプションで指定できます。続行するには、現在表示されているマップ内のポイントの 1 つを選択し、[ナビゲーター] ウィンドウで tilt-series オプションを切り替えます。開いたダイアログボックスで、チルトシリーズのパラメータを選択します。
次に、マップ内で選択した各ポイントに対して、傾斜シリーズ オプションを切り替えるプロセスを繰り返します。次に、ナビゲーターから [ポイントで取得] オプションを開始します。ダイアログボックスの下で、予備タスク、アイテムに再調整、オートフォーカス、および大まかなユーセントリックを切り替えます。
次に、プライマリ タスクを傾斜系列を取得するように設定し、すべてのポイントが収集されたときに列を閉じるために、close column vals at endを選択します。プロセスが実行されると、各マップのチルト シリーズ収集に切り替えられた各ポイントでチルト シリーズが収集されます。元のチルトシリーズ、SerialEMからの出力ログ、および現在の作業ディレクトリにある個々の線量分画画像をすべてターミナルで使用して、次のコマンドを実行してビーム誘起モーションアーティファクトを削除します。
チルトシリーズの整列と再構築に進みます。ターミナルで次のようにtomoautoコマンドを入力します。コマンドには、処理する傾斜系列のファイル名を追加し、その後にナノメートル単位の基準直径を付加します。
CTF 処理が必要ない場合は、コマンドからオプションを省略してください。このコマンドは tomoauto の主な用途であり、ユーザーは、もともと手動での介入が必要だったチルトシリーズの整列に関連するすべてのプロセスを 1 つのコマンドで実行できるため、ユーザーはバッチ処理を迅速にスクリプト化できます。次に、3dmodコマンドを使用して、位置合わせされた傾斜系列を調べて、明らかなエラーがないか確認します。
ここで、filename は接尾辞を除いた傾斜シリーズの名前です。次に、ここに示すコマンドを使用して、推定された CTF を検査します。ここでも、filename は接尾辞を除いた傾斜シリーズの名前です。
また、tomoautoコマンドで出力されるログで、アライメントの残差誤差を確認してください。これは、アライメントの全体的な品質を定量的に測定する尺度です。アライメントが許容できる場合は、再構築の計算に進みます。
このコマンドは、CTF を修正し、アライメントで使用される指標マーカーをチルトシリーズから消去するように設定されています。目視検査をスキップして、再構築に直接進むには、次のコマンドを使用します。Tomoautoには多くのアクセス可能なオプションがあります。
特に 1 つは、補助ファイルによって記述されたローカル設定を含める機能です (tomoauto のドキュメントによると)。このファイル名を tilt-series ファイル名を追加する前に、ローカル設定オプションを使用してコマンドラインダイアログにこのファイル名を含めてください。ローカル設定ファイルを作成する機能は、tomoautoの最も強力な機能であり、ユーザーは使用するすべてのコマンドを完全に設定し、自動化された処理を維持しながら、特定のデータセットや難しいデータセットに対して実行を調整できます。
テストプロトコル内には、サブトモグラム平均化の実行方法に関する追加の指示があります。記載されたプロトコルに従って、2つの整列したチルトシリーズをtomoautoで作成しました。細かい配置は、フィデューシャル マーカーの座標を理想的に定義するモデルから計算されます。
50度では、1つの傾斜シリーズが金の粒子を正しく追跡し、許容可能な位置合わせを示しました。一方、第2のチルトシリーズの場合、赤で示されているいくつかのモデルポイントは、対応する金色のマーカーから外れており、モデルを示すのは適切な位置合わせを生成しませんでした。チルトシリーズが収集されると、tomoautoは収集されたチルトシリーズの80〜90%を正常に位置合わせします。
再建後、最終的な断層撮影は画像サンプルの3Dボリュームです。これは、セグメンテーションによる細胞アノテーション、またはサブトモグラム平均化に使用して、サンプル内の分子機械のより高解像度の情報を取得できます。EMDBに沈着した付着した赤痢菌の2.7ナノメートルのサブトモグラム平均は、単一のトモグラムでインジェクチソームを見るよりもこの技術の大幅な改善を示しています。
このビデオを見れば、SerialEMとtomoautoを使用してクライオ電子線トモグラフィーのデータを自動的かつハイスループットに収集・処理する方法を十分に理解できるはずです。この手法を習得すると、適切に実行すれば、1日に約100のチルトシリーズを収集し、20分でチルトシリーズを位置合わせするために使用できます。この手順を試行する際は、チルトシリーズのアライメントの品質を常に確認することを覚えておくことが重要です。
一連のチルト シリーズがうまく位置合わせされない場合は、手動で位置合わせを試し、パラメーターをローカル コンフィギュレーションに転送します。この手順に続いて、サブトモグラム平均化などの他の方法を実行して、高分子複合体の高解像度構造を決定するなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、クライオ電子顕微鏡の分野の研究者が細菌、ウイルス、その他の生物の高分解能in situ構造を探索する道を開きました。
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概要
このプロトコルは、分子機械の高解像度in situ構造を決定するための高スループットのクライオ電子トモグラフィー法を概説しています。これはデータ処理を合理化し、ボトルネックを最小限に抑え、資源のダウンタイムを減少させ、研究者が重要な生物学的探究に集中できるようにします。
主要な研究構成要素
科学分野
- クライオ電子トモグラフィー
- 分子生物学
- 構造生物学
背景
- クライオ電子トモグラフィーの高スループット収集および処理パイプライン。
- 新世代検出器からのデータ処理における課題。
- 自動化された傾斜シリーズ収集からの大規模データセットの効率的な処理の必要性。
- クライオETにおける手動データ処理の歴史的背景。
研究の目的
- クライオ電子トモグラフィーの合理化されたプロトコルを確立すること。
- 傾斜シリーズデータの自動処理を容易にすること。
- トモグラム分析の効率を向上させること。
使用した方法
- 高スループットクライオ電子トモグラフィープロトコル。
- データ処理のための複数のソフトウェアパッケージの設定。
- 自動化された傾斜シリーズ収集技術。
- Shigella flexneriミニセルの分析のための準備。
主な結果
- データ処理に必要な手間のかかるステップの削減。
- 大規模データセット処理の効率向上。
- 合理化されたワークフローを通じた生物学的問題への集中力向上。
- プロトコルの3D再構成生成における成功した適用。
結論
- このプロトコルはクライオ電子トモグラフィープロセスを大幅に簡素化します。
- これにより、研究者はデータ処理よりも分析により多くの時間を費やすことができます。
- 将来の応用により、分子機械に関する理解がさらに深まる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput cryo-electron tomography addresses the bottleneck in structural biology data processing, enabling rapid generation of 3D macromolecular complexes in native cellular contexts. By automating tilt-series collection and alignment, the method reduces manual intervention and accelerates target validation workflows in early discovery. This supports predictive confidence in mechanistic de-risking for antimicrobial and virulence target programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of intact macromolecular machines like type III secretion systems in near-native states for functional target interrogation.
- Operational Value: Reduces time spent on manual data handling, allowing scientists to focus on biological hypothesis testing rather than processing bottlenecks.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces sub-tomogram averages that improve contrast and resolution for reliable structural phenotyping of drug targets.
- Operational Value: Standardizes data collection and processing via tomoauto, enabling reproducible outputs across large datasets for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides 3D reconstructions at ~2.7 nm resolution to support mechanistic understanding of virulence complexes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by generating quantifiable structural data for target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering high-resolution structural insights on macromolecular complexes in situ.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing macromolecular assemblies in native cellular environments.
- Screening: Enables assay standardization through automated tilt-series processing and quantitative alignment quality metrics.
- Analytics: Delivers residual error measurements from tomoauto output logs as objective indicators of alignment quality for data-driven decisions.
- Translational Research: Connects structural data to preclinical advancement by resolving complexes in mutant or conditioned states for structure-guided design.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, configurable pipeline via local configuration files in tomoauto for consistent application across diverse targets and datasets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through high-resolution in situ imaging.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability, allowing nearly 100 tilt-series per day and alignment in ~20 minutes per series.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable structural data early in the discovery pipeline, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on resolvable structural states and complex dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron microscopy, SerialEM operation, and tomoauto command-line processing.
- Dependent on 300kV cryo-TEM with direct detection camera and computational infrastructure for tilt-series alignment and reconstruction.
- Necessitates cross-team standardization of grid preparation, data naming, and local configuration files for consistent processing.
- Involves adaptation considerations for varying ice thickness, sample contamination, and fiducial marker labeling across model systems.
- Includes practical limitations such as alignment success rates of 80–90% for collected tilt-series, requiring manual rescue for failed cases.
