Name: パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶ金ナノ粒子統合型光応答性リポソームの合成法とパルスレーザー励起によるマイクロバブルキャビテーション測定技術。標的薬物送達における光制御放出メカニズムの解明に貢献します。

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この作品は、部分的に教育のシンガポール省（CXへRG 12分の64）とナノメディシンのNTU-北西部研究所がティア1学術研究資金によってサポートされていました。

1.準備<ol><li>王水（濃硝酸（HNO 3）を1部、濃縮塩酸（HCl）の3部）を使用してクリーンな100mlの丸底フラスコに、DI水でフラスコを洗浄します。フラスコをオートクレーブし、15分間100℃の熱風オーブン中でそれらを乾燥させます。ラップし、使用するまで無菌フラスコを格納します。 </li><li> 70％エタノールを用いてハンドヘルドミニ押出機のセットを滅菌します。 </li><li>回転蒸発器をオンにして、それぞれ37℃と4℃の湯浴と冷却塔の温度を設定します。 </li><li> 10 mlの0.1 mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）中のカルセインの374ミリグラムを溶解することによって原液をカルセイン60mMのを準備します。 1 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を用いてpHを7.4に調整します。 </li></ol>リポソームの2.合成<ol><li>脂質を除去（1,2- Dipalmitoyl- のsn -glycero-3ホスホコリン（DPPC）、1-パルミトイル-2-ヒドロキシSN -glycero-3-phosphochoライン（MPPC）及び1、2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol -アミンN - [カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩）（DSPE-PEG2000））冷凍庫から（-20°C）そしてRTにそれらを解凍。 </li><li> 15.9 mgのDPPC、1.3 mgのMPPC、および2.8 mgのDSPE-PEG2000を秤量します。 2ミリリットルのクロロホルムにそれらを一緒に溶かします。 </li><li>滅菌した丸底フラスコにクロロホルム溶液を移し、薄い、乾燥した脂質層を形成するために、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させます。 </li><li> 2ミリリットルでステップ1.4および50μlの金のNP（3.36×10 16粒子/ ml）で調製した1.95ミリリットルの60mMカルセインを含む30分間の水溶液を45℃での脂質層を水和。 </li><li> 45°Cに加熱ブロックを予熱。フィルタ支持体間200nmのポリカーボネートメンブレンフィルターを置き、ミニ押出機のセットを組み立てます。 DI水との潜在的な漏れをチェックします。 </li><li>ステップ2.4​​とextruからリポソーム溶液1ミリリットルと注射器のいずれかを記入組み立てミニ押出機のもう一方の端にシリンジに溶液を通過させることにより、サンプルド。 11回繰り返します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って溶離液としてPBSを使用して自由にAuのNP、脂質およびカルセインを除去するために、PD-10脱塩カラムを経て合成リポソームを実行します。 </li><li> 4℃で滅菌チューブ内のサンプルを保管し、2日後に使用します。 </li></ol>ヒーターを有するリポソームから3カルセインリリース<ol><li>ステップ2.2でDPPC、MPPC、およびDSPE-PEG2000のモル濃度を追加することにより、原液の脂質モル濃度を計算します。 0.1 mMのPBS緩衝液（pH7.4）を使用して、5 mMの脂質濃度にリポソーム原液を希釈します。遠心管（2ミリリットル）にサンプルを転送します。 </li><li>湯浴中でチューブを置き、25から70℃まで徐々に温度を上昇させます。ここでは1℃/分の速度で温度を上げます。 </li><li>異なる温度点（27、32、37、39、41でアリコート（10μl）を収集し、43、45、52、57、62、67及び70℃）。 </li><li> RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。 </li><li> 96ウェルマイクロプレートの各ウェルにリポソーム溶液200μlを移し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて収集されたサンプルの蛍光強度を測定します。カルセインの励起および発光波長は、それぞれ480および515 nmです。 </li><li> 100％放出としてトリトンX-100処理されたサンプルの蛍光強度を取って、数式を使用して、各時点で放出されたカルセインの割合を計算します。 <img alt="Formula1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> FTは、所与の時点での溶液の蛍光強度です。 F iとF xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。 </li></ol> 4.カルセイン再パルスレーザーを用いたリポソームからリース<ol><li>石英キュベットに100μlのリポソーム溶液を移し、キュベットホルダーに入れてください。光源として波長532nmでの6ナノ秒のパルス持続時間を持つ：YAGレーザーパルスのNdを使用してください。次のレーザーパラメータを使用してください - 繰り返しレート：1 Hzの。レーザーエネルギー密度：1ミリジュール/ cm 2で、ビーム径0.5 mmです。 </li><li>光はリポソーム溶液を通過するように、キュベットを介して平行レーザビームを案内し、様々なパルスの後に一定分量を収集します。 </li><li> RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。 </li><li>カルセインを考慮すると、光に敏感であり、レーザー実験中に漂白することができ、リポソームのリリースからデータを正規化するために、カルセイン液にパルスレーザーの漂白効果を事前に測定します。 <ol><li>具体的には、カルセイン溶液（60 mM）のパルスレーザのwiへを公開パルス数（0、25、50および100）を変化させるための1ヘルツの番目の周波数。前とレーザー露光した後、それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長のカルセインの蛍光強度を測定します。 </li><li>漂白の量（レーザー露光/特定のパルス数の後にカルセインの蛍光強度の前にカルセインの蛍光強度）を計算します。因子を有するリポソームの蛍光強度を乗算することにより、リポソーム試料から得られた値を正規化するためにこの係数を使用。 </li></ol></li><li>それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長で蛍光マイクロプレートリーダーを使用して採取された試料の蛍光強度を測定します。 </li><li> 100％放出としてトリトンX-100で処理した試料の蛍光強度を取って、それぞれのパルス数で放出カルセインの割合を計算し、式を用いて。 <img alt="Formula1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> iとF xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。 </li></ol>圧力インパルスの5測定<ol><li>顕微鏡スライド上に100μlの試料を置き、サンプルにレーザの焦点を設定します。 </li><li>溶液中に針ハイドロホン（直径1mmおよび450はnV / Paの感度）を浸し。 注意：ハイドロホンは、損傷を避けるために、レーザー光を照射することはできません。 </li><li>様々なパルス数（0-100）とパルスエネルギー（20から160μJ/パルス）でパルスレーザーを試料に照射します。 </li><li>デジタルオシロスコープを使用して圧力信号を記録します。 </li></ol>

<ol><li>McCoy, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+drug+delivery+from+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Triggered drug delivery from biomaterials.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).</li>
<li>Yavuz, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocages+covered+by+smart+polymers+for+controlled+release+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light.</a> Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).</li>
<li>Gohy, J. F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-responsive+block+copolymer+micelles%3A+design+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior.</a> Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).</li>
<li>Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+testing+of+a+new+temperature-sensitive+drug+delivery+system+for+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).</li>
<li>Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+drug+delivery+and+hyperthermia%3A+the+materials+design+and+preclinical+and+clinical+testing+of+low+temperature-sensitive+liposomes+used+in+combination+with+mild+hyperthermia+in+the+treatment+of+local+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Nanomed.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer.</a> Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).</li>
<li>Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+exposure+in+animals+can+be+visualized+in+the+skin+and+analysed+via+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy.</a> Nat. Commun. 5, 3796(2014).</li>
<li>Paasonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+enable+selective+light-induced+contents+release+from+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes.</a> J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remotely+Triggered+Liposome+Release+by+Near-Infrared+Light+Absorption+via+Hollow+Gold+Nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).</li>
<li>Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+Light-Induced+Release+from+Plasmon+Resonant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes.</a> Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).</li>
<li>Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-IR+Remote+Release+from+Assemblies+of+Liposomes+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).</li>
<li>Mills, J. K., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolipid+incorporation+in+dipalmitoylphosphatidylcholine+bilayer+membranes+enhances+the+ion+permeability+and+drug+release+rates+at+the+membrane+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).</li>
<li>Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+Photothermal+Conversion+Efficiencies+of+Plasmonically+Heated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles.</a> J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).</li>
<li>Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChongsiriwatana%2C+N+%22Antimicrobial+Peptides%22">Antimicrobial Peptides</a>. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).</li>
<li>Egerev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+signals+generated+by+laser-irradiated+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles.</a> Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).</li>
<li>González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+size-dependent+photoacoustic+effect+on+gold+nanoparticles+by+laser-induced+nanobubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles.</a> Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).</li>
</ol>

利害の競合が宣言されていません。

薄膜水和は、リポソームを調製するための従来の方法です。有機溶媒（この場合はクロロホルム）まず、脂質を溶解するために使用し、次いでフラスコに脂質薄膜を生成するために、37℃でロータリーエバポレーターで除去しました。この脂質膜は、60mMのカルセインと5nmの金のNPを含有する水溶液で水和しました。水和プロセスの間、温度を約50℃に維持し、フラスコを常にフラスコを回転させて撹拌しました。この段階で鍵が蒸発し、水和がそれぞれ行われた時に温度の選択です。 DPPCリポソームの主成分の相転移温度（T m）は、41°Cです。脂質の形成時にフィルム、温度は乾燥した脂質の凝集した塊の形成を防止するために、41℃以下であるべきだと思います。水和中、T mより高い温度は、リン脂質を駆動するために選択されました球状​​の多層構造に自己集合します。薄膜水和法を実行するのは簡単であるが、それは、水溶液中のカルセイン及びAu NPの乏しいカプセル化効率（&lt;1％）によって制限されます。将来的には、カプセル化は、凍結融解サイクルにより改善される可能性があります。 ...

外部刺激を用いた薬物放出をトリガーする可能性が最大化された特異性と最小限の副作用で、spatial- temporal-および用量制御ファッションで薬物を送達するための魅力的な方法です。外因性の刺激応答システム（光、磁場、超音波、マイクロ波放射）の広い範囲の中で、光トリガ型プラットフォームは、診療所での非侵襲性、シンプルさと適応性に起因して、魅力的である。過去10年間に1広範な研究薬、3および自己組織porphysomeのnanovesiclesと結合したスマートポリマー、2光不安定性、ポリマーナノ粒子（NPS）で被覆された近赤外光を担当する金（Au）などのプラットフォーム技術、ナノケージのさまざまなを提供してきました。4しかし、 、これらの技術は、開発の前臨床段階にまだある、と開始および続きのプロセスに関与するパラメータの明確な理解と最適化が必要薬物放出をローリング。 このようなシステムを製造するための最も簡単かつ容易にアクセスできる方法の一つは、市場で広く入手可能であり、広範囲に前臨床、さらには臨床試験で研究されてきたどちらも熱感受性リポソーム5,6と金のNPを統合することです。近赤外活性化のAuナノ構造体（ 例えば、ナノケージ）と比較すると小さな動物またはヒトにおける局所送達のために使用される場合、それらのプラズモン波長でのAu NPの深部組織の活性化の限界にもかかわらず、このシステムは、依然として非常に有望です。 7光点弧のリリースのためにリポソームとのAuのNPを組み合わせることでいくつかの初期の努力があります。8月11日に 、それらのほとんどは材料の新規性に焦点を当てながら、アクセシビリティとスケーラビリティの問題に対処する必要があります。また、これらのナノキャリアを使用して、放出機構に関する報告はまだ限られています。 ここで、光応答性の製作同時に薬物や親水性のAuのNPが装填されたリポソームは、記載されています。カルセインは、カプセル化効率及びシステムの放出プロフィールを評価するために、モデル化合物として使用されます。また、このシステムでは、金のNPによって吸収された光は、局所的な温度の上昇をもたらす、熱の形で周囲の微小環境に消散します。空気の微小気泡は、レーザー加熱時に生成されたリポソーム（ 図1）の機械的破壊を引き起こしています。マイクロバブルキャビテーションのメカニズムは、ハイドロホンの測定によって確認されます。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>850355P</td><td>Powder, Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (MPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (アラバマ州、米国)</td><td>855675P</td><td>粉末、-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール-アミン-<>N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)(DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>880120P</td><td>Powder, Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>金ナノ粒子</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>752568-100mL</td><td>5&nbsp;nm粒子、0.1&nbspで安定化;mM PBS</td></tr><tr><td>カルセイン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C0875-10g</td><td>60&nbsp;mM, pH 7.4 (NaOHで調整)</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>0.1 mM, pH 7.4</td></tr><tr><td>二度蒸留水</td><td>ミリポア Milli-DI浄水システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ、ライフサイエンス</td><td>X-100</td><td>リポソームを破壊して総カプセル化</td></tr><tr><td>を計算する ロタバポラポロ&nbsp;&nbsp;</td><td>Buchi(スイス)</td><td>R 210</td><td>リポソスメ調製に使用</td></tr><tr><td>ヒーティングバス</td><td>Buchi(スイス)</td><td>B 491</td><td>リポソスメ調製に使用</td></tr><tr><td>真空コントローラー&nbsp;&nbsp;</td><td>Buchi(スイス)</td><td>V-850</td><td>Lipososme調製に使用</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>Buchi(スイス)</td><td>V-700</td><td>Lipososme調製に使用</td></tr><tr><td>温度調節器付き再循環槽</td><td>Polyscience</td><td></td><td>Lipososme調製に使用</td></tr><tr><td>加熱ブロック付きミニ押出機アセンブリ&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids (アラバマ州、米国)</td><td>610000</td><td>リポソームの押出成形に使用</td></tr><tr><td>シリンジ、1,000 &#956;l</td><td>Avanti Polar Lipids(アラバマ州、米国)</td><td>610017</td><td>リポソームの押出に使用</td></tr><tr><td>ポリカーボネートフィルターメンブレン、200&nbsp;nm</td><td>Whatmann</td><td>800281</td><td>リポソームの押出に使用</td></tr><tr><td>フィルターサポート Avanti</td><td>Polar Lipids(アラバマ州、米国)</td><td>610014</td><td>リポソームの押出に使用</td></tr><tr><td>PD 10 脱塩クーラム、Sephadex G-25 中</td><td>GEヘルスケア、ライフサイエンス</td><td>17-0851-01</td><td>リポソームの精製に使用</td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma Laboratory Centrifuges</td><td>3K30</td><td>リポソーム溶液の濃縮に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ローター</td><td>シグマ</td><td>19777-H</td><td>リポソーム溶液の濃縮に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ゼータサイザー&nbsp;&nbsp;</td><td>ナノZSマルバーン</td><td></td><td>リポソームサイズとゼータ電位の測定に使用</td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>島津</td><td>製作所 UV-2450</td><td>サンプルの吸光度を測定するために使用</td></tr><tr><td>蛍光分光蛍光光度計&nbsp;&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M5</td><td>サンプルの蛍光発光を測定するために使用されます</td></tr><tr><td>Nd:YAG レーザー</td><td>NewWave Research</td><td></td><td>532 nm;最大電力:17&nbsp;mJ;幅:406&nbsp;NSCの;サンプル照射</td></tr><tr><td>HNRハイドロフォン</td><td>ONDA</td><td>HNR-1000</td>直径<td>1 mm、感度450 nV / Paに使用、適切な動作周波数範囲:0.25-10&nbsp;メガヘルツ;キャリブレーション:50&nbsp;mV/バー;音響信号の測定に使用</td></tr><tr><td>デジタルオシロスコープ</td><td>LECORY - Wave Runner 64Xi-A</td><td></td><td>周波数:600MHz;最大サンプルレート:10&nbsp;Gs/sec (2チャンネル時)測定された音響信号を記録するために使用されます</td></tr></tbody></table>

パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

光応答性ナノ粒子(NP)は、薬物放出に対する空間的、時間的、および投与量の制御を提供する可能性のために、かなりの注目を集めています。しかし、関連する技術のほとんどはまだ開発過程にあり、クリニックでは調達できません。ここでは、市販の金NPと熱応答性リポソームを使用して、これらの光応答性NPを容易に製造する方法について説明します。カルセインは、熱/光刺激によるカプセル化効率と放出速度プロファイルを評価するためのモデル医薬品として使用されます。最後に、この光トリガー放出がマイクロバブルキャビテーションによって引き起こされる膜の破壊によるものであることを示します。これはハイドロフォンで測定できます。

10：4または7.95：リポソームは86のモル比でDPPC、MPPCおよびDSPE-PEG2000を有する従来の薄膜水和法を用いて調製した0.65：1.39 mg / mlで12のAu NPのサイズは、光を決定することが重要です以下のレーザー励起実験中の変換効率を加熱します。金NPのサイズ、より高いが、変換効率である。13したがって5nmの金のNP小さく、ベンダーからの最小のサンプルは、カプセル化のために選択しました。合成の間、金のNPおよびカルセインを含む水和培地は、その後自由にAuのNPとカルセインを除去するためにサイズの押出およびゲルろ過クロマトグラフィーに供したマルチラメラ小胞を、生成するために追加されました。 カルセインは、親水性の蛍光色素が60 mMの濃度でリポソームの水性コア内にカプセル化されています。 Cのような高濃度では、蛍光自己クエンチをalcein。それは、リポソームから放出されるが、...

このプロトコルは、市販の材料で光応答性リポソームを統合し、金ナノ粒子のための簡単​​な製造方法を説明します。また、パルスレーザーの治療の際に合成されたリポソームのマイクロバブルキャビテーションプロセスを測定する方法を示しています。

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

このプロトコルの全体的な目的は、光応答性リポソームの合成を実演し、これらのリポソームからの光制御による薬物放出のメカニズムを明らかにすることです。この手法は、リポソームを合成し、制御放出の精度を向上させるという主要な課題を解決することで、薬物配送におけるリポソームの光応答性に関する重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、市販の材料を用いて光応答性リポソームを簡便に合成できる点にあります。この技術の意義は、表層組織治療へと広がります。低侵襲な処置の採用およびレーザーデバイスの一部としての活用により、この技術プラットフォームは患者にとってより利用しやすいものになります。最先端のケアと正確な薬剤投与に関する知見を提供するだけでなく、本システムはガイドレーザーを通じて、小型動物や粘膜系などの他の系にも適用可能です。まず、王水を用いて100 mLの丸底フラスコを洗浄します。脱イオン水で洗浄し、オートクレーブで滅菌した後、100 °Cの熱風乾燥機で15分間乾燥させます。その後、滅菌済みフラスコをラップで包み、使用時まで保管してください。70%エタノールを使用して、ハンドヘルドミニエクストルーダーセットを滅菌します。次に、ロータリーエバポレーターの電源を入れ、恒温水槽の温度を37°Cに、冷却塔の温度を4°Cにそれぞれ設定します。374 mgのカルセインを10 mLの0.1 mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、60 mMのカルシウムストック溶液を調製します。1 M 水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを7.4に調整します。脂質をフリーザーから取り出し、室温で解凍します。脂質の解凍後、15.9 mgのDPPC、1.3 mgのMPPC、2.8 mgのDSPE-PEG2000を2 mLのクロロホルムに溶解させます。クロロホルム溶液を滅菌済みの丸底フラスコに移した後、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させ、薄い乾燥脂質層を形成させます。続いて、あらかじめ準備した60 mMのカルシウム溶液1.95 mLと金ナノ粒子50 µLを含む2 mLの水溶液を用い、45 °Cで30分間、脂質層を水和させます。ヒーティングブロックをあらかじめ45 °Cに加熱しておいてください。200 nanometerのポリカーボネートメンブレンフィルターをフィルターサポートの間に挟み、ミニエクストルーダーセットを組み立てます。次に、脱イオン水を用いて漏れがないか確認してください。シリンジの一方に、あらかじめ調製したLiposome溶液を1 milliliter充填し、組み立てたミニエクストルーダーのもう一方の端にあるシリンジに溶液を通すことで、サンプルを押し出します。前のステップを11回繰り返した後、メーカーのプロトコルに従い、溶出液としてPBSを用いて、合成したリポソームをPD-10脱塩カラムに通し、遊離金ナノ粒子、脂質、およびCalceinを除去します。完了後、サンプルを滅菌チューブに入れ、4 °Cで保存します。この時点で、DPPC、MPPC、およびDSPE-PEG2000のモル濃度を合算し、ストック溶液の脂質モル濃度を算出します。リポソームストック溶液を0.1 millimolar PBSを用いて脂質濃度5 millimolarに希釈し、サンプルを2 milliliters centrifuge tubesに移します。次に、チューブを温浴に入れ、温度を25から70 degrees Celsiusまで徐々に上昇させます。異なる温度点において、10 microliterずつ分注して回収します。2% Triton X-100を10 µL、2 mLのリポソーム溶液分注量に添加し、室温で10分間リポソームを消化させ、Calceinを完全に放出させます。その後、リポソーム溶液200 µLを96ウェルマイクロプレートの各ウェルに転送します。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、回収したサンプルの蛍光強度を測定します。Triton X-100処理したサンプルの蛍光強度を100%放出として、以下の式を用いて各時点におけるCalceinの放出率（%）を算出します。リポソーム溶液100 µLを石英キュベットに移し、キュベットをキュベットホルダーに設置します。コリメートされたレーザービームを、光がリポソーム溶液を通過するようにキュベットに通します。その後、回数ごとのパルス照射後に分注量を回収します。続いて、リポソーム溶液の2 mL分注量に2% Triton X-100を10 µL加え、室温で10分間リポソームを消化させ、カルセインを完全に放出させます。レーザーによるカルセイン溶液への退色影響をあらかじめ測定するため、溶液を1 Hzの周波数で異なるパルス数でレーザーに曝露させます。レーザー曝露前後において、励起波長480 nm、蛍光波長515 nmでカルセインの蛍光強度を測定します。ブリーチング量を算出した後、この係数を用いてリポソーム試料から得られた値を正規化します。具体的には、リポソームの蛍光強度にこの係数を掛け合わせます。次に、蛍光マイクロプレートリーダーを用い、励起波長480 nmおよび蛍光波長515 nmで、回収した試料の蛍光強度を測定します。Triton X-100処理した試料の蛍光強度を100%放出としたとき、各パルス数におけるCalceinの放出率（%）を算出します。100 µLのサンプルを顕微鏡スライドガラス上に滴下し、レーザーの焦点をサンプルに合わせます。レーザーは手動でサンプル内を誘導するため、後の実験での不具合を避けるために、ビームの焦点がスライドガラス上ではなく、確実にサンプル内部にあることを確認することが重要です。その後、ニードルハイドロフォンを溶液に浸します。ハイドロホンの先端を、レーザーの焦点から十分な距離を離したサンプルの内部に浸します。これは、レーザーによるハイドロフォンの損傷を防ぐためです。パルス数とパルスエネルギーを変化させながら、パルスレーザーでサンプルに照射します。最後に、デジタルオシロスコープを用いて圧力信号を記録します。金ナノ粒子を含むリポソームと含まないリポソームの間で、放出率に有意な差は見られませんでした。生理的温度において、リポソームは金ナノ粒子の有無にかかわらず漏出率が10%未満であり、ほぼ完全な状態で保持されていました。温度を42°Cまで上昇させると、封入されたCalceinの60〜80%が2分以内にリポソームから放出されました。金ナノ粒子を含むリポソームは、励起によって封入されたCalceinを放出し、パルス数の増加に伴い放出されるCalcein量が増加しました。金ナノ粒子、金ナノ粒子を含むリポソーム、および金ナノ粒子を含まないリポソームで記録された音響信号をここに示します。圧力パルスには正と負の両方の位相が含まれており、溶液中でマイクロバブルが形成され、破裂したことを示唆しています。予想通り、音響信号の振幅はレーザーエネルギーの増加に伴って徐々に増大しました。これは、それに続く熱弾性膨張および収縮に起因する粒子の振動強度の増加によるものと考えられます。リポソームの作製手法を習得すれば、すべてのガラス器具と装置を事前に準備しておくことで、3時間以内に完了させることができます。レーザー制御放出を試みる際は、レーザーエネルギーの損失を防ぐため、レーザービームがサンプルに完全に集光されていることを確認することが重要です。この手順に従い、in vitroおよびin vivoでのレーザー制御放出などの他の実験を行うことで、生理的条件がレーザー制御放出にどのような影響を与えるかといった追加の疑問に答えることができます。この開発後、本技術は反応性の分野において、皮膚、眼、および粘膜への放出を探索、局在化、および制御する上で有用な手段となるでしょう。

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Research

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