Name: DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶDamID-seq法による動物細胞内のタンパク質関連ゲノムDNA配列の検出法。ハイスループットシークエンシングを用いて核構造と転写制御を研究し、他のシーケンスデータとの統合解析も可能です。

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DamID哺乳類発現ベクターを提供してくださったBas van Steensel博士に感謝します。NGSライブラリの準備とハイスループットDNAシーケンシングの実装に関するアドバイスを提供してくださったYale Center for Genome AnalysisおよびYale Stem Cell CenterのGenomics Coreに感謝します。この研究は、イェール大学医学部からのスタートアップ資金、米国心臓協会からの科学者開発助成金(12SDG11630031)、およびコネチカットイノベーション社からのシード助成金(13-SCA-YALE-15)によって支援されました。

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
<li>Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID%3A+mapping+of+in+vivo+protein-genome+interactions+using+tethered+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase.</a> Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).</li>
<li>de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+HP1+binding+in+Drosophila%3A+developmental+plasticity+and+genomic+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals.</a> Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).</li>
<li>DamID mammalian vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm">http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm</a> (2015).</li>
<li>Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/">https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/</a> (2015).</li>
<li>Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/">https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/</a> (2015).</li>
<li>Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).</li>
<li>Encode Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS Biol. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

Damタグ付きタンパク質が内因性タンパク質の機能を保持しているかどうかは、DamID-seq実験の前に調べる必要があります。ダムタグ付き核膜タンパク質の細胞内局在は常に決定し、内因性タンパク質の局在と比較する必要があります。転写因子を研究するために、ダム融合タンパク質が遺伝子発現を調節する内因性タンパク質の機能を救済できるかどうかを調べることが提案されています。この機能試験は、内因性DNA結合タンパク質のノックアウト変異体が利用可能な生物で実行できます。ゲノム工学の進歩により、目的の内因性遺伝子をノックアウトできる可能性があるため、Damタグ付きDNA結合タンパク質の機能を培養哺乳類細胞で調試できます。 
このプロトコルの重要なステップは、DpnII消化されたDamID PCR産物を約200 bpにフラグメント化することに成功することです。このステップは、増幅されたアデニンメチル化フラグメントをシーケンシングのために狭いサイズ範囲にレンダリングし、シーケンシングライブラリ内のDNAフラグメントの開始ヌクレオチドをランダム化するように設計されています。非効率的な断片化は、DNAフラグ...

DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）1,2 は 、in vivoでのタンパク質-DNA相互作用を検出するための方法であり、クロマチン免疫沈降（チップ）3の代替的なアプローチです。それは、細胞の比較的少量を使用して、DNAまたは高度に特異的な抗体を用いてタンパク質の化学的架橋を必要としません。標的タンパク質が緩くまたは間接的にDNAと関連している場合、後者は特に便利です。 DamIDが正常核膜タンパク質4-10、クロマチン関連タンパク質11-13、クロマチン修飾酵素14、転写因子および15-18補因子とのRNAi機械19を含む種々のタンパク質の結合部位をマッピングするために使用されています。この方法は 、Sを含む複数の生物に適用可能ですセレビシエ 13、S。ポンベ 7、C。エレガンス 9,17、D。ショウジョウバエ 5,11,18、20、A。シロイヌナズナ 21,22と同様に、マウスおよびヒト細胞株6,8,10,23,24。 DamIDアッセイの開発は、内因性アデニンメチル化2を欠く真核細胞におけるアデニンメチル化DNA断片の特異的検出に基づいていました。関心及びEの DNA結合タンパク質からなる発現された融合タンパク質、 大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼ（ダム）、ゲノム2中のタンパク質の結合部位に空間的に近接（最も重要な1キロバイト内およびおよそ5キロバイトまで）であるGATC配列中のアデニン塩基をメチル化することができます。修飾されたDNA断片は、特に関心1,25,26のタンパク質のゲノム結合部位を検出するためのマイクロアレイにハイブリダイズし、増幅することができます。この元DamID方法は、マイクロアレイの可用性および所定のプローブの密度によって制限されていました。そこで我々は、高スループットシーケンシングを統合していますDamID 10へとDamID-seqのような方法を指定。 DamID-配列から生成された読み取り、短い多数のゲノムワイドタンパク質-DNA相互作用の正確な位置を可能にします。我々はDamID-seqはゲノム核ラミナ（NL）団体10を研究するためのマイクロアレイによってDamIDよりも高い解像度と広いダイナミックレンジを提供することがわかりました。この改良された方法は、遺伝子構造10内NL関連付けをプロービングでき、このようなチップ-seqの、そしてRNA-seqのような他のハイスループット配列決定データとの比較を容易にします。 ここで説明するDamID-seqのプロトコルでは、最初にマッピングゲノム-NL団体10のために開発されました。我々は、Eに 、マウスまたはヒトのラミンB1を係留することによって融合タンパク質を生成しました大腸菌のDNAアデニンメチルトランスフェラーゼとは、C2C12マウス（データは公開されません）10とIMR90ヒト胎児肺線維芽細胞を筋芽細胞、3T3マウス胚線維芽細胞内のプロトコルをテストしました。このプロトコルでは、我々は、cで始まりますベクターonstructingおよび哺乳動物細胞24にレンチウイルス感染によってダム係留融合タンパク質を発現します。次に、我々は、アデニンメチル化DNA断片を増幅し、他の生物に適用可能であるべきであるシーケンシングライブラリーを調製の詳細なプロトコルを記述します。

<table><tbody><tr><td>ViraPower レンチウイルス発現システム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>K4950-00、K4960-00、K4970-00、K4975-00、K4980-00、K4985-00、K4990-00、K367-20、K370-20、K371-20</td><td></td></tr><tr><td>ゲートウェイ BP クロナーゼ II 酵素ミックス</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>ゲートウェイ LR クロナーゼ II 酵素ミックス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &ティッシュキット (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 または 69504&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ゲートウェイ pDONR 201</td><td>Life Technologies</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</a></td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Σ</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td></td><td></td><td>ブランドは重要ではない</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>ブランドは重要ではない</td></tr><tr><td>200 プルーフ EtOH</td><td></td><td></td><td>ブランドは重要ではない</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td></td><td></td><td>ブランドは重要ではない</td></tr><tr><td>酢酸</td><td></td><td></td>ナトリウム ブランド<td>は重要ではない</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td>には、<td></td></tr><tr><td>バッファーDamIDアダプター「AdRt」および「AdRb」</td>が供給され、参考文献24で利用可能な<td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>配列;セルフライゲーションを防止するために5'または3'末端のリン酸化はありません。</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>ロシュ ライフサイエンス</td><td>10481220001</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>付属 DpnII</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td>ズ <td>R0543</td><td></td></tr> バッファー<tr><td>付属 DamID PCRプライマー "AdR_PCR"</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>参考文献24で利用可能</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド(dNTP)ソリューションセット</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td>ス <td>N0446</td><td>dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各100mM</td></tr><tr><td>アドバンテージ 2&nbsp;ポリメラーゼミックス</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>1Kb Plus DNA</td><td>Ladder Life Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 &micro;g/&micro;l</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104または28106</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28004または28006</td><td>溶出量が30μ未満の場合;l</td></tr><tr><td>SPRIビーズ/ Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>は、40 & micro未満の場合は、追加の混合とより多くの溶出時間を適用します。l 溶出バッファーは、</td></tr><tr><td>バッファー EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ反応バッファー</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ I、ラージ (クレノウ) フラグメント</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌレオチドキナーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3' &#8594; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>バッファ</td></tr><tr><td>シーケンシングアダプター</td>付属 <td>参考文献28</td>Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200<td></td>で利用可能な統合DNAテクノロジーシーケンス<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>3.4.3で使用。Quick Ligation Reaction Buffer および Quick T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>Sequencing Primer 1 and 2</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Sequences available in ref. 28</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2101 または KK2102</td> には <td>KAPA HiFi DNA ポリメラーゼ、5x KAPA HiFi Fidelity Buffer および 10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>ethidium bromide</td> <td>が付属していますSigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704 または 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 または 1725122</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td></td><td></td><td>のブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>0.45 &#956;m PVDF フィルター</td><td></td><td></td><td>のブランドは重要ではない</td></tr><tr><td>25 ml の Seringe</td><td></td><td></td><td>ブランドは重要ではない</td></tr><tr><td>10 cm 組織培養プレートのブランドは</td><td></td><td></td><td>重要ではない</td></tr><tr><td>6 ウェル組織培養プレートのブランドは</td><td></td><td></td><td>重要ではない</td></tr><tr><td>S1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td></td><td></td>の<td>ブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>Dry Block HeaterまたはThermomixer</td><td></td><td></td>の<td>ブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>のブランドは重要ではありません</td></tr><tr>電源<td></td><td></td>のゲル<td>電気泳動システムは</td><td>重要ではありません ブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td></td><td></td><td>SPRIビーズによるDNAの精製用。1.5〜2mlのチューブを保持する必要があります。ブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター</td><td></td><td></td><td>ブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>E-ゲル電気泳動システム</td><td>Life Technologies</td><td>G6400、G6500、G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

damid-配列：アデニンメチル化dna断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-dna相互作用のゲノムワイドなマッピング

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ同定(DamID)アッセイは、局所的およびゲノム全体の両方でタンパク質-DNA相互作用を検出する強力な方法です。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP)の代替アプローチです。目的のタンパク質と大腸菌DNAアデニンメチルトランスフェラーゼからなる発現融合タンパク質は、タンパク質-DNA相互作用の部位近くのGATCモチーフのアデニン塩基をメチル化できます。その後、アデニンメチル化DNA断片を特異的に増幅して検出することができます。オリジナルのDamIDアッセイは、DNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより、メチル化DNA断片のゲノム位置を検出しますが、これはマイクロアレイの利用可能性と所定のプローブの密度によって制限されます。本稿では、ハイスループットDNAシーケンシングをDamID(DamID-seq)に統合するための詳細なプロトコールについて報告します。DamID-seqから生成される多数のショートリードにより、ゲノム全体のタンパク質-DNA相互作用を高精度かつ高感度に検出および局在化することができます。私たちは、DamID-seqアッセイを使用して哺乳類細胞のゲノム-核ラミナ(NL)相互作用を研究し、DamID-seqがゲノム-NL相互作用の検出に高い分解能と広いダイナミックレンジを提供することに気づきました。DamID-seqアプローチでは、遺伝子構造内のNL関連を精査し、ゲノム-NL相互作用マップをChIP-seqやRNA-seqなどの他の機能ゲノムデータと比較することができます。

ダム-V5-LMNB1融合タンパク質は、免疫蛍光染色による内因性ラミンBタンパク質（ 図1）と共局在することが確認されました。 アデニンメチル化DNA断片の成功PCR増幅はDamID-seqのための重要なステップです。無または明らかに少ない増幅（ 図2）をもたらすはずである（リガーゼなしに、またはPCRの鋳型なし、DpnIのなし）ネガティブコントロールしながら2キロバイト-実験サンプルは0.2の汚れを増幅しなければなりません。 NGSライブラリの所望の挿入サイズは200から300塩基対でありながら、メチル化DNA断片を、0.2から2 kbの範囲内にあります。したがって、適切なサイズ範囲にメチルPCR産物を断片化することが不可欠です。それにもかかわらず、それは同時に...

我々は、高スループットシーケンシング（DamID-SEQ）に、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）を結合することにより、本明細書のアッセイを説明します。この改良された方法は、より高い解像度、より広いダイナミックレンジを提供し、可能にする等のChIP-seqの、RNA-配列などの他のハイスループットシークエンシングデータと併せてDamID、配列データを分析します

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

このプロトコルの全体的な目標は、ハイスループットシーケンシングにより、動物細胞の目的のタンパク質に関連するゲノムDNA配列を検出することです。この手法は、哺乳類細胞における核組織化および転写または制御の研究における重要な疑問、例えば、核アミロイドまたは特定の転写因子に関連するゲノム領域の同定など、重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、DNAマイクロアレイを使用して、ハイスループットシーケンシングが元のDamIDアセットよりも高い分解能を提供することと、この技術により、当社のハイスループットシーケンシングデータとのクロス解析が可能になることです。手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるBrennan Olsonです。まず、テキストプロトコールに従って、目的の遺伝子をDamIDベクターにクローニングします。次に、レンチウイルス発現系を用いて、DamV5 POYおよびV5-Damを発現するレンチウイルスストックを作製します。DamIDベクターをレンチウイルスパッケージングプラスミドとコトランスフェクションし、メーカーのプロトコールに従って順方向トランスフェクション手順を行ってください。ゼロポイント4、5ミクロンPVDFフィルターを使用したろ過ステップを必ず含めてください。次に、細胞にレンチウイルスを感染させる準備をします。1日前に、接着細胞を6ウェルプレートに通します。抗生物質の使用を続けます。目標は、感染の翌日に50%の合流点を持つことです。翌日、冷凍したDamV5 POYとV5-Damレンチウイルスの上清を冷凍庫から取り出し、摂氏37度の水浴に入れて解凍します。培養プレート上で、増殖培地を取り出し、抗生物質を含まない半ミリリットルの新鮮な増殖培地と交換します。次に、ウェルに1ミリリットルの解凍したレンチウイルスをロードします。2つの井戸にV5-Damを、2つの井戸にDamV5 POYを、レンチウイルスを含まない2つの井戸をネガティブコントロールとしてロードします。細胞上で溶液を渦巻き、プレートをインキュベーターに戻します。24時間後、細胞上のウイルス懸濁液を抗生物質を含まない2ミリリットルの成長培地と交換します。その後、さらに48時間インキュベーションを続けます。2日後、テキストプロトコルに従ってこのプロセスを完了し、ゲノムDNAを分離します(これには約1時間かかります)。次に、ゲノムDNAからアデニンメチル化DNA断片を増幅します。このプロセスには約2〜3日かかり、詳細はテキストプロトコルでカバーされています。この手順では、まず増幅されたアデニンメチル化DNAを断片化します。DNAフラグメントーゼを使用する前に、まずその強度を測定して適切な消化時間を決定することが重要です。この診断テストには、利用可能な精製メチルPCR製品を使用してください。まず、6マイクログラムのDNA、12マイクロリットルの10X Fragmentaseバッファーからなるマスターミックスを調製し、114マイクロリットルまで水で満たします。次に、Fragmentaseストックを3秒間ボルテックスし、マスターミックスに6マイクロリットルを加えて合計120マイクロリットルにします。次に、マスターミックスを3秒間ボルテックスします。次に、5つの反応チューブに20マイクロリットルのマスターミックスを充填し、6つのチューブすべてを摂氏37度でインキュベートします。5分後にチューブを1本取り外し、5マイクロリットルのEDTAを追加して反応を停止します。これを10分ごとに行い、すべての反応チューブが集まるまで行います。次に、各チューブから12ポイント5マイクロリットル(これは約半分のマイクログラムのDNAに相当)と、アゴロースゲル上の同量の未消化DNAを分析します。ゲルから、塗抹標本の大部分を約ゼロポイント2キロベースまで消化するのに必要な最小時間を決定します。これを最大消化時間として使用します。次に、プレテストのように実際の断片化を設定し、5 分を含む6つの等間隔の時点で消化を停止し、最大時間を計算します。消化後、6つの消化物を引き出し、PCR精製キットまたは固相可逆固定化ビーズを使用して精製します。精製したDNAを約15マイクロリットルのEBバッファーで希釈します。次のステップは、断片化されたDNAの末端を修復し、アデニンオーバーハングを追加し、シーケンシングアダプターにリゲードを追加し、Y字型アダプターを二本鎖DNAに変換することです。これらの手順はすべてテキスト プロトコルで詳しく説明されており、完了までに 2 日以上かかることはありません。シーケンシングアダプターを断片化DNAにライゲーションし、Y字型アダプターを二本鎖DNAに変換した後、目的のサイズの断片を選択します。まず、TAEで2%のアゴロースゲルを調製し、予防策を講じて、臭化エチジウムを最終濃度500ナノグラム/ミリリットルまで添加します。すべてのサンプルと 2 つのはしごが空のレーンで囲まれるように、十分なレーンを作成します。次に、各DNA溶出液の10マイクロリットルに8マイクロリットルのローディング色素を加え、6倍のローディング色素と水を含む1 Kb Plusラダーを1対1対4の比率で調製します。次に、DNAラダー、DNA溶出液、および別のDNAラダーの順にゲルレーンをロードします。ロードしたら、ゲルを60分あたり120ボルトで泳動させます。その後、安全メガネとフェイスシールドを装着して、UVライトでジェルを短時間観察します。DNAラダーをチェックして、ゲルが十分に尽きて、3つのゲルスライスを300〜400塩基対で切除できるかどうかを確認します。次に、各レーンから300〜400のベースペアのバンドを切り取り、常にレーンごとに新しいブレードを使用します。各ゲルスライスを理想的には100マイクロリットル未満にするために、ゲルをできるだけ少なくし、それぞれを独自のマイクロフュージチューブに移します。次に、テキストプロトコルに従ってゲルスライスからDNAを抽出します。抽出したDNAからシーケンシングアダプター修飾フラグメントを濃縮する方法に関するテキストプロトコルに従い続けます。その後、精製されたDNAをバイオアナライザーで高品質に解析し、期待通りであればシーケンシングに提出します。レンチウイルスは、Dam-V5-lamin B1融合タンパク質を発現するように操作され、アミノ蛍光染色により内因性ラミンB1タンパク質と共局在していることが確認されました。このレンチウイルスとDam-V5融合タンパク質を発現するコントロールレンチウイルスは、どちらもマウスC2C12筋芽細胞に感染するために使用されました。DNAを収集し、記載されているようにアデニンメチル化フラグメントを増幅し、その後、配列決定しました。次に、1番染色体についてゲノムNL相互作用マップを構築しました。1 つのトラックは、log2 RPKM 比を示しています。もう一方のトラックは、薄層に関連付けられたドメインを黒で示しています。これらのエリアは、コントロール ダムよりもダム ラミン B1 との関連性が著しく高いエリアです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2週間以内に行うことができます。このビデオを見れば、DamIDと組み合わせたハイスループットシーケンシングにより、目的のタンパク質に関連するDNA配列を検出する方法について十分に理解できるはずです。エチジウムブロマイドとUVライトでの作業は非常に危険である可能性があるため、ゲルが冷えるのを待ってからエチジウムブロマイドを追加する、目の保護具とフェイスシールドを着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

damid-seq-genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-high

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異​​性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。...

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

ゲノム標的分子の直接の標的を同定することは、主要な課題です。 DNA結合分子はゲノムを従事する方法を理解するために、我々は、クロマチン（COSMIC）を単離するための小分子の架橋に依存する方法を開発しました。...

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

肯定的な酵母 2 ハイブリッド相互作用の可能性があります選択酵母集団のディープ シーケンスには、パートナーの相互作用の蛋白質についての情報の富が得られます。ここでは、特定のバイオインフォマティクス ツールとこのような画面からシーケンス...

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。...

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

ゲノムワイド染色体コンフォメーションキャプチャー法Micro-C-XLを使用して、ヌクレオソーム分解能で三次元ゲノム構成をマッピングするためのプロトコルがここに示されます。...

Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

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硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

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グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

学ぶDamID-seq法による動物細胞内のタンパク質関連ゲノムDNA配列の検出法。ハイスループットシークエンシングを用いて核構造と転写制御を研究し、他のシーケンスデータとの統合解析も可能です。

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

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