ターゲティングされたのsRNAのファージ媒介送達はにおける遺伝子発現をノックダウンするために構築します E。大腸菌

この手順の全体的な目標は、増加する大腸菌の集団で関心のある遺伝子をノックダウンすることです。遺伝子ノックダウンは、遺伝子機能の基本的な問題を探求するためによく使用されます。これらの方法は、合成生物学にも応用できる可能性があります。

たとえば、病原性因子などの不要な遺伝子をサイレンシングします。この技術の主な利点は、事前の遺伝子改変なしで大腸菌のバッチ培養で実施でき、数時間後に結果が観察できることです。まず、テキストプロトコルに従って設計されたsRNA発現カセットを含むプラスミドを使用して、まず発現カセット内の24塩基対ガイド配列を同定することにより、配列に対して部位特異的変異誘発を行います。

既存のsRNAカセットと相同性の短い領域を持つフォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、合成し、新しい24塩基対ガイド配列に隣接します。LBおよびテンプレートsRNA発現ファージミドを運ぶ抗生物質で大腸菌の5ミリリットルの培養物を準備します。細胞を摂氏37度で一晩振とうしながら成長させます。

培養物からテンプレートsRNAファージミドを抽出して精製した後、推奨量の10〜50倍のsRNAファージュミドとハイフィデリティポリメラーゼのDNAテンプレートを使用して、2つのPCR反応を調製します。フォワードプライマーとリバースプライマーで1つずつ準備します。標準的なPCR条件を使用して反応を実行した後、2つの反応を微量遠心チューブで組み合わせます。

次に、沸騰した水浴で摂氏98度に加熱して製品を焼きなましします。すぐに熱源をオフにし、次の1〜2時間でバスをゆっくりと室温に戻します。変異していないテンプレートsRNAを除去するには、混合物に1マイクロリットルのDpnI制限酵素を加え、摂氏37度で1時間、またはメーカーが推奨する完全消化時間インキュベートします。

次に、化学的にコンピテントな大腸菌細胞を、アニールしたPCR産物の1〜5マイクロリットルで形質転換します。次に、抗生物質をLBプレートに選択的にプレーティングすることにより、単一コロニーを単離します。コロニーPCRに正しいガイド配列が組み込まれていることを確認する。

200マイクロリットルのピペットチップを使用して、1つの形質転換コロニーから少量の細胞を採取します。採取した細胞を50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に微量遠心チューブで加え、ピペッティングで混合します。次に、ベンチトップサーモサイクラーまたは沸騰水浴を使用して、セルを摂氏95度に2分間加熱して溶解します。

溶解した細胞の1マイクロリットルをDNAテンプレートとして、ここに示す条件に従ってPCRを実施します。正しいガイド配列を確認した後、5ミリリットルの培養物に正しいsRNAクローンを接種し、細胞を一晩成長させます。翌日、750マイクロリットルの一晩培養物と250マイクロリットルの60%グリセロールをスクリューキャップクライオチューブに組み合わせて、グリセロールストックを調製します。

M13パッケージファージミドストックを調製するには、sRNA発現ファジミドを担持した大腸菌の5ミリリットルの一晩培養液を調製します。また、M13KO7ヘルパープラスミドを運ぶ大腸菌の5ミリリットルの一晩培養物を準備します。翌日、DNAを精製した後、化学的にコンピテントな大腸菌を、sRNA発現のファージミドとヘルパープラスミドのそれぞれ1マイクロリットルと共形質転換します。

LB寒天培地に抗生物質を充填し、両方のコンストラクトに選択します。ファージミドの発現は、細胞にとって大きな適応度負担であり、形質転換効率を低下させる可能性があります。プラスミドを2つの連続した形質転換ステップで導入する必要がある場合があります。

形質転換細胞を摂氏37度で一晩インキュベートした後、共形質転換株の単一コロニーから10ミリリットルの培養物を調製します。翌朝、培養物を3300 x gで10分間遠心分離します。上清を収集し、0.2ミクロンのフィルターでろ過します。

包装されたファージミド濾液を摂氏4度で保存します。F+標的細胞を調製した後、テキストプロトコルに従って、単一のコロニーを5ミリリットルのLB培地培養物に抗生物質を接種し、振とうしながら摂氏37度で一晩増殖させます。翌日、5ミリリットルの選択的LB培地を使用して、F+標的細胞を1〜100に希釈し、インキュベートを続けます。

OD600が0.3になるまで、細胞を約2時間培養し、対数期の成長を示します。サイレンシングを標的とする細胞は、効率的なファージュミド感染のためにF pilusサイレンスの発現が指数関数的な段階にある必要があります。M13パッケージ化されたファージミドを標的細胞に100倍の割合で追加すると、標的集団の感染率が約99%になります。

感染を摂氏37度で進行させ、30〜60分間振とうします。次に、必要に応じてsRNAサイレンシング表現型をアッセイします。このビデオで示したプロトコールに従って、プラスミドpABのsRNAサイレンシングカセットを調製します。

001はターゲットをmKate2に変更しました。この図は、抗mKate2ファージミドに感染した大腸菌株が、バックグラウンド上で検出可能なmKate2蛍光を示さなかったことを示しています。しかし、この株はGFPを発現し、ファージミドの取り込みが成功したことを示しています。

この実験では、染色体に統合されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT遺伝子)を持つ大腸菌株に、CATを標的とするファゲミドを感染させ、クロラムフェニコール耐性のsRNAサイレンシングを試験しました。ファゲミドがCATを標的とした細胞は、低クロラムフェニコール濃度で生存率が低下し、高濃度で約99%の死滅を示しました。一方、非感染細胞、またはmKate2をサイレンシングしたsRNAに感染した細胞は、試験したすべての濃度でクロラムフェニコールに耐性を示しました。

ここに示すように、ファゲミドを運ぶ細菌のみを選択するために使用されていたアンピシリンの添加は、クロラムフェニコールの生存を検出できないレベルまで低下させました。sRNAの標的遺伝子を改変し、感染したファージミドを作製することは5日で完了します。ファージの取り扱いは、研究室内の他の実験にとって非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、不要な汚染を避けるために、専用の実験器具を使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

このビデオを見れば、感染したファージミドを設計、クローニング、作製する方法を十分に理解することができ、sRNAを保有して、活発に成長している大腸菌の集団で関心のある遺伝子をノックダウンすることができます。