核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、将来の胚発生を完全に維持する能力に応じて、クロマチン組織に基づいてマウス胞子卵子を特徴付けるために必要なすべてのステップを詳述することです。この方法は、哺乳類の卵巣の胞状コンパートメントに存在する2種類の胞状卵子、SN(囲まれた核小体)とNSN(非囲まれた核小体)を区別して分離する方法など、発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。卵巣を採取するには、まず生後3〜6週齢の雌マウスIPに2.5国際単位の妊娠牝馬血清ゴナドトロピンを注射します。

2日後、収穫の約1時間前に、滅菌シャーレ1枚にM2培地を入れ、2枚目のシャーレに20ミリリットル滴のM2培地を数滴加え、各滴を1.5ミリリットルの鉱油で覆います。次に、すべてのペトリ皿を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに移して、培地を平衡化させます。次に、滅菌解剖ハサミを使用して腹壁を覆う皮膚を切開し、続いて最初にホルモンを注射したマウスの腹膜を切開します。

滅菌ピンセットを使用して腸を脇に動かし、膀胱から始まるV字型を形成する子宮管の位置を特定します。腎臓の下の卵巣を見つけた後、1つの子宮管をつかみ、組織の底を少し切開して対応する卵巣を解放します。このプロセスを繰り返してもう一方の卵巣を採取し、次に両方の卵巣を事前に平衡化されたM2培地で満たされたペトリ皿に入れます。

胞状卵子を分離する前に、ガラスパスツールピペットの両端をつかみ、ピペットをブンゼンバーナーの炎の上に水平に保持することにより、ガラス製のマウスピペットを作成します。ガラスが溶け始めたら、ピペットを炎から取り出し、機器をすばやく引き離します。指の爪を使って、余分なガラスをピペットの狭い部分の近くでしっかりと切り取って先端を短くし、毛細管内径を約100ミクロンにします。

ピペットの直径が適切であることが重要です。狭すぎると、オイクテスが動かなくなり、断片化して死んでしまいます。次に、ピペットの未修正の端を吸引器チューブに接続します。

次に、卵巣を1ミリリットルの事前に平衡化されたM2培地を含むシャーレに移し、滅菌インスリン注射針を使用して卵巣の胞状卵胞に穏やかに穴を開けます。卵子が放出されたら、卵胞細胞やその他の組織の破片を吸引しないように注意しながら、マウスピペットで卵子をやさしく集めます。.次に、各卵子を複数の事前に平衡化したM2培地滴にすばやくピペットで移し、卵母細胞の透明帯に付着した卵丘細胞をすべて除去します。

卵子が剥離したら、新鮮な平衡化したM2培地の個々の滴の底に卵子を慎重に沈めます。卵子を染色するには、マウスピペットを使用して、M2培地で希釈した20マイクロリットルのHoechst 33342に細胞を移します。次に、卵子を鉱油で覆われた5マイクロリットルのM2培地を含む新しいシャーレに移し、各滴の底に卵子を個別に沈殿させるように注意します。

すべての卵子が移植されたら、ディッシュを蛍光顕微鏡の下に置き、核小体の周りにリングが存在するか存在しないかを視覚化するのに十分な時間、細胞を興奮させます。卵子が露出しすぎないように注意してください、なぜなら、クロマチンが損傷し、卵子が長時間露出しすぎると卵子が死滅する可能性があるためです。SNおよびNSN卵子が同定されたら、クロマチン組織に従って、目的のダウンストリーム分析のために、関連する試薬で細胞を適切な対応するペトリ皿に選別します。

クロマチン組織化のためのHoechst 33342染色は、おそらくこの手順の最も重要なステップです。5秒から10秒の励起は、各卵子の核小体を取り巻くクロマチンの有無に基づいて卵子を選別するのに十分な長さであるべきです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間未満で完了できます。

この手順を試みるときは、室温で作業し、卵巣と卵子の両方を優しく治療することを覚えておくことが重要です。この手順の後、卵子は体外成熟および体外受精に使用できます。その開発後、この技術は、発生生物学の分野の研究者が、哺乳類の卵巣に存在する2種類の胞状卵子をどのように認識し、区別するかという未解決の問題に答える道を開きました。

このビデオを見れば、自分のマウスピペットの作り方や使い方、Hoechst 33342染色による胞状卵子の単離や選別方法についてよく理解することができます。動物や細胞を扱う作業には、個人用保護具の着用や滅菌器具の使用など、特別な予防措置が必要であることを忘れないでください。