Name: マウスリンパ腫モデルで腫瘍の進行と治療効果を監視するための生物発光に基づく腫瘍の定量法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぶルミノスコア法によるマウスリンパ腫モデルの生物発光イメージング定量化。複雑な計算不要で腫瘍負荷と治療効果を再現性高くモニタリングする簡便な手法です。

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私たちは、コルドリエ研究所（CEF、パリ、フランス）、Genethon（エヴリー、フランス） とGenopole（CERFE、エヴリー、フランス）の動物施設に感謝します。私たちは、原稿の彼女の慎重な読み取りのためにジョー・アン・カーンに感謝します。この研究は、研究所国立・デ・ラ・サンテエ・デ・ラ・RechercherMédicale、パリデカルト大学、ピエール＆マリー・キュリー大学、協会ラRECHERCHE contreルがん、チュニジア方向ジェネラル・デ・ラ・RECHERCHE科学研究を注ぎ、仏チュニジアCMCUによってサポートされていましたプロジェクト、およびアクションThématiquesIncitativesデGenopole（ATIGE）資金。 JCは、ライフサイエンスの博士課程の学校フロンティアによっておよびINCA（研究所国立デュ癌）からの交わりによってサポートされていました。 RBAはDGRS-INSERMとCMCUからの助成金の受取人でした。 SDは、研究所国立デュ癌からの助成金を受けました。

欧州連合（EU）のガイドラインに準拠したマウスを含むすべての手順は、動物実験のためのフランスの規制（農業法第2001から464、2001年5月省）、および研究所国立・デ・ラ・サンテら・デ・ラ・RECHERCHEMédicale（INSERM）委員会のガイドラインに動物研究は、関連する地方委員会によって承認された（チャールズ・ダーウィン倫理委員会動物実験、パリ、フランス、許可番号：P3 / 2009/004）。 1.細胞の調製<ol><li>マウスBリンパ腫細胞株A20.IIA-luc2は、10％ウシ胎児血清、100μg/ mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのピルビン酸ナトリウム、50μMの2-メルカプトエタノール、および0.50を補ったRPMI-1640グルタマックス培地中で増殖しますミリグラム/ Bをmlハイグロマイシン</li><li> 37°C、5％CO 2で細胞培養を維持し、2〜3日ごとに培地に変更します。収穫培地を変更した後、ピペット1日で細胞懸濁液の5ミリリットル。 </li><li> 300で細胞をスピン5; 10分間G 3mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を懸濁します。細胞を洗浄するために二回、この手順を繰り返します。 </li><li> Malassezカウントチャンバーをロードする前に、30μlのトリパンブルーラベル付けされた細胞懸濁液の15μlのを混ぜます。濃度（細胞/ ml）=カウンティンググリッド内のセルの数*×1000 3：式で細胞濃度を計算します。 </li><li> 10分間、300×gで細胞1より多くの時間をスピン。ピペットで上清を取り除きます。 C工程1.4で計算濃度）を用いて、細胞の数は、N = C * 3です。 </li><li>下記式5×10 7細胞/ mlの濃度で細胞懸濁液Aを得るために必要な滅菌PBS 1Xの体積を計算する：PBSの容量（ml）= N /（5×10 7）。前の文で計算された滅菌PBS 1Xの容量で）（ステップ1.5から）細胞ペレットを中断します。細胞懸濁液Aは、SCLモデルで使用される（ 生体内に注入容積は100μLである：×10 6細胞秒）。 </li><li>ピペット10の細胞懸濁液Aμlの1ml当たり5×10 6個の細胞で細胞懸濁液Bの100μLを得るために、1.5mlチューブに無菌PBSの90μlを添加します。細胞懸濁液Bは、（1×10 4細胞を、インビボで注入された体積は2μlのある）ポワルモデルで使用されます。 </li></ol> 2.ルシフェリン<ol><li> 50mlのチューブ中の滅菌PBS 1×30m​​lにD-ルシフェリンカリウム塩の粉末1gを希釈し、凝集体を溶解するために数秒間振ります。 注：ルシフェリンは光に敏感であるため、暗い1.5 mlマイクロチューブに500μlのアリコートを準備します。 </li><li> -20℃でアリコートを保管してください。 注：アリコートを数ヶ月間保存することができます。 解凍後、アリコートを+ 4℃で1日以上保存することはできません。凍結融解サイクルは、4℃での保存に好適です。 </li><li>各撮像ASSAために腹腔内にD-ルシフェリンカリウム塩溶液100μlを注入Y。 注：このソリューションは、150ミリグラム/ kgの用量のためのマウスあたり3.3ミリグラムに相当します。 </li></ol> 3.麻酔混合物と麻酔<ol><li>ケタミンを滅菌PBS 1×中120ミリグラム/ kgおよびキシラジン6ミリグラム/キログラムを混合することによって麻酔液を準備します。 </li><li> 25 G針で各撮像アッセイのために腹腔内麻酔薬混合物の60μLを注入します。 （ポワルまたはSCLモデルとの）手術のために、より深い麻酔を得るために、混合物の80μLを注入します。そのケージに戻ってマウスを置きます。 </li><li>マウスは不動表示されたら、そのケージから取り外し、ゆっくりと指の間のマウスの足を絞ります。マウスエスケープ反射と反応する場合、いくつかの分を待ちます。マウスが反応しなくなるまで十分な麻酔を確認する、アクションを繰り返します。 </li><li>温暖化プレート上または加温光の下でマウスを置きます。 </li><li>イメージングアッセイのためまたはSCLの手術のための麻酔中に目の乾燥を避けるために眼軟膏を適用します。適用しますポワルモデルのための手術後の眼軟膏。 </li></ol> 4.手術および細胞接種注：動物のバイオセーフティーレベル2施設におけるタイプ1微生物学的安全キャビネット内で、温暖化プレート上や温暖化光の下ですべての外科的処置を実行します。このセクションで使用されているすべての手術器具は使用前にオートクレーブしました。 <ol><li> 皮下リンパ腫モデル： <ol><li> 25 G針で1mlのシリンジにステップ1.6で得られた細胞懸濁液100μlを準備します。静かに注射部位で、指の間の脇腹上のマウスの皮膚を絞ります。皮膚のひだに正確に針を挿入します。皮下注射を確保するために、深部組織に針を配置しないでください。 <ol><li>皮下脂肪に細胞を注入します。少し液体ボールが注入が正しく行われたことを確認するために皮膚の下に表示するかどうかを確認します。 </li></ol></li></ol></li><li> ポワルモデル： 注：このprocedureは、 オペレータ1、 オペレータ2のようにここで言う2演算子を、必要とします。 <ol><li>結膜の除去： <ol><li>解剖顕微鏡下でオペレータ1の場所にマウスを持っています。それをクリアするために、目の両側に指で軽く押します。この位置を維持します。 </li><li>解剖顕微鏡を通してオペレーター2リットルのネバネバを持っています。グリップ片手にペンチの小さなペアで結膜。一方で、手術用はさみの小さなペアでちょうどペンチ以下結膜をカット。 </li><li>持っているオペレータ1のリリースステップ4.2.1.1でプレスマウスの眼） </li></ol></li><li>細胞注入： <ol><li> 10μlの鈍精度シリンジを準備します。それを通して滅菌脱イオン水をポンプでそれを洗ってください。シリンジ内の気泡がないことを確認するために2回または3回繰り返します。その後、注射のために、細胞懸濁液の2μLを準備します。 </li><li>上の指で軽くオペレータ2のプレスを持っています目の各側の電子手はそれをクリアします。この位置を維持します。 </li><li> オペレータ1グリップを片手にペンチの小さなペアで、目の端を持って、組織を伸ばすために後方に軽く引っ張ります。 </li><li>解剖顕微鏡を通してオペレーター2リットルのネバネバを持っています。一方で、32 G針でマウスの劣る眼球に小さな穴を作ります。 </li><li> オペレータ2は、針を置くと（同じ手で）精密シリンジをピックアップし、ステップ4.2.2.4で行われた穴に針を挿入しています。 </li><li>もう一方の手でシリンジプランジャ上のオペレータ1プッシュを持っています。 </li><li>シリンジ内の細胞懸濁液を正確に眼球の内部に注入された解剖顕微鏡でオペレーター2 V erifyを持っている（液体の流れが容易に観察され）。 </li><li> オペレータ2のR emoveに精密注射器を持っています。 </li><li> オペレータ1 rは ANのエッジをelease持っていますimal目）は、ステップ4.2.2.3で把持しました</li><li>目の側面はステップ4.2.2.2でプレスオペレーター2 r個の eleaseを持っています） </li><li>すぐに眼軟膏を適用します。 注：すべてのステップが正しく実行された場合、マウスはこの手順の間、全く出血べきではありません。 </li></ol></li></ol></li></ol> 5.生物発光イメージング - 0日目注：マウスに注入され、すべての製品は、注射前に室温でなければなりません。腫瘍後、細胞を接種されており、動物がまだ麻酔をかけている間、画像化のためにこれらのステップに進みます。 <ol><li>イメージャの電源をオンにし、取得ソフトウェアを開きます。 「初期化」ボタンをクリックすることで、カメラ、ステージ、およびレンズを初期化します。初期化が完了したことを10〜15分かかります。 </li><li> 25 G針で腹腔内に D-ルシフェリンカリウム塩溶液100μlを注入します。静脈内に投与しないでください。 intravenou場合sの投与が何らかの理由で必要とされる、D-ルシフェリンナトリウム塩は、D-ルシフェリンカリウム塩ではなく、使用する必要があります。 注：ルシフェリンは、この濃度で過剰反応物です。したがって、生物発光信号は、3〜7分後にプラトーに達し、30分以上持続します。 </li><li> 10分 D-ルシフェリン注射の13の後、イメージャに検体マウスを置きます。できるだけ平坦な位置に、その自然な位置にカメラに向かって背中をマウスを置きます。この位置は、自然かつ容易に再現可能です。 </li><li>自動露出機能をチェックし、自動露出機能で、動物の背面 （後方）画像を取得するために獲得をクリックしてください。 注：自動露出機能は、1秒露光画像から計算することにより露光時間を最適化します。マウスの生物発光シグナルが負または非常に低い場合、最適露光時間があるかもしれません自動的に20分以上に設定します。この場合には、8〜10分の暴露時間は、良好な妥協であり得ます。露光時間を手動で設定することができるが、画像が飽和画素を含めることはできません 。 </li><li>カメラにマウスの正面を露出するために、マウスを裏返します。彼らは胸をブロックしないように、マウスを平らにし、その前方手足を広げてみてください。 </li><li>動物の正面画像を取得します。自動露出のチェックボックスがまだチェックされていることを確認し、「取得」ボタンをもう一度クリックします。 注：正面画像はバック画像およびその逆の前に取得することができます。表裏の画像の露光時間は、マウスの各側の相対強度に応じて異なることができます。自動露出機能を使用するときに自動的に計算されます。定量化は唯一の光子束（ 秒あたりの光子）を使用し、露光時間に依存しません。 </li><li>温暖化プラット上にマウスを置きますeまたはそれが麻酔から回復した後、そのケージに戻ってそれを置くまで、温暖化光の下で。 </li></ol> 6.生物発光イメージング - 0日後<ol><li> ）イメージャの電源をオンにし、ステップ5.1のように、カメラ、ステージ、およびレンズを初期化します。 </li><li> （ステップ3.1〜3.5を参照）をケタミン（120mgの/キログラム）/キシラジン（6ミリグラム/キログラム）の混合物を60μlの腹腔内注射でマウスを麻酔。 注：麻酔のこの方法は、5日ごとに画像化することができます。毎日のイメージングを実行するには、この麻酔薬との使用に適した麻酔薬および生物発光撮像装置としてのイソフルランを用いた方法が必要とされます。 </li><li> ）ステップ5.5のように、自動露出機能を使用して、動物の表裏の画像を入手してください。）5.6。ステップ5.7）のようにマウスを処理します。 </li></ol> 7.生物​​発光定量化と画像解析注：luminoscore方法は、画像analysiに基づいています秒。画像は上記の手順に従って取得された後、定量化は、各時点で各マウスにluminoscoreを関連付けるために、（すぐに取得した後を含む）任意の時点で行うことができます。 <ol><li> 「表示」メニューをクリックして「ツールパレット」を表示し、表示されていない場合は、「ツールパレット」をクリックしてください。ツールパレットの「ROIツール」タブをクリックします。 「輪郭」ボタンを選択して、「フリードロー」を選択します。 </li><li>手動で正面図の上でマウスの縁に従うことによって、マウスの周りの関心領域（ROI）をマーク。コンピュータ・マウスの右クリックで輪郭を閉じます。 </li><li> 「表示」メニューをクリックして、「ROIの測定」。 「ラディアンス（光子） &quot;を確認してください」ROIの測定」ウィンドウの左下にあるメニューをスクロールする「測定タイプ」で選択されています。ない場合は、それを選択します。そして、光子FLを測定uxの「全光束[P / S]」ボックスに値を記録することによって（PH /秒）。 注：ラディアンスまたはROIの面積を基準にして他のユニットを使用しないでください。 </li><li>繰り返して、 背面図 7.2）と7.3）を繰り返します。 </li><li>正面と背面図から得られた2光子束値を合計します。結果はluminoscoreです。 </li><li> 14（例えば、ノンパラメトリック両側マンホイットニー検定）適切な統計的検定を用いて、各グループの値を比較します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この制限は、任意の光学イメージングモダリティに固有のものであるが、臓器や組織による光の吸収は、生物発光イメージングの制限のまま。我々のアプローチの文脈では、luminoscoreの解剖学的構造の効果は研究がその後の比較を可能にする、与えられたモデル（位置及びマウス鎖）で行われることを条件とする低い変動性を有することが期待されます。生物発光は、励起光を必要としないので、より多くの蛍光よりも生体内撮像に全身に適合されます。 空間分解能はまた、生物発光イメージングの限界であり、生物発光の光子が放出される臓器の正確な位置は依然として困難です。しかし、モデルの十分な知識は、腫瘍部位の定性的な場所にすることができます。この生物発光ベースの方法で唯一の出力はluminoscoreです。場所はInteresの手動マークアップリージョンのでluminoscoreに影響を与えませんトン（ROI）は、マウス全体をカバーしています。最後に、ホタルルシフェラーゼは、酸素を必要とします。したがって、生物発光イメージングは​​、通常、壊死性腫瘍を過小評価します。もう一度、モデルのこの態様の十分な知識が必要です。 本稿では、（すでに7,9,11を実証されている）が、生物発光データセットの比較を可能にする方法を説明するために、抗腫瘍薬としてのCpGの有効性を評価することを目指していません。 我々は確かに異なる時間に異なる場所で異なるアッセイを比較するための取得プロトコルを標準化するためのもの腫瘍負荷を定量化する方法を説明し、それがコンピュータの計​​算を必要としません。再現性と正しい光子束の定量化を確実にするために、撮像装置は、自家製のデバイスのための光を参照してたり、商業デバイスのプロバイダによって推奨されるように較正されなければなりません。 私たちのプロトコルには、いくつかの重要なpまで細心の注意が必要ですointsは、（i）まず、マウスの麻酔の質が特に長い露光時間との例では、鮮明な画像を得るために重要です。 （ii）の定量化ユニットは、常に輝きは、各マウスの表面積に依存し、異なるマウスを比較するために無関係である可能性があるため、光子束でなければなりません。これらは、バイアスluminoscoreをだろうので、（iii）の生物発光画像は、飽和画素を含んではなりません。 （iv）のバックとフロント買収は、腫瘍部位（ すなわち、フロント買収は必ずしも腫瘍の背面からの光子を検出しない場合があります）から放出された全ての光子を収集するために必要とされます。様々なROI図面はluminoscore法の開発中に試験されました。唯一の手動のマークアップ（データは示していない）、統計的に有意である可能性が高い満足のいく結果が得られました。 Inoueら。 75ミリグラムのルシフェリン線量をお勧めします/ 13 kgです。 150mgの用量を使用して/した後、代わりの撮像のタイミングをkgのルシフェリンの投与は変わらないと我々は高原が長時間露光買収を通じて持続することを確認してください。ルシフェリンは、取得プロセスを通して過剰反応体でなければなりません。私たちは、動物あたり2 ROIを描いたSCLモデルで示したように、モデルに応じて、関心領域は、適合させることができる。SCLモデルでは、治療は腫瘍が変動を制限するために、その最大直径が0.5cmに達したときに注入され、生着の。マウスによっては、腫瘍が異なって成長している可能性があります。マウスを標準と比較するために、我々は両脇腹の腫瘍の相対的な成長を明らかに扱われ、非処理側との間の比率を使用することにしました。 全く信号が正であることが期待注射したマウスから観察されていない場合、いずれかの（I）細胞の数が非常に低く、信号は検出限界以下です。または（ii）のマウスは、酸素を欠いており、即時の注意が必要です。 定量的bioluminescのいくつかレンスは、様々な著者によって記述分析放出された生物発光光子5,15の絶対定量に近づくように複雑な計算や楽器（ 例えば 、3D生物発光トモグラフィー）が必要です。 2D生物発光イメージャー、特に腫瘍モデルでは、再現性生物発光を定量化するための方法については意見の一致はありません。私たちの目的は、ユーザー依存性を制限するために、画像取得プロトコルを標準化することでした。 腫瘍接種後のその場でのCpGの注入は、両方のモデルで腫瘍量を減少させました。 luminoscore方法は、腫瘍の免疫療法の他のモデルで腫瘍量をモニタリングするためのツールと​​して機能することができます。腫瘍負荷を監視することは、腫瘍の微小環境に干渉することなく、腫瘍の増殖と転移性のメカニズムの理解を向上させることができる非侵襲的方法を提供します。行うと、この方法での治療に応答しない動物の識別は、複数の検証によって補強されています実験の開始時uccessful腫瘍細胞の注射。 ここでA20.IIA-luc2細胞を用いたSCLモデルでluminoscore法の適応性を示しました。しかし、この方法は、それらが、ルシフェラーゼ、またはT細胞試験（ その他の腫瘍特異的細胞傷害性T細胞、制御性T細胞）の文脈で発現することを提供される他の細胞株を使用して、他の腫瘍モデルに適合させることができます。稀な疾患の遺伝子治療の状況において、インビボでの遺伝子導入の監視もluminoscore法を用いて行うことができます。 最後に、データは、生物発光ベースluminoscore法は、実験間での比較を可能にする特定の実験のニーズに柔軟性と適応性を提供し、非侵襲的な長手方向の前臨床試験のための有用なツールであることを示しています。

初期の腫瘍細胞の検出は、課題のままであり、癌治療の有効性を高めるために重要である。 インビボでの生物発光イメージング（BLI）が広く小動物の腫瘍を監視するために使用される非常に敏感な、非侵襲的な光学技術です。ホタルルシフェラーゼを発現する細胞は、一般に、実験1,2のために使用されます。このオキシゲナーゼは、D-ルシフェリン分子状酸素で酸化するが、2つの補助因子を必要とする-のMg 2+およびアデノシン三リン酸3。その量子収率が高いので、ホタルルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ4よりもin vivoイメージングに適しています。 酸化された基質 - オキシルシフェリンは - 自然にその基本状態に戻す光子を放出した後、非アクティブになります。放出された光子は、530nmの付近で最大波長を持っています。高感度カメラは、小動物の内部からの発光の光子を検出し、POSSする画像を提供することができます腫瘍細胞を見つけるためにible。 光子カウントによって正確に腫瘍負荷を定量化する能力は、治療の有効性を定量化するための強力かつ敏感なツールとして役立つことができます。治療効果をより早く検出することができるので、この感度は、治療が有効となるに正確な瞬間を決定することを可能にするかもしれません。 総放出された光子の絶対定量化は非常に複雑です。収集された光子の数は、腫瘍の深さにし、光子が通って放出された臓器によって異なります。組織吸収係数に基づいて補正係数を5に計算することができるが、腫瘍細胞数の絶対的な定量化は、各腫瘍細胞によって放出された光子の数を知る必要があります。また、多くのレポーター遺伝子（ 例えば 、蛍光タンパク質）のようなルシフェラーゼ発現は、単一のクローン6由来の細胞集団では、均質ではありません。ルシファーの数細胞内アーゼタンパク質は、正確に計算することができません。標準化された実験条件の確立は、このように信頼性の高い半定量分析のための重要な表示されます。 我々は2つの異なるマウスリンパ腫モデル7,8,9にluminoscore法を適用しました。これらのモデルでは、同系の腫瘍細胞は、眼内又はそれぞれ、プライマリ眼内リンパ腫（ポワル）モデルおよび皮下リンパ腫（SCL）モデルを得るために皮膚の下に注入されます。これらの同所性モデルのそれぞれにおいて、治療は、7日間ポワルために腫瘍接種後、in situで投与され、腫瘍は、SCLのためにその最大直径で0.5〜0.7センチメートルに達したとき。 我々は以前7,10,11有効であることが示され、 その場でのCpG療法での効果をモニターするためにluminoscore法を用いました。 CpGが順番に多数のCEにより発現する細胞内受容体であるオリゴヌクレオチド配列およびTLR9のリガンドであります樹状細胞、Bリンパ球、単球、およびナチュラルキラー細胞を含む免疫系のLLS、。 CpG-DNAは、CpG（CG）免疫刺激性モチーフを含む20マーのDNA配列です。コントロール（ODN-制御）免疫刺激CG配列は、（GC）が反転していることを除いて、同じ20マーのDNA配列です。私たちが研究しているマウスのリンパ腫におけるTLR9の関与は、アポトーシス10誘導する免疫系12を活性化し 、それによって大幅に腫瘍量7,11を軽減します。 ここでは、生物発光画像を介して、腫瘍の負担や治療反応を定量化するための標準化された方法を説明します。この方法は、信頼性、再現性、非ユーザ依存性、および統計的有意性を最適化するために、取得から解析まで、イメージング手順のさまざまな側面に依存しています。生物発光の定量指標は、各マウスに起因します。我々はluminoscoreを呼び出し、この値は、だけでなく、動物が、Alとを比較することができます実験間そう。 本研究では、生物発光イメージングの手順と同様にluminoscore法による画像定量化に焦点を当てます。我々は、注射を検証腫瘍負荷を監視し、 およびin situ癌治療での有効性を評価するためのこの方法の有効性を示します。これらの点の各々はluminoscore法の適応性を強調するために、異なるマウスモデルを用いた実験からの代表的な結果に示されています。

<table><tbody><tr><td>CpG 1826</td><td>Invivogen</td><td>Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT カタログ番号: tlrl-1826</td><td></td></tr><tr><td>ODN 1826 control</td><td>Invivogen</td><td>Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT カタログ番号: tlrl-1826c</td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリンカリウム塩</td><td>Interchim</td><td>カタログ番号: FP-M1224D</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Virbac, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエルヘルスケア</td><td>ロンプン2%</td><td></td></tr><tr><td>A20。IIA-luc2細胞株</td><td></td><td>A20。pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310)</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>Balb/cByj</td><td>チャールズ川</td><td></td>の6週齢の雌</tr><tr><td>IVIS lumina Biolumienscence イメージ</td><td>ソフトウェア Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像</td><td></td>上の<td>光子束の測定とROI</td><td></td>の描画に使用</tr><tr><td>Rソフトウェア (オープンソース)</td><td>R-project</td><td>統計検定</td><td></td>に使用</tr><tr><td>ハミルトン プレシジョン セリンジ 10 & マイクロ;l&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>品番 7642-01100</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>ラクリノルム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスリンパ腫モデルで腫瘍の進行と治療効果を監視するための生物発光に基づく腫瘍の定量法

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

生物発光イメージング（BLI）は、がんの動物モデルにおける腫瘍負荷のモニタリングに有望ですが、これらの分析は主に定性的なものにとどまっています。ここでは、腫瘍負荷と治療反応の半定量的分析を得るための生物発光イメージングの方法について説明します。この方法は、同じ実験または異なる実験から得られた2匹の動物を比較できる値であるルミノスコアの計算に基づいています。現在のBLI機器では、このルミノスコアの計算が可能で、これは主に取得条件(背面と前面の取得)と関心領域の描画(マウスの周りの手動マークアップ)に依存しています。細胞生着に基づく前述の2つのマウスリンパ腫モデルを使用して、ルミノスコア法が腫瘍細胞接種の成功を検証し、腫瘍量を監視し、上皮内がん治療(CpG-DNA)の効果を評価するための非侵襲的な方法として役立つことを示します。最後に、この方法がさまざまな実験計画に適していることを示します。この方法は、前臨床小動物研究における治療反応の早期推定に使用することを提案します。

Luminoscore方法は、腫瘍細胞注射を確認するのに役立つことができます 腫瘍細胞の少数の注入を含むモデルまたは注射部位に注射の視覚的検証を可能にしない場合には、注射の品質を確保することは非常に困難であることができます。 luminoscore方法は、手続きの品質を検証し、簡単かつ瞬時にすべてがうまくいったことを確認するための迅速かつ便利なツールとして機能します。両方のモデルでは、腫瘍は、注射（図1A）10分後には早くも検出可能です。画像だけでは、その腫瘍細胞が適切な位置に存在して検証するのに十分。それにもかかわらず、画像を定量化することは、注射の不均一性のアイデアを提供します。ドットプロット（図1B）が明らかに（黒点）を受けた動物との間の差を示し、再ませんでしたceive（赤線）注射。興味深いことに、SCLモデルで得られた信号はポワルモデルよりも100倍高いです。この知見は、注入された細胞の数（5×10 6〜1×10 4細胞を、それぞれ）と一致しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig1.jpg" /> 別のマウスリンパ腫モデルにおける図注射の1検証。luminoscoresは異なるリンパ腫モデルにおいて腫瘍細胞接種後10分を測定した。両モデルの（A）代表的な画像。（B）各動物のLuminoscoreを異なるモデルに。赤線は、腫瘍細胞接種前に10匹の動物で測定した平均バックグラウンドノイズに対応します。点線は、平均+/-標準偏差です。各モデルについては、全ての動物は、背景雑音から区別することができます。ポワルのモデルでは、1×10 4細胞がINOCました右眼の硝子体にulated、およびSCLモデルでは、5×10 6個の細胞を皮下マウスの各脇腹に。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 腫瘍量と治療応答をモニタリングします luminoscoreはまた、腫瘍の増殖および治療 ​​効果を研究するための強力なツールである。 図2Aは、対照における腫瘍増殖のモニタリングの代表的な画像を示しおよびCpGがポワルグループを処理しました。マウスは、1×10 4の腫瘍細胞ごと、および治療 ​​を接種した画像は、十分な時間（28日）後、転移は対照群に表示されるようになったことを示して7日目に、その場で投与しました。原発腫瘍は少なく、治療に敏感で表示されませんでしたが、転移は、CpG処置群（表1）で観察されました。各群（図2B）における腫瘍負荷の定量分析は、CpGは、処置および28日（ノンパラメトリック両側マン-ホイットニー検定p = 0.0079後の対照群との間に統計的に有意な差を生成する、腫瘍の発達を遅らせたことを示します）。それにもかかわらず、腫瘍がまだ処理されたマウスにおいて成長し、それらのいずれも（データは示していない）生存していません。この知見は、以前の報告と一致している：CpGが、プライマリ眼の腫瘍10に有意な効果を持っていません。我々はODNおよびCpG群との間にここにある顕著な効果は、転移の増殖阻害から来ています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig2.jpg" /> 図2.モニタリング腫瘍量と治療応答。 （A）は、2つのグループの代表的な画像（ODN-制御およびCpGは、処理された）Oポワルを有するマウスF。（B）luminoscoreで腫瘍負荷を監視します。ドットプロットに見られるように、luminoscore上のCpGの効果は、これらの二つのグループでは28日目に有意である、この方法は、腫瘍負荷を監視するとCpG-のわずかではあるが有意な（P = 0.0079）効果を測定することを可能にしました単独の画像により検出されなかったかもしれないDNAが、。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> グループ </td><td> マウス </td><td> 転移の存在 </td><td> ロケーション </td><td> 光子束（PH /秒） </td></tr><tr><td rowspan="5"> CpG </td><td> 1 </td><td>いいえ</td><td>バツ</td><td>バツ</td></tr><tr><td> 2 </td><td>はい</td><td&gt;アイ・排水lympノード</td><td> 9.32E + 05 </td></tr><tr><td> 3 </td><td>いいえ</td><td>バツ</td><td>バツ</td></tr><tr><td> 4 </td><td>いいえ</td><td>バツ</td><td>バツ</td></tr><tr><td> 5 </td><td>はい</td><td>アイ排水lympノード</td><td> 2.21E + 07 </td></tr><tr><td rowspan="5"> ODN </td><td> 1 </td><td>はい</td><td>アイ排水lympノード</td><td> 1.06E + 07 </td></tr><tr><td> 2 </td><td>はい</td><td>アイ排水lympノード</td><td> 7.25E + 07 </td></tr><tr><td> 3 </td><td>はい</td><td>反対側の眼-排水lympノード+ </td><td> 7.64E + 08 </td></tr><tr><td> 4 </td><td>はい</td><td>反対側の眼-排水lympノード+ </td><td> 1.74E + 09 </td></tr><tr><td> 5 </td><td>はい</td><td>反対側の眼-排水lympノード+ </td><td> 9.76E + 07 </td></tr></tbody></table> 表1. T彼Luminoscore方法は、異なるアプローチに適応することができます luminoscore方法は、マウスモデルの単一の種類に限定されるものではない。 図3は 、異なるマウスモデルに適合させることができることを示しています。 SCLモデルでは、二つの腫瘍は、マウスの両側にグラフトされます。治療は、0日目に、単一の側にその場で投与され、反対側の腫瘍は、その制御（図3A）として機能します。したがって、2つのROIはマウスあたり描かれた：各側に1（図3C）。処置群および対照側にluminoscoreとの比率は、各腫瘍の相対的な経過を説明します。この比は、治療が投与されたときに、0日目に1に設定しました。我々は、13日間の治療投与後、この比率の有意な減少を観察した（ 図3D;ノンパラメトリック両側マン-ホイットニー検定p = 0.004）。この減少は、処理された側の腫瘍のことを明らかに代表的な生物発光画像（図3B）に示すように、吸収されました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig3.jpg" /> 図二原発腫瘍部位とモデルへのLuminoscore法の3適応。 （A）SCLアッセイの実験的なデザイン。マウスは、各脇腹に2原発腫瘍を注射しました。片側は、治療が投与されたのCpG-DNAまたはODN-制御のいずれかを注射し、そしてPBSで反対側、その制御として機能する。（B）のCpGで処置したマウスおよび対照マウスの代表的な画像は、0日目と13日目されています当日0腫瘍増殖は、マウスののCpG処理した側に阻害された。（C）手動2原発腫瘍部位のために動物あたりの関心領域をマークアップされた。（D）のCpG-処置またはのluminoscores間の比ODN制御側とPBS対照側インデックスであります同じ動物内の各腫瘍の相対的な成長を反映しています。この比率は、のCpG処置群の割合はのCpG-DNAのインサイチュ投与により腫瘍増殖の阻害を明らかにし、（P = 0.004）が有意に減少していたが、13日目に0日目に1に設定されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig3large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。</a>

生物発光イメージングは​​、腫瘍および転移をローカライズするためのよく知られたツールですが、これらの画像の定量化は、多くの場合、複雑な計算や特定の楽器を必要とします。我々には、計算を必要としない、正確な取得条件に基づいて、使いやすいluminoscore方法を説明し、マウスモデルで監視される腫瘍負荷および治療応答を可能にします。

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

このイメージング手順の全体的な目的は、バイオルミネッセンスの取得手順と画像解析を標準化し、異なる実験内または実験間での比較に適した定量的データを得ることにあります。本手法は、「イメージングデータを再現可能な方法でどのように定量化できるか」といった、バイオルミネッセンスイメージング分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、バイオルミネッセンスイメージャーを保有するあらゆる動物施設で容易に導入できること、および複雑な計算を必要としないことです。イメージング装置の電源を入れ、撮影ソフトウェアを開きます。「Initialize」をクリックし、カメラ、ステージ、およびレンズを初期化します。足へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認して適切な鎮静レベルであることを確かめた後、マウスをウォーミングパッドの上に置き、眼軟膏を塗布します。次に、25ゲージの針を用いて、調製したばかりのD-ルシフェリンカリウム塩溶液100 µLを腹腔内に注射します。この場合、腫瘍細胞はホタルルシフェラーゼを発現しています。このタンパク質がD-ルシフェリンを酸化させ、イメージング装置で検出可能な光を生成します。10分後、マウスを伏せ状態でイメージャーに設置し、背中をカメラに向け、できるだけ平らな状態で配置します。自動露出機能を選択し、[Acquire]をクリックして動物の背面画像を撮影します。次に、マウスを仰向けの状態にし、前肢を広げて胸部を遮らないようにします。自動露光のチェックボックスが選択されていることを確認し、動物の前面の画像を撮影します。その後、マウスが完全に回復するまで保温パッドに戻し、回復した時点でケージに戻します。生物発光を定量化するには、メニューの「View」をクリックし、「Tool Palette」が表示されていない場合はそれを選択します。次に、「関心領域（ROI）」ツールのタブをクリックし、「輪郭（contour）」ボタンを選択して、「フリードロー（Free Draw）」を選びます。フリードローツールを使用して、前面図画像内のマウス全体または特定の領域の縁を 따라いって関心領域を指定し、右クリックして輪郭を閉じます。画面左上の「単位（Units）」スクロールメニューで、「Radiance」が選択されていない場合は、それを選択してください。その後、「Total Flux photons per second」ボックスの値を読み取り、光子束を測定します。次に、「View」メニューから「region of interest measurements」をクリックします。背面像についても同様に解析を行い、両方の視点から得られた光子束の値を加算して、ルミノスコア（luminoscore）を算出します。本実験では、注入後わずか10分で腫瘍が検出されました。画像のみで、腫瘍細胞が正しい位置に存在することが確認できます。しかし、バイオリミネッセンスを定量化したことで、注入を行った動物と行わなかった動物との間に明確な差があることが示されました。興味深いことに、皮下モデルで得られたシグナルは、注入された細胞数と一致して、原発性眼内リンパ腫モデルよりも100倍高くなりました。ここで、コントロール群およびCpG投与群の原発性眼内リンパ腫マウスにおける代表的な腫瘍増殖画像を示すと、十分な期間が経過した後、コントロール群において転移が出現し始めることがわかります。原発腫瘍は治療に対して感受性を示しませんでしたが、CpG投与群では転移の数が少ないことが観察されました。実際に、各群の腫瘍負荷を定量的に分析した結果、CpGが腫瘍の発達を遅らせることが示され、28日後には処理群と対照群の間で腫瘍のルミネッセンスに統計的に有意な差が認められました。この皮下モデルでは、マウスの両側に2つの腫瘍を移植し、0日目に片側にのみin situで処理を行い、対側にある腫瘍を対照として用いました。その後、マウス1匹につき2つの関心領域（ROI）を設定し、処理側と対照側のルミノスコアの比率を測定しました。治療の投与から13日後、ルミノスコア比の有意な低下が観察され、対応するバイオルミネッセンス画像によってさらに裏付けられたように、処理した腫瘍が吸収されたことが明らかになりました。適切に実施すれば、投与後のこの解析は動物1匹あたり2分で完了させることができます。この手順に続き、腫瘍細胞のホーミングや転移メカニズムに関する追加の疑問に答えるために、腫瘍部位の定性的部位特定などの他の手法を実施することが可能です。この手法の開発により、研究者および生物発光イメージングの分野において、前臨床小型動物モデルを用いた腫瘍進行の探索が可能となりました。このビデオを視聴することで、再現可能な方法で腫瘍負荷量を定量化するための生物発光イメージングの実施手順を十分に理解できるはずです。小型動物や手術器具の取り扱いは非常に危険を伴う場合があるため、本手順の実施にあたっては、器具の適切な滅菌などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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