マウスリンパ腫モデルで腫瘍の進行と治療効果を監視するための生物発光に基づく腫瘍の定量法

このイメージング手順の全体的な目的は、バイオルミネッセンスの取得手順と画像解析を標準化し、異なる実験内または実験間での比較に適した定量的データを得ることにあります。本手法は、「イメージングデータを再現可能な方法でどのように定量化できるか」といった、バイオルミネッセンスイメージング分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、バイオルミネッセンスイメージャーを保有するあらゆる動物施設で容易に導入できること、および複雑な計算を必要としないことです。

イメージング装置の電源を入れ、撮影ソフトウェアを開きます。「Initialize」をクリックし、カメラ、ステージ、およびレンズを初期化します。足へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認して適切な鎮静レベルであることを確かめた後、マウスをウォーミングパッドの上に置き、眼軟膏を塗布します。

次に、25ゲージの針を用いて、調製したばかりのD-ルシフェリンカリウム塩溶液100 µLを腹腔内に注射します。この場合、腫瘍細胞はホタルルシフェラーゼを発現しています。このタンパク質がD-ルシフェリンを酸化させ、イメージング装置で検出可能な光を生成します。

10分後、マウスを伏せ状態でイメージャーに設置し、背中をカメラに向け、できるだけ平らな状態で配置します。自動露出機能を選択し、[Acquire]をクリックして動物の背面画像を撮影します。次に、マウスを仰向けの状態にし、前肢を広げて胸部を遮らないようにします。

自動露光のチェックボックスが選択されていることを確認し、動物の前面の画像を撮影します。その後、マウスが完全に回復するまで保温パッドに戻し、回復した時点でケージに戻します。生物発光を定量化するには、メニューの「View」をクリックし、「Tool Palette」が表示されていない場合はそれを選択します。

次に、「関心領域（ROI）」ツールのタブをクリックし、「輪郭（contour）」ボタンを選択して、「フリードロー（Free Draw）」を選びます。フリードローツールを使用して、前面図画像内のマウス全体または特定の領域の縁を 따라いって関心領域を指定し、右クリックして輪郭を閉じます。画面左上の「単位（Units）」スクロールメニューで、「Radiance」が選択されていない場合は、それを選択してください。

その後、「Total Flux photons per second」ボックスの値を読み取り、光子束を測定します。次に、「View」メニューから「region of interest measurements」をクリックします。背面像についても同様に解析を行い、両方の視点から得られた光子束の値を加算して、ルミノスコア（luminoscore）を算出します。

本実験では、注入後わずか10分で腫瘍が検出されました。画像のみで、腫瘍細胞が正しい位置に存在することが確認できます。しかし、バイオリミネッセンスを定量化したことで、注入を行った動物と行わなかった動物との間に明確な差があることが示されました。

興味深いことに、皮下モデルで得られたシグナルは、注入された細胞数と一致して、原発性眼内リンパ腫モデルよりも100倍高くなりました。ここで、コントロール群およびCpG投与群の原発性眼内リンパ腫マウスにおける代表的な腫瘍増殖画像を示すと、十分な期間が経過した後、コントロール群において転移が出現し始めることがわかります。原発腫瘍は治療に対して感受性を示しませんでしたが、CpG投与群では転移の数が少ないことが観察されました。

実際に、各群の腫瘍負荷を定量的に分析した結果、CpGが腫瘍の発達を遅らせることが示され、28日後には処理群と対照群の間で腫瘍のルミネッセンスに統計的に有意な差が認められました。この皮下モデルでは、マウスの両側に2つの腫瘍を移植し、0日目に片側にのみin situで処理を行い、対側にある腫瘍を対照として用いました。その後、マウス1匹につき2つの関心領域（ROI）を設定し、処理側と対照側のルミノスコアの比率を測定しました。

治療の投与から13日後、ルミノスコア比の有意な低下が観察され、対応するバイオルミネッセンス画像によってさらに裏付けられたように、処理した腫瘍が吸収されたことが明らかになりました。適切に実施すれば、投与後のこの解析は動物1匹あたり2分で完了させることができます。この手順に続き、腫瘍細胞のホーミングや転移メカニズムに関する追加の疑問に答えるために、腫瘍部位の定性的部位特定などの他の手法を実施することが可能です。

この手法の開発により、研究者および生物発光イメージングの分野において、前臨床小型動物モデルを用いた腫瘍進行の探索が可能となりました。このビデオを視聴することで、再現可能な方法で腫瘍負荷量を定量化するための生物発光イメージングの実施手順を十分に理解できるはずです。小型動物や手術器具の取り扱いは非常に危険を伴う場合があるため、本手順の実施にあたっては、器具の適切な滅菌などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。