DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

このプロトコルの全体的な目標は、ハイスループットシーケンシングにより、動物細胞の目的のタンパク質に関連するゲノムDNA配列を検出することです。この手法は、哺乳類細胞における核組織化および転写または制御の研究における重要な疑問、例えば、核アミロイドまたは特定の転写因子に関連するゲノム領域の同定など、重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、DNAマイクロアレイを使用して、ハイスループットシーケンシングが元のDamIDアセットよりも高い分解能を提供することと、この技術により、当社のハイスループットシーケンシングデータとのクロス解析が可能になることです。

手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるBrennan Olsonです。まず、テキストプロトコールに従って、目的の遺伝子をDamIDベクターにクローニングします。次に、レンチウイルス発現系を用いて、DamV5 POYおよびV5-Damを発現するレンチウイルスストックを作製します。

DamIDベクターをレンチウイルスパッケージングプラスミドとコトランスフェクションし、メーカーのプロトコールに従って順方向トランスフェクション手順を行ってください。ゼロポイント4、5ミクロンPVDFフィルターを使用したろ過ステップを必ず含めてください。次に、細胞にレンチウイルスを感染させる準備をします。

1日前に、接着細胞を6ウェルプレートに通します。抗生物質の使用を続けます。目標は、感染の翌日に50%の合流点を持つことです。

翌日、冷凍したDamV5 POYとV5-Damレンチウイルスの上清を冷凍庫から取り出し、摂氏37度の水浴に入れて解凍します。培養プレート上で、増殖培地を取り出し、抗生物質を含まない半ミリリットルの新鮮な増殖培地と交換します。次に、ウェルに1ミリリットルの解凍したレンチウイルスをロードします。

2つの井戸にV5-Damを、2つの井戸にDamV5 POYを、レンチウイルスを含まない2つの井戸をネガティブコントロールとしてロードします。細胞上で溶液を渦巻き、プレートをインキュベーターに戻します。24時間後、細胞上のウイルス懸濁液を抗生物質を含まない2ミリリットルの成長培地と交換します。

その後、さらに48時間インキュベーションを続けます。2日後、テキストプロトコルに従ってこのプロセスを完了し、ゲノムDNAを分離します(これには約1時間かかります)。次に、ゲノムDNAからアデニンメチル化DNA断片を増幅します。

このプロセスには約2〜3日かかり、詳細はテキストプロトコルでカバーされています。この手順では、まず増幅されたアデニンメチル化DNAを断片化します。DNAフラグメントーゼを使用する前に、まずその強度を測定して適切な消化時間を決定することが重要です。

この診断テストには、利用可能な精製メチルPCR製品を使用してください。まず、6マイクログラムのDNA、12マイクロリットルの10X Fragmentaseバッファーからなるマスターミックスを調製し、114マイクロリットルまで水で満たします。次に、Fragmentaseストックを3秒間ボルテックスし、マスターミックスに6マイクロリットルを加えて合計120マイクロリットルにします。

次に、マスターミックスを3秒間ボルテックスします。次に、5つの反応チューブに20マイクロリットルのマスターミックスを充填し、6つのチューブすべてを摂氏37度でインキュベートします。5分後にチューブを1本取り外し、5マイクロリットルのEDTAを追加して反応を停止します。

これを10分ごとに行い、すべての反応チューブが集まるまで行います。次に、各チューブから12ポイント5マイクロリットル(これは約半分のマイクログラムのDNAに相当)と、アゴロースゲル上の同量の未消化DNAを分析します。ゲルから、塗抹標本の大部分を約ゼロポイント2キロベースまで消化するのに必要な最小時間を決定します。

これを最大消化時間として使用します。次に、プレテストのように実際の断片化を設定し、5 分を含む6つの等間隔の時点で消化を停止し、最大時間を計算します。消化後、6つの消化物を引き出し、PCR精製キットまたは固相可逆固定化ビーズを使用して精製します。

精製したDNAを約15マイクロリットルのEBバッファーで希釈します。次のステップは、断片化されたDNAの末端を修復し、アデニンオーバーハングを追加し、シーケンシングアダプターにリゲードを追加し、Y字型アダプターを二本鎖DNAに変換することです。これらの手順はすべてテキスト プロトコルで詳しく説明されており、完了までに 2 日以上かかることはありません。

シーケンシングアダプターを断片化DNAにライゲーションし、Y字型アダプターを二本鎖DNAに変換した後、目的のサイズの断片を選択します。まず、TAEで2%のアゴロースゲルを調製し、予防策を講じて、臭化エチジウムを最終濃度500ナノグラム/ミリリットルまで添加します。すべてのサンプルと 2 つのはしごが空のレーンで囲まれるように、十分なレーンを作成します。

次に、各DNA溶出液の10マイクロリットルに8マイクロリットルのローディング色素を加え、6倍のローディング色素と水を含む1 Kb Plusラダーを1対1対4の比率で調製します。次に、DNAラダー、DNA溶出液、および別のDNAラダーの順にゲルレーンをロードします。ロードしたら、ゲルを60分あたり120ボルトで泳動させます。

その後、安全メガネとフェイスシールドを装着して、UVライトでジェルを短時間観察します。DNAラダーをチェックして、ゲルが十分に尽きて、3つのゲルスライスを300〜400塩基対で切除できるかどうかを確認します。次に、各レーンから300〜400のベースペアのバンドを切り取り、常にレーンごとに新しいブレードを使用します。

各ゲルスライスを理想的には100マイクロリットル未満にするために、ゲルをできるだけ少なくし、それぞれを独自のマイクロフュージチューブに移します。次に、テキストプロトコルに従ってゲルスライスからDNAを抽出します。抽出したDNAからシーケンシングアダプター修飾フラグメントを濃縮する方法に関するテキストプロトコルに従い続けます。

その後、精製されたDNAをバイオアナライザーで高品質に解析し、期待通りであればシーケンシングに提出します。レンチウイルスは、Dam-V5-lamin B1融合タンパク質を発現するように操作され、アミノ蛍光染色により内因性ラミンB1タンパク質と共局在していることが確認されました。このレンチウイルスとDam-V5融合タンパク質を発現するコントロールレンチウイルスは、どちらもマウスC2C12筋芽細胞に感染するために使用されました。

DNAを収集し、記載されているようにアデニンメチル化フラグメントを増幅し、その後、配列決定しました。次に、1番染色体についてゲノムNL相互作用マップを構築しました。1 つのトラックは、log2 RPKM 比を示しています。

もう一方のトラックは、薄層に関連付けられたドメインを黒で示しています。これらのエリアは、コントロール ダムよりもダム ラミン B1 との関連性が著しく高いエリアです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2週間以内に行うことができます。

このビデオを見れば、DamIDと組み合わせたハイスループットシーケンシングにより、目的のタンパク質に関連するDNA配列を検出する方法について十分に理解できるはずです。エチジウムブロマイドとUVライトでの作業は非常に危険である可能性があるため、ゲルが冷えるのを待ってからエチジウムブロマイドを追加する、目の保護具とフェイスシールドを着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。